I denne undersøgelse præsenterer vi en effektiv og reproducerbar protokol til at isolere immunpopulationerne i murine åndedrætssystemet. Vi leverer også en metode til identifikation af alle medfødte og adaptive immunceller, der befinder sig i lungerne hos raske mus, ved hjælp af et 9-farvebaseret flowcytometripanel.
Luftvejene er i direkte kontakt med det ydre miljø og kræver et præcist reguleret immunsystem for at yde beskyttelse, samtidig med at uønskede reaktioner på miljøantigener undertrykkes. Lunger er vært for flere populationer af medfødte og adaptive immunceller, der giver immunovervågning, men også formidler beskyttende immunresponser. Disse celler, som holder det sunde lungeimmunsystem i balance, deltager også i flere patologiske tilstande som astma, infektioner, autoimmune sygdomme og kræft. Selektiv ekspression af overflade- og intracellulære proteiner giver unikke immunofænotypiske egenskaber til lungens immunceller. Følgelig har flowcytometri en instrumentel rolle i identifikationen af sådanne cellepopulationer under steady-state og patologiske tilstande. Dette papir præsenterer en protokol, der beskriver en konsekvent og reproducerbar metode til at identificere de immunceller, der befinder sig i lungerne hos raske mus under steady-state betingelser. Denne protokol kan dog også bruges til at identificere ændringer i disse cellepopulationer i forskellige sygdomsmodeller for at hjælpe med at identificere sygdomsspecifikke ændringer i lungeimmunlandskabet.
Murine luftvejene indeholder et unikt immunsystem, der er ansvarligt for at bekæmpe patogener og opretholde immunhomeostase. Lungeimmunsystemet består af cellulære populationer med signifikant heterogenitet i deres fænotype, funktion, oprindelse og placering. Residente alveolære makrofager (AMs), der hovedsagelig stammer fra føtale monocytter, befinder sig i det alveolære lumen1, mens knoglemarvsafledte interstitielle makrofager (IM’er) befinder sig i lungeparenchyma2. IM’er kan yderligere underklassificeres ved hjælp af udtrykket CD206. CD206+ IM’er befolker det peribronchiale og perivaskulære område, mens CD206– IM’er er placeret ved det alveolære interstitium3. Et par underklassifikationer af IM’er er blevet foreslået for nylig3,4,5,6. Selvom IM’er er mindre undersøgt end AMs, understøtter de seneste beviser deres afgørende rolle i reguleringen af immunsystemet i lungen7. Derudover udtrykkes CD206 også i alternativt aktiverede AMs8.
Pulmonale dendritiske celler (LLC’er) er en anden heterogen gruppe af lungeimmunceller med hensyn til deres funktionelle egenskaber, placering og oprindelse. Fire underkategorier af DC’er er blevet beskrevet i lungen: konventionelle CD103 + DC’er (også kendt som cDC1), konventionelle CD11b + DC’er (også kendt som cDC2), monocytafledte DC’er (MoDC’er) og plasmacytoid DC’er9,10,11,12,13. De første tre underklasser kan defineres som major histocompatibility complex (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plasmacytoid-DCs udtrykker MHC II og er mellemliggende positive for CD11c, men udtrykker høje niveauer af B220 og PDCA-19,13,16. I naive murinlunger er CD103DC’er og CD11bDC’er placeret i luftvejsinterstitiumet, mens plasmacytoid-LLC’er er placeret i det alveolære interstitium17.
To store populationer af monocytter befinder sig i lungen under steady state: klassiske monocytter og ikke-klassiske monocytter. Klassiske monocytter er Ly6C + og er kritiske for det indledende inflammatoriske respons. I modsætning hertil er ikke-klassiske monocytter Ly6C– og er blevet bredt betragtet som antiinflammatoriske celler3,16,18. For nylig blev en yderligere population af CD64 + CD16.2+ monocytter beskrevet, som stammer fra Ly6C-monocytter og giver anledning til CD206+ IMs3.
Eosinofiler forekommer hovedsageligt i lungerne under helminthinfektion eller allergiske tilstande. Der er dog et lille antal eosinofiler i lungeparenchymen under steady state, kendt som bosiddende eosinofiler. I modsætning til de bosiddende eosinofiler findes inflammatoriske eosinofiler i lungeinterstitium og bronchoalveolær skylning (BAL). I musemodeller af husstøvmide (HDM) rekrutteres inflammatoriske eosinofiler i lungen efter antigenmedieret stimulering. Det er blevet foreslået, at hjemmehørende eosinofiler kan have en regulerende rolle i allergi ved at hæmme T-hjælper 2 (Th2) sensibilisering over for HDM19.
I modsætning til resten af lunge myeloide celler udtrykker neutrofiler Ly6G, men ikke CD68 og er kendetegnet ved en signatur af CD68-Ly6G + immunophenotype16,20,21. Visualiseringsundersøgelser har vist, at lungen under steady state reserverer en pulje neutrofiler i det intravaskulære rum og er vært for et betydeligt antal ekstravaskulære neutrofiler22. I lighed med eosinofiler findes neutrofiler ikke i BAL ved steady state; Imidlertid driver flere former for immunstimulering, såsom LPS-udfordring, astma eller lungebetændelse, neutrofiler ind i det alveolære lumen, hvilket resulterer i deres tilstedeværelse i BAL21,22,23.
Et betydeligt antal CD45+-celler i lungen repræsenterer naturlige dræberceller (NK), T-celler og B-celler og er negative for de fleste myeloide markører24. I lungerne hos naive mus kan disse tre celletyper identificeres ud fra ekspressionen af CD11b og MHC II18. Omkring 25% af lunge-CD45+ cellerne er B-celler, mens procentdelen af NK-celler er højere i lungen end andre lymfoide og ikke-lymfoide væv24,25,26. Blandt lunge-T-celler er en betydelig brøkdel CD4-CD8– og spiller en vigtig rolle i luftvejsinfektioner26.
Fordi lungen er vært for et meget komplekst og unikt immunsystem, er der udviklet og rapporteret flere gating strategier til identifikation af lungeimmunceller16,18,20,27. Gating-strategien beskrevet heri giver en omfattende og reproducerbar måde at identificere op til 12 forskellige lunge myeloide og ikke-myeloide immunpopulationer ved hjælp af 9 markører. Yderligere markører er blevet brugt til at validere resultaterne. Desuden er der tilvejebragt en detaljeret metode til fremstilling af en enkeltcellesuspension, der minimerer celledød og muliggør identifikation af den mest komplette profil af lungens immuncellerum. Det skal bemærkes, at identifikationen af ikke-immune celler i lungen, såsom epitelceller (CD45-CD326 + CD31–), endotelceller (CD45-CD326-CD31+) og fibroblaster kræver en anden tilgang28,29. Identifikation af sådanne populationer er ikke inkluderet i protokollen og metoden beskrevet her.
Identifikation af lungeimmunceller kan være udfordrende på grund af de mange immuncelletyper, der bor i lungen og deres unikke immunophenotypiske egenskaber sammenlignet med deres modparter, der bor i andre væv. Under flere patologiske tilstande forekommer celler med forskellige fænotypiske træk i lungerne. For eksempel resulterer bleomycin-induceret lungeskade i rekruttering af cirkulerende monocytafledte makrofager i det alveolære rum, hvor de kan forblive i så længe som et år og endda fortsætte efter bleomyc…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01CA238263 og R01CA229784 (VAB).
10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
Centrifuge | |||
Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
Ethanol | |||
F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
Petri dish | Falcon | 351029 | |
Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |