流式细胞术分析鉴定鼠肺先天免疫细胞和适应性免疫细胞

鼠呼吸道含有独特的免疫系统，负责对抗病原体和维持免疫稳态。肺免疫系统由在表型、功能、起源和位置方面具有显著异质性的细胞群体组成。常驻肺泡巨噬细胞 （AMs） 主要起源于胎儿单核细胞，位于肺泡腔¹，而骨髓来源的间质巨噬细胞 （IM） 位于肺实质²。IM可以通过CD206的表达式进一步细分。CD206⁺ IM位于支气管周围和血管周围区域，而CD206-IM位于肺泡间质³。最近提出了IM的几个子分类^3，4，^5，6。虽然IM的研究少于AM，但最近的证据表明它们在调节肺免疫系统中起着至关重要的作用⁷。此外，CD206还以替代激活的^AM8表示。

肺树突状细胞（DC）是肺免疫细胞的另一组异质性，就其功能特性，位置和起源而言。在肺中已经描述了四种DC亚类:常规CD103 ⁺ DC（也称为cDC1），常规CD11b ⁺ DC（也称为cDC2），单核细胞衍生的DC（MoDC）和浆细胞样^{DCs9，10，11，12，13}。前三个子类可以定义为主要的组织相容性复合物（MHC）II ⁺ CD11c ^{+ 9，10，14，15}。浆细胞样 DC 表达 MHC II，CD11c 中度阳性，但表达高水平的 B220 和 PDCA-19^，13，16。在幼稚的鼠肺中，CD103 DC和CD11b DC位于气道间质中，而浆细胞样DC位于肺泡间质¹⁷中。

单核细胞的两个主要群体在稳态下驻留在肺中:经典单核细胞和非经典单核细胞。经典的单核细胞是Ly6C⁺ ，对最初的炎症反应至关重要。相比之下，非经典单核细胞是Ly6C^- ，并被广泛视为抗炎细胞^3，16，18。最近，描述了另一个CD64 ⁺ CD16.2 ⁺ 单核细胞群体，其起源于Ly6C^- 单核细胞并产生CD206 ^{+ IMs3}。

嗜酸性粒细胞主要出现在蠕虫感染或过敏性疾病期间的肺部。然而，在稳定状态期间，肺实质中存在少量嗜酸性粒细胞，称为常驻嗜酸性粒细胞。与常驻嗜酸性粒细胞相反，炎症性嗜酸性粒细胞存在于肺间质和支气管肺泡灌洗 （BAL） 中。在家尘螨（HDM）小鼠模型中，炎症性嗜酸性粒细胞在抗原介导的刺激后被招募到肺部。有人提出，居民嗜酸性粒细胞可能通过抑制对^HDM19的T辅助剂2（Th2）致敏而在过敏中具有调节作用。

与其他肺髓细胞相反，中性粒细胞表达Ly6G但不表达CD68，其特征在于CD68-Ly6G ⁺免疫表亲型^{的特征16，20，21}。可视化研究表明，在稳态期间，肺在血管内隔室中保留了一池嗜中性粒细胞，并容纳了相当数量的血管外嗜中性粒细胞²²。与嗜酸性粒细胞类似，在稳定状态下的BAL中找不到嗜中性粒细胞;然而，几种形式的免疫刺激，如LPS激发，哮喘或肺炎，驱动嗜中性粒细胞进入肺泡腔，导致它们存在于^{BAL21，22，23}中。

大量肺 CD45⁺ 细胞代表自然杀伤 （NK）、T 细胞和 B 细胞，大多数骨髓标志物均为阴性²⁴。在幼稚小鼠的肺部，可以根据CD11b和MHC ^II18的表达来鉴定这三种细胞类型。大约25%的肺CD45 ⁺细胞是B细胞，而NK细胞在肺部的百分比高于其他淋巴和非淋巴组织^24，25，26。在肺T细胞中，相当一部分是^CD4-CD8-，在呼吸道感染中起重要作用²⁶。

由于肺宿主非常复杂和独特的免疫系统，因此已经开发出几种用于识别肺免疫细胞的门控策略^{并报告了16，18，20，27}。本文描述的门控策略提供了一种全面且可重复的方法，使用9种标志物鉴定多达12种不同的肺髓系和非髓系免疫群体。已使用其他标记来验证结果。此外，还提供了一种详细的方法来制备单细胞悬浮液，该单细胞悬浮液可最大限度地减少细胞死亡，并允许鉴定肺免疫细胞区室的最完整特征。应该注意的是，肺非免疫细胞的鉴定，如上皮细胞（CD45-CD326 ⁺ CD31^-），内皮细胞（CD45-CD326-CD31 ⁺）和成纤维细胞需要不同的方法^28，29。此处描述的协议和方法不包括此类人群的识别。

该协议中描述的所有研究和实验都是根据Beth Israel Deaconess医疗中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行的。使用六到十周龄的C57BL / 6小鼠，无论男女，都用于开发该协议。

1. 手术切除和组织准备

1. 通过腹腔内注射1mL三溴乙醇（根据标准方案制备; 材料表）。
   注意:在肺部研究中应避免_CO2 窒息，因为它可能导致肺损伤并改变肺免疫细胞的特征和性质。还应避免颈椎脱位，因为它可能导致肺部机械损伤。
2. 将鼠标转移到干净且专用的区域进行外科手术。
3. 通过在四肢上使用针头或胶带来稳定小鼠背侧向下。使用70%乙醇消毒腹侧区域的皮肤。
4. 在皮肤上进行切口，从颈部到腹部。小心地从胸部区域取出皮肤。
5. 小心地取下胸骨和肋骨。
6. 使用18-21 G针头直接在右心室中注射10 mL冷PBS来冲洗肺部，直到肺部完全变白。
7. 小心地取出胸腺和心脏，不要触摸肺部。
8. 轻轻地将肺从周围组织中分离出来，并将其转移到具有冷BSA缓冲液的管中（表1）。
   注意:在进一步准备单细胞悬浮液之前，应努力从肺部去除所有相邻脂肪，因为这可能会使读数偏倚。

2. 单细胞悬浮液的制备

1. 将肺转移到空的培养皿中，并用两把细手术刀切碎。将切碎的肺的所有部分转移到新的50 mL锥形管中。使用5mL消化缓冲液洗涤板并将其加入含有切碎肺的50mL管中（表1）。
   注意:消解缓冲液应在使用前立即制备。使用5毫克/毫升胶原酶²⁸。将1或5mg胶原酶与BSA缓冲液或无蛋白PBS组合没有改善结果（补充图S1）。
2. 盖上管盖，在37°C下以150rpm的速度在轨道振荡器上消化肺30分钟。 通过加入10mL冷BSA缓冲液停止反应。
3. 消化后，使用18 G针头混合并溶解肺块。将 70 μm 过滤器放在新的 50 mL 锥形管的顶部。
   注意:使用较小的微米过滤器可能会导致主要骨髓种群的损失。
4. 将消化后的肺混合物缓慢直接转移到过滤器上。使用 10 mL 注射器柱塞的橡胶侧粉碎过滤器上剩余的肺片。用BSA缓冲液在过滤器上清洗处理过的材料。
5. 在4°C下以350× g 离心单细胞悬浮液8分钟。
6. 小心地丢弃上清液并将细胞重悬于1mL的ACK裂解缓冲液中。使用1 mL移液器充分混合，并在室温下孵育90秒。
7. 加入10mL冷BSA缓冲液以停止反应，并在4°C下以350× g 离心7分钟.小心地丢弃上清液并将沉淀重悬于染色缓冲液中以使用血细胞计数器计数细胞。
8. 以5×¹⁰⁶ 个细胞/mL的浓度重悬细胞，并用于表面染色（见第3节）。
   注意:为此目的，将细胞接种在96孔圆底板中，然后进行抗体染色和洗涤。如果没有板式离心机，请使用流动管代替板。使用该协议，可以从平均大小的6-10周龄C57BL / ⁶ 小鼠中获得每个肺约15-20×106个细胞。

3. 表面抗体染色

1. 在⁹⁶ 孔板中每孔200μL中转移1×106个细胞。在4°C下以350× g 离心板7分钟。 同时，通过在染色缓冲液中稀释抗16/32抗体（1:100）来制备Fc-block溶液（表1）。
2. 将细胞重悬于50μL预制备的Fc封闭溶液（材料表）中，并在4°C或冰上孵育15-20分钟。
3. 加入150μL染色缓冲液，并在4°C下以350× g 离心板5分钟。 同时，通过稀释表面抗体（1:100; 表 2）在染色缓冲液中。
   注:（i）用于Fc阻断的抗16/32抗体可与表面抗体在同一混合物中使用。（ii）如果使用可固定的活性染料，则以1:1，000的稀释度将其添加到表面抗体混合物中。
4. 将细胞重悬于50μL预制备的表面抗体混合物中，并在黑暗中在4°C下孵育30-40分钟。用染色缓冲液洗涤细胞两次。
   注意:如果不需要细胞内染色，请将细胞重悬于200μL染色缓冲液中，然后直接在流式细胞仪上采集数据。或者，可以将细胞固定并储存在4°C以供以后采集。我们建议在24小时内使用细胞进行流式细胞术。

4. 细胞固定和细胞内染色

1. 通过混合FoxP3 /转录因子染色缓冲液组的三份固定/透化浓缩物和1份固定/透化稀释剂来准备固定/透化缓冲液（固定/烫发缓冲液）（表1）。
2. 将细胞重悬于96孔板每孔50μL预制备的Fix / Perm缓冲液中，其中细胞按第3节所述接种，并在黑暗中在4°C下孵育20-25分钟。
3. 在纯化的去离子水中以1:10稀释10倍的透化缓冲液，制备1倍的透化缓冲液。
4. 用1x透化缓冲液洗涤细胞一次。同时，通过将细胞内抗体（1:100）稀释在1mL通透缓冲液中来制备细胞内抗体混合物。
5. 使用96孔板的每个细胞使用50μL预制备的表面抗体混合物重悬细胞，并在黑暗中在4°C下孵育40分钟。
6. 用透化缓冲液洗涤细胞一次，用染色缓冲液洗涤一次。最终洗涤后，将细胞重悬于200μL染色缓冲液中。
   注意:如果没有带读板仪的流式细胞仪可用，请将细胞转移到流式细胞术管中。
7. 在流式细胞仪上采集每个样品至少1.5×¹⁰⁶ 个细胞。
   注意:对于单色和未染色的对照样品，每个样品0.5-1×¹⁰⁶ 个细胞就足够了。建议滴定用于实现最佳染色和降低成本的单个抗体。本实验方案已使用FoxP3染色缓冲液组制备的Fix/Perm缓冲液进行了优化。由于CD68是细胞质而不是核标志物，因此其他透化解决方案（例如来自不同供应商的低浓度多聚甲醛或细胞固定/细胞蛋白试剂盒）可能就足够了。

门控策略
我们的门控策略的第一步是排除碎屑和双层（图1A）。仔细排除双联对于避免假阳性人群至关重要（补充图S2）。然后，使用CD45 +鉴定免疫细胞，CD45 +是造血细胞的标志物（图1B）。可以添加活死染色剂以排除死细胞。然而，该协议导致<5%的CD45 + 细胞死亡（图1C），而更多的CD45- 细胞被鉴定为死亡（补充图S3）。

为了鉴定单核细胞和嗜中性粒细胞，与之前对这些群体使用特异性抗体的研究相比16，18，我们更喜欢使用抗GR-1抗体来鉴定Ly6C +和Ly6G +细胞。使用抗GR-1抗体和抗CD68可以将肺免疫细胞分离成三个簇:CD68-GR-1 +，CD68 +（可进一步鉴定为GR-1 +或GR-1-）和CD68-GR-1-/int（图1D）。CD68是一种主要在细胞内检测到的标志物。探测表面CD68，但在没有固定/透化的情况下无法检测到（补充图S4）。

多形核细胞（嗜中性粒细胞）被鉴定为CD45 + CD68-GR-1 + CD11b +（图1E）。这些结果使用GR1与Ly6G特异性抗体（图2）进行验证，Ly6G是多形核中性粒细胞的独特标志物16，18，27。在CD45 + CD68-GR-1-/int群体中，大约10-20%是MHCII-和CD11blow，代表NK细胞（图1F）。NK1.1是NK细胞的独特标记，用于证实这一点（图3）25，30。CD45 + CD68-GR1-/intCD11b-群体由MHCII-T细胞和MHCII + B细胞组成（图1F）。另外两种抗体分别用于验证T细胞和B细胞-CD3和B220（图3）。

在稳态条件下的健康小鼠中，BAL中检测到的大多数CD45 + 细胞是AM，即气道的主要居民。因此，进行BAL以评估表征AMS20，31的标志物。这些细胞是CD45 + CD68 + Siglec-F + CD11c + ，但与其他骨髓细胞不同，不表达高水平的CD11b（图4）。免疫标志物的相同组合也可识别总肺均质中的AM（图1G，H）。除AM外，在CD45 + CD68 + Sigle-F + 门（图1G）中，有一个明显的细胞群对CD11b呈阳性，但对CD11c无效。该CD45 + CD68 + Siglec-F + CD11b + CD11c- 白细胞群代表嗜酸性粒细胞（图1G）19，32。

在具有CD45 + CD68 + SiglecF-细胞的门中（图1G），有一个代表肺DC的CD11c + MHC +群体（图1I）。一些研究者将肺积液鉴定为CD11c + MHCII + CD24 + 16，18。评估CD24表达以确认该人群的身份（图5A）。大多数肺DC是CD103 + CD11b-或CD103-CD11b +（图1J）。CD103 + CD11b-DC代表CD103 +常规DC，并被识别为CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103 + CD11b-。相比之下，CD103-CD11b+ DC根据CD64表达分为常规DC和MoDC（图1K）。因此，常规CD11b + DC被鉴定为CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103-CD11b + CD64- 而MoDC被鉴定为CD45 + CD68 + SiglecF-MHCII + CH11c + CD103-CD11b + CD64 +.与传统DC相比，MoDC对DC标记CD24呈低阳性，对泛巨噬细胞标记物呈阳性，包括F4 / 80，CD64和MERTK（图5A）9，10，11，13，33，34。

IM以及经典和非经典单核细胞位于CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-/ intCD11b +门中（图1L），并根据CD64和GR-1表达进行区分（图1M）。CD64是一种泛巨噬细胞标志物，主要由IM和AM以及DC的一个亚群表达，经典单核细胞也称为Ly6C +单核细胞，非经典单核细胞称为Ly6C-单核细胞。单核细胞和IM对Ly6G都是阴性的;然而，经典单核细胞表达Ly6C，因此对GR-1呈阳性。相反，间质巨噬细胞和非经典单核细胞对GR-1和Ly6C3，4，11，16，18，20，35，36均为阴性。此外，非经典单核细胞是CD11cint，而经典单核细胞是CD11c-。虽然CD11c表达的这种差异对于在基线时区分两种类型的单核细胞通常无关紧要，但当经典单核细胞积聚时，它可能对病理状况至关重要。基于上述，间质巨噬细胞定义为CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-/intCD11b + GR-1-CD64 +，经典单核细胞为CD45 + CD68 + Siglec-F-CD11c-CD11b + GR-1 + CD64-，非经典单核细胞为CD45 + CD68 + CD11c-/ intCD11b + GR-1-CD64-.AMs和IM对所有巨噬细胞标志物均呈阳性，包括CD68，CD64，F4 / 80和MERTK原癌基因。然而，与IM不同，AM是CX3CR1-，与IM相反，这可以通过两种类型的肺巨噬细胞的起源差异来解释4，37，38，39（图5B）。

图1:鼠肺中存在的免疫细胞的门控策略。在小心排除碎片，二重细胞，死细胞和非免疫细胞（CD45-）（A-C）后，根据CD68和GR-1（D）的表达将CD45 +细胞分离成3个主要簇。中性粒细胞属于CD68-GR-1+群体（E），而CD68-GR-1-/int群体由NK细胞，B细胞和T细胞（F）组成。CD68 +细胞可以进一步分为Siglec F +细胞（G），它们是AM和嗜酸性粒细胞（H），以及Siglec F-细胞（G），它由单核细胞，IM和DC（I-M）组成。缩写:SSC-A = 侧散射光的峰值面积;FSC-A = 正向散射光的峰值面积;SSC-H = 侧散射光的峰值高度;L/ D = 活/死染色;MHC =主要组织相容性复合物;SF = Siglec F;GR-1 = GPI连接的骨髓分化标志物（Ly-6G）;NK = 自然杀手;IMs =间质巨噬细胞;DC = 树突状细胞;AMs = 肺泡巨噬细胞。请点击此处查看此图的放大版本。

图2:肺中的Ly6G仅由被鉴定为多形核中性粒细胞的CD45 + CD68-GR-1 + CD11b +细胞表达。请单击此处查看此图的放大版本。

图3:通过门控策略验证NK细胞，T细胞和B细胞的鉴定。 使用NK 1.1，CD3和B220特异性标记分别验证NK细胞，T细胞和B细胞的鉴定。应该注意的是，如果存在NKT细胞，则可能落在NK细胞门内的CD3 + 细胞群中，并且需要谨慎避免NK被NKT细胞污染。缩写:NK = 自然杀手;MHC = 主要组织相容性复合物。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4:幼稚小鼠中通过支气管肺泡灌洗获得的大多数免疫细胞是肺泡巨噬细胞。 缩写: AMs = 肺泡巨噬细胞;DC = 树突状细胞;IM = 间质巨噬细胞;SSC-A = 侧散射光的峰值面积;FSC-A = 正向散射光的峰值面积;SSC-H = 侧散射光的峰值高度;SF = Siglec F;GR-1 = GPI 连接的骨髓分化标志物 （Ly-6G）。 请点击此处查看此图的放大版本。

图5:免疫细胞中不同标志物表达的比较。 （A）肺DC中CD24，CD64，MERTK，F4 / 80和CD103表达的比较。（B）CD68，CD64，MERTK，F4 / 80，CD11c，Siglec F（SF），CD11b和CX3CR1在肺巨噬细胞和单核细胞中的比较。缩写:DC = 树突状细胞;MoDC = 单核细胞衍生的 DC;AMs = 肺泡巨噬细胞;IMs =间质巨噬细胞;SF = Siglec F;MERTK = 髓样上皮 - 生殖酪氨酸激酶。 请点击此处查看此图的放大版本。

表 1: 缓冲区。

表 2: 使用单克隆抗体。

补充图S1:通过预热PBS + 0.5%BSA中的5mg / mL胶原酶1实现最佳细胞解离。 在所有不同的条件下，还包括0.2毫克的DNA酶I。缩写: BSA = 牛血清白蛋白;FSC-A = 正向散射光的峰值面积;L/ D = 活/死染色;SF = Siglec F. 请单击此处下载此文件。

补充图S2:包含二倍体可能会导致假阳性人群。 缩写:FP = 误报。 请点击此处下载此文件。

补充图S3:与CD45+相比，更多的CD45+具有与死细胞一致的特征。请单击此处下载此文件。

补充图S4:CD68的表面染色不足以正确区分肺的单个免疫细胞群。请点击此处下载此文件。

V.A.B.拥有由百时美施贵宝，罗氏，默克，EMD-Serono，勃林格殷格翰，阿斯利康，诺华和达科授权的PD-1途径专利。作者声明没有其他相互竞争的经济利益。