小鼠肺组织中固有和适应性免疫细胞鉴定的流式细胞术分析

摘要

本研究中，我们提供了一种高效且可重复的小鼠呼吸系统免疫细胞群体分离方案。同时，我们还介绍了一种利用基于9色流式细胞术的检测 panel，对健康小鼠肺组织中所有固有免疫和适应性免疫细胞进行鉴定的方法。

摘要

呼吸道直接与外界环境接触，需要一个精确调控的免疫系统，在提供保护的同时抑制对环境抗原的不必要反应。肺组织中存在多种先天性和适应性免疫细胞群体，不仅执行免疫监视功能，还介导保护性免疫应答。这些细胞在维持健康肺部免疫系统平衡的同时，也参与多种病理过程，如哮喘、感染、自身免疫性疾病和癌症。表面及胞内蛋白的选择性表达赋予肺部免疫细胞独特的免疫表型特征。因此，流式细胞术在稳态及病理条件下鉴定这些细胞群体中发挥关键作用。本文介绍了一种稳定且可重复的技术方案，用于鉴定健康小鼠在稳态条件下肺组织中定居的免疫细胞。然而，该方案也可用于分析不同疾病模型中这些细胞群体的变化，从而有助于揭示肺部免疫微环境在特定疾病中的改变。

引言

小鼠呼吸道具有独特的免疫系统，负责抵御病原体并维持免疫稳态。肺部免疫系统由多种细胞群体组成，这些细胞在表型、功能、来源和定位方面均表现出显著异质性。定居的肺泡巨噬细胞（AMs）主要起源于胎儿单核细胞，位于肺泡腔内¹，而骨髓来源的间质巨噬细胞（IMs）则位于肺实质中²。IMs可根据CD206的表达进一步亚分类：CD206⁺ IMs分布于支气管周围和血管周围区域，而CD206^- IMs则定位于肺泡间质³。近年来已提出多种IMs的亚分类方案^3,4,5,6。尽管IMs的研究不如AMs深入，但最新证据表明其在调控肺部免疫系统中发挥关键作用⁷。此外，CD206也在替代活化的AMs中表达⁸。

肺树突状细胞（DCs）是另一类在功能特性、定位和来源上具有异质性的肺部免疫细胞。目前已在肺中描述了四种DC亚群：经典CD103⁺ DCs（也称为c....

方案

本方案中描述的所有研究和实验均根据贝斯以色列女执事医疗中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行。本方案的建立使用了6至10周龄的任一性别的C57BL/6小鼠。

1. 手术切除与组织制备

1. 通过腹腔注射 1 mL 三溴乙醇（按照标准方案配制；材料表）处死小鼠。
   注意：在肺部研究中应避免使用 CO₂ 窒息法，因其可能引起肺损伤，并改变肺免疫细胞的特征和性质。也应避免颈椎脱臼法，因其可能导致肺组织的机械性损伤。
2. 将小鼠转移至洁净且专用的手术区域。
3. 使用针头或胶带将小鼠四肢固定，使其背部朝下。用 70% 乙醇对腹部皮肤进行消毒。
4. 从颈部至腹部沿中线切开皮肤，小心剥离胸部区域的皮肤。
5. 小心移除胸骨和肋骨。
6. 使用 18–21 G 针头向右心室直接注入 10 mL 冷 PBS，灌注肺部，直至肺组织完全变白。
7. 在不接触肺组织的前提下，小心移除胸腺和心脏。
8. 轻柔地将肺组织从周围组织中分离，并转移至含有冷 BSA 缓冲液的离心管中（表 1）。
   注意：在进一步制备单细胞悬液前，应尽量去除肺组织周围的所有脂肪组织，以免对检测结果造成偏差。

2. 单....

结果

设门策略
我们设门策略的第一步是排除碎片和双联体（图1A）。仔细排除双联体对于避免假阳性细胞群至关重要（补充图S2）。随后，使用CD45⁺标记物鉴定免疫细胞，该标记物为造血细胞的特异性标志（图1B）。可加入活死染料以排除死亡细胞。然而，本方案中仅有不到<5%的CD45⁺细胞发生死亡（图1C），而更多的CD45^-细胞被识别为死亡细胞（补充图S3）。

为了鉴定单核细胞和中性粒细胞，与以往研究中针对每种细胞群体使用特异性抗体的方法不同^16,18，我们更倾向于使用抗GR-1抗体，该抗体可同时识别Ly6C⁺

讨论

由于肺部存在多种免疫细胞类型，且这些细胞的免疫表型特征与其他组织中的对应细胞有所不同，因此肺部免疫细胞的鉴定具有挑战性。在多种病理条件下，具有独特表型特征的细胞会出现在肺部。例如，博来霉素诱导的肺损伤会导致循环单核细胞来源的巨噬细胞被招募至肺泡腔，这些细胞可在其中存留长达一年之久，甚至在博来霉素诱导的纤维化消退后仍持续存在。与组织驻留型肺泡巨噬细胞（AMs）不同，循环单核细胞来源的巨噬细胞表现为Siglec F^lowCD11b⁺。特异性清除单核细胞来源的巨噬细胞可显著缓解博来霉素介导的肺纤维化^16,40。在流感病毒感染期间，具有类似特征的细胞也会被招募至肺部，并对链球菌性肺炎提供长期保护作用¹⁵。

根据CD11c和MHC II的表达情况，间质巨噬细胞（IM）可进一步分为IM1、IM2和IM3三个亚群。IM1的免疫表型定义为CD11c^-MHC II

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 注射器推杆	EXELINT	26265
18 G 针头	BD Precision Glide Needle	305165
21 G 针头	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL 锥形管	Falcon	3520
70 μm 细胞筛	ThermoFisher	22363548
96 孔板	Falcon/corning	3799
ACK 裂解缓冲液	ThermoFisher	A10492-01
抗小鼠 CD11b	Biolegend	101215	详情见表 2
抗小鼠 CD11c	Biolegend	117339 / 117337	详情见表 2
抗小鼠 CD45	Biolegend	103115	详情见表 2
抗小鼠 CD64	Biolegend	139319	详情见表 2
抗小鼠 CD68	Biolegend	137009	详情见表 2
抗小鼠 GR-1	Biolegend	108433	详情见表 2
抗小鼠 Siglec F	Biolegend	155503	详情见表 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	详情见表 2
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	详情见表 2
CD24	Biolegend	138503	详情见表 2
CD3	Biolegend	100205	详情见表 2
离心机
I 型胶原酶	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	详情见表 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
乙醇
F4/80	Biolegend	123133	详情见表 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	详情见表 2
胎牛血清	R&D Systems
精细锯齿镊	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装	ThermoFisher	00-5523-00
Futura 安全手术刀	Merit Medical Systems	SMS210
活/死可固定远红死细胞染色试剂盒	ThermoFisher	L34973	详情见表 2
MERTK	Biolegend	151505	详情见表 2
MHC-II	Biolegend	107621	详情见表 2
NK1.1	Biolegend	108705	详情见表 2
轨道摇床	VWR	Model 200
培养皿	Falcon	351029
台式冷藏离心机	SORVAL ST 16R
小型弯剪	Roboz Surgical Instrument Co