Transición de fase optogenética de TDP-43 en neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra

Kazuhide Asakawa; Hiroshi Handa; Koichi Kawakami

doi:10.3791/62932

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Artículo de método

Transición de fase optogenética de TDP-43 en neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra

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DOI:

10.3791/62932

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25 de febrero de 2022

Kazuhide Asakawa¹ , Hiroshi Handa¹ , Koichi Kawakami²^,³

¹Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, ²Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, ³Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo para inducir la transición de fase de la proteína 43 de unión al ADN TAR (TDP-43) por la luz en las neuronas motoras espinales utilizando el pez cebra como modelo.

Resumen

La agregación anormal de proteínas y la vulnerabilidad neuronal selectiva son dos características principales de las enfermedades neurodegenerativas. Las relaciones causales entre estas características pueden interrogarse mediante el control de la transición de fase de una proteína asociada a la enfermedad en un tipo de célula vulnerable, aunque este enfoque experimental ha sido limitado hasta ahora. Aquí, describimos un protocolo para inducir la transición de fase de la proteína de unión al ARN / ADN TDP-43 en las neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra para modelar la agregación citoplasmática de TDP-43 que ocurre en las neuronas motoras degeneradas en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Describimos un método genético basado en el cromosoma artificial bacteriano (BAC) para administrar una variante optogenética de TDP-43 selectivamente a las neuronas motoras espinales del pez cebra. La alta translucidez de las larvas de pez cebra permite la transición de fase del TDP-43 optogenético en las neuronas motoras espinales mediante una simple iluminación externa utilizando un diodo emisor de luz (LED) contra peces sin restricciones. También presentamos un flujo de trabajo básico de imágenes en vivo de las neuronas motoras espinales del pez cebra y análisis de imágenes con el software Fiji / ImageJ disponible gratuitamente para caracterizar las respuestas del TDP-43 optogenético a la iluminación de la luz. Este protocolo permite la caracterización de la transición de fase de TDP-43 y la formación de agregados en un entorno celular vulnerable a la ELA, lo que debería facilitar la investigación de sus consecuencias celulares y de comportamiento.

Introducción

Los gránulos de ribonucleoproteína (RNP) controlan una miríada de actividades celulares en el núcleo y el citoplasma mediante el ensamblaje de particiones sin membrana a través de la separación de fase líquido-líquido (LLPS), un fenómeno en el que un fluido homogéneo se demezcla en dos fases líquidas ^distintas1,2. El LLPS desregulado de las proteínas de unión al ARN que normalmente funcionan como componentes de gránulos RNP promueve la transición de fase anormal, lo que lleva a la agregación de proteínas. Este proceso se ha implicado en enfermedades del neurodesarrollo y neurodegenerativas3,4,5.