Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Immunopeptidomics: Isolering af mus og human mHC klasse I- og II-associerede peptider til massespektrometri analyse

Published: October 15, 2021 doi: 10.3791/63052
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1CHU Sainte-Justine Research Center, 2Department of Pathology and Cellular Biology, Faculty of Medicine, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en protokol til rensning af MHC klasse I og klasse II peptid komplekser fra mus og menneskelige cellelinjer giver høj kvalitet immunopeptidomics data. Protokollen fokuserer på prøveforberedelse ved hjælp af kommercielt tilgængelige antistoffer.

Abstract

Immunopeptidomics er et spirende felt, der brændstoffer og styrer udviklingen af vacciner og immunterapier. Mere specifikt refererer det til videnskaben om at undersøge sammensætningen af peptider præsenteret af store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og klasse II molekyler ved hjælp af massespektrometri (MS) teknologiplatforme. Blandt alle trin i en MS-baseret immunopeptidomics workflow, prøve forberedelse er kritisk vigtigt for at indfange data af høj kvalitet af terapeutisk relevans. Her beskrives trinvise instruktioner for at isolere MHC-klasse I og II-associerede peptider ved immunaffinitetsrensning fra kvalitetskontrolprøver, fra mus (EL4 og A20) og menneskelige (JY) cellelinjer mere specifikt. De forskellige reagenser og specifikke antistoffer er grundigt beskrevet for at isolere MHC-associerede peptider fra disse cellelinjer, herunder trinene til at kontrollere antistoffets perlerbindende effektivitet og elutionseffektiviteten af MHC-peptidkomplekserne fra perlerne. Protokollen kan bruges til at etablere og standardisere en immunopeptidomics workflow, samt at benchmarke nye protokoller. Desuden udgør protokollen et godt udgangspunkt for alle ikke-eksperter ud over at fremme reproducerbarheden af prøvepræparationen i immunopeptidomics inden for og mellem laboratorier.

Introduction

I løbet af det sidste årti har interessen for at undersøge repertoiret af MHC-associerede peptider overskredet den akademiske sektor og nået biotek- og medicinalindustrien. Faktisk, i kræft, opdagelsen af handlingsrettede tumor-specifikke neoantigener repræsenterer en stor forskning fokus i den industrielle sektor til at udvikle kliniske immunterapier, der fører til personlig onkologi1,2,3. Grundlæggende, MHC-associerede peptider præsenteres i hele kroppen, afspejler den intracellulære fase af cellen, og er betydelige i forskellige sygdomstilstande såsom autoimmunitet, transplantation, smitsomme sygdomme, betændelse, kræft, og allergier1,4. Således MHC-associerede peptider, eller human leukocyt antigen (HLA) ligands hos mennesker, er af stor medicinsk interesse og er kollektivt benævnt immunopeptidome5.

MS er en kraftfuld analytisk tilgang til at karakterisere immunopeptidome6,7, herunder opdagelsen af tumor-specifikke neoantigener8,9,10,11. En typisk arbejdsgang til at udføre et immunopeptidomics eksperiment omfatter tre hovedtrin: 1) prøveforberedelse til isolering af MHC-associerede peptider, 2) dataindsamling af MS og 3) dataanalyse ved hjælp af forskellige beregningsmæssige softwareværktøjer12. Generering af prøver af høj kvalitet, der er beskrevet i denne visualiserede protokol, er afgørende for succesen af ethvert projekt i MS-baserede immunopeptidomics. Protokollen beskrevet nedenfor fokuserer på at isolere MHC klasse I- og II-associerede peptider fra veletablerede cellelinjer, der er egnede til at generere immunpeptidomics data af høj kvalitet. Repræsentative resultater fra disse cellelinjer vises i den aktuelle protokol.

Protocol

Protokollen her blev tilpasset fra etablerede protokoller13,14,15,16,17,18,19,20. Den samlede procedure for immunaffinitetsrensning (IP) af MHC-klasse I- og II-peptider er illustreret i figur 1. Se Materialetabel for at få flere oplysninger om de anvendte cellelinjer og antistoffer.

1. Perler kobling med antistoffer (dag 1): Kobling antistoffer til sepharose CNBr-aktiverede perler

BEMÆRK: Forbered nye løsninger til hvert nyt eksperiment. Se tabel over materialer og supplerende tabel 1 for listen over reagenser og løsninger opskrifter. Alle trin udføres ved stuetemperatur (RT). Når du bruger et nyt antistof, skal du kontrollere bindingseffektiviteten ved at indsamle vigtige aliquots (se indikationen VALGFRI) og udføre Coomassie blå farvning SDS-PAGE (Figur 2).

  1. Aktivering af sepharose CNBr perler
    1. Veje 80 mg sepharose CNBr-aktiverede perler pr. prøve og overfør dem til et 15 mL konisk rør.
    2. For at lette resuspension af tørrede perler, først, tilsæt 5 mL af 1 mM HCl og pipette op og ned 5 gange. Fyld derefter det koniske rør med yderligere 8,5 mL 1 mM HCl.
    3. Roter ved 20 omdrejninger (omdrejninger i minuttet) i 30 min på RT ved hjælp af en rotatorenhed. Centrifuge perlerne ved 200 x g i 2 min på RT og fjerne supernatant ved aspiration.
    4. Der tilsættes 500 μL koblingsbuffer til perlerne pellet og overføres til en ny 2,0 mL centrifuge rør og holde til side for trin 1.2.2.
  2. Kobling af antistoffer til CNBr-aktiverede perler
    1. Det antistof, der er valgt til isolering af MHC-klasse I- eller II-peptider, forberedes i et nyt 2,0 mL mikrocentrifugerør ved at tilsætte 2 mg antistoffet (i henhold til den koncentration, der er angivet af fabrikanten). Fuldfør volumenet til 1 mL med koblingsbufferopløsningen for at få en endelig koncentration på 2 mg/mL.
    2. Centrifugere perlerne fra trin 1.1.4 ved 200 x g i 2 min på RT og derefter fjerne supernatant ved aspiration.
    3. Antistofopløsningen til 2,0 mL mikrocentrifugerøret, der indeholder de aktiverede perler.
    4. (VALGFRIT) Tag en aliquot på 18 μL (INPUT), tilsæt 6 μL 4x SDS-PAGE buffer, og frys straks.
    5. Mikrocentrifugerøret roteres fra trin 1.2.3 ved 20 omdrejninger i 120 min ved hjælp af en rotatoranordning. Centrifuge perlerne på 200 x g i 2 min og derefter fjerne supernatant.
    6. (VALGFRIT) Tag en aliquot på 18 μL af supernatanten (ubundet antistof), tilsæt 6 μL 4x SDS-PAGE buffer og frys straks.
  3. Blokering og vask af antistof koblede perler
    1. Der tilsættes 1 mL af 0,2 M glycin til mikrocentrifugerøret, der indeholder de antistofkoblede perler fra trin 1.2.5. Roter ved 20 omdr./min. i 60 min på RT ved hjælp af en rotatorenhed.
    2. Centrifuge perlerne på 200 x g i 2 min, derefter fjerne supernatant. Tilsæt 1 mL PBS (Fosfat-buffered saltvand).
    3. Centrifuge perlerne på 200 x g i 2 min, derefter fjerne supernatant.
    4. (VALGFRIT) Tag en aliquot på 18 μL af supernatanten (ubundet antistof, sidste vask), tilsæt 6 μL 4x SDS-PAGE buffer og frys straks.
    5. Der tilsættes 1 mL PBS til perlerne i trin 1.3.3.
    6. (VALGFRIT) Tag en aliquot af 18 μL af perler blanding (perler kombineret med antistof), tilsæt 6 μL af 4x SDS-PAGE buffer, og fryse straks.
    7. Hold ved 4 °C, indtil den anvendes samme dag i trin 2.5.
      BEMÆRK: Perler kan tilberedes dagen før immunkapitalen, men længere opbevaring er ikke blevet testet.

2. Celle lysis og immunocapture med antistof koblede perler (Dag 1)

BEMÆRK: Niveauet af MHC-molekyler varierer fra celletype til celletype, og kvantificeringen af MHC/HLA-molekyler pr. celle foreslås21 (figur 4A). Vi anbefaler mindst 1 x 108 celler for hver IP. Dette antal celler svarer til 6-10 mg protein fra JY, EL4 og A20 celler opløses med 0,5% Chaps buffer. For at forberede cellepiller til IPs skal celler høstes, centrifugeres og vaskes to gange med 5 mL PBS. Derefter kan cellepiller opbevares i et 1,5 mL mikrocentrifugerør eller et 15 mL konisk rør ved -80 °C indtil tidspunktet for UNDERSØGELSESPERIODEN. Bemærk, at IPs kan udføres på frisk høstet eller frosne celle pellets.

  1. For at isolere MHC klasse I eller II peptider, optø en frossen pellet på 1 x 108 celler ved at opvarme bunden af røret med håndfladen. Der tilsættes 500 μL PBS til pellet og pipette op og ned, indtil suspensionen er homogen.
    BEMÆRK: Afhængigt af celletypen kan cellepillevolumen variere betydeligt. Hvis 500 μL PBS ikke er nok til at opløse cellepillen, skal du bruge mere PBS, indtil cellerne let opdeles, mens de pipetter op og ned.
  2. Mål den samlede volumen af pelleten, der er suspenderet igen i PBS, og overfør til et nyt rør 2 mL mikrocentrifugerør. Opdelt i flere rør, hvis det er nødvendigt.
  3. Tilføj en mængde celle lysis buffer (1% chaps buffer i PBS indeholdende protease hæmmere, 1 pellet/10 mL buffer) svarende til mængden af celle pellet re suspenderet i PBS målt i det foregående trin. Den endelige koncentration af lysis buffer er 0,5% Chaps.
  4. Rotere ved 10 omdr./min i 60 min ved 4 °C ved hjælp af en rotatoranordning. Centrifuge cellen lyser ved 18.000 x g i 20 min ved 4 °C med fuld bremse og overfør supernatanten (indeholdende MHC-peptidkomplekserne) i et nyt 2,0 mL mikrocentrifugerør.
  5. Genvind de antistof-koblede perler fra trin 1.3.7 ved centrifugering ved 200 x g i 2 min og fjern supernatanten.
  6. Cellelysende supernatanten overføres i trin 2.4 til de antistofkoblede perler, og inkuberes med rotation (10 omdr./ t) i 14-18 timer (natten over) ved 4 °C ved hjælp af en rotatoranordning.

3. Elution af MHC peptider (dag 2)

BEMÆRK: Polypropylen kolonne tillader elution af MHC-peptid komplekser samtidig bevare perlerne i kolonnen. For at vurdere andelen af MHC-peptider komplekser afgrænset til perlerne før og efter sur elution med 1% TFA (trifluoracetic syre), er det muligt at udføre en vestlig blot med aliquots taget på centrale trin i løbet af protokollen (se indikation valgfri). Vestlig blotting vist i figur 3 afslører berigelse af MHC-peptid komplekser efter sur elution med 1% TFA. Fraværet af signal i denne brøk ville indikere, at elutionstrinnet ikke lykkedes. Bemærk, at andelen af ubundne MHC-peptider komplekser til perlerne kan også evalueres parallelt ved vestlige blotting ved hjælp af en aliquot beskrevet i trin 3.1.6.

  1. Elution af MHC-peptid komplekser fra antistof koblede perler
    1. Fjern polypropylens nederste låg, placer kolonnen på polypropylens kolonnestativet, og installer en tom beholder nedenunder for at samle strømmen igennem.
      BEMÆRK: Der kræves én kolonne pr. prøve.
    2. Skyl polypropylensøjlen med 10 mL buffer A og lad den løbe af tyngdekraften. Hvis strømningshastigheden for flydende elution er for langsom, skæres den nederste spids af polypropylenkolonnen yderligere.
    3. Mål og opsamle den perler-lysat blanding (~ 2 mL) fra trin 2,5 og overføre den til polypropylen kolonne.
    4. (VALGFRIT) Tag en aliquot på 20 μL (eller 1/100 ud af det samlede volumen) for vestlige blotting og fryse straks. Denne fraktion svarer til de samlede MHC-peptider komplekser inkuberet med perlerne.
    5. Lad den flydende blanding slippe af tyngdekraften.
    6. (VALGFRIT) Saml og mål gennemstrømningen og tag en aliquot på 20 μL (eller 1/100 ud af det samlede volumen) for vestlig blotting og fryse straks. Denne fraktion repræsenterer de resterende ubundne MHC-peptider komplekser.
    7. For at genvinde den perler-lysatblanding så meget som muligt skal røret skylles fra trin 3.1.3 med 1 mL buffer A og overføre det til polypropylenkolonnen.
    8. Vask perlerne i polypropylensøjlen ved at tilsætte 10 mL buffer A. Lad vaskebufferen slippe af tyngdekraften.
    9. Gentag vasketrinnet med 10 mL buffer B, 10 mL buffer A og derefter 10 mL buffer C.
    10. Fjern polypropylensøjlen fra stativet, og læg den oven på et nyt 2,0 mL mikrocentrifugerør. Hold søjlen og røret sammen med hånden.
    11. Tilsæt 300 μL på 1% TFA til polypropylensøjlen og bland perlerne ved at pipetter op og ned 5 gange.
      BEMÆRK: Perlerne vil blive bevaret i polypropylen kolonne, og MHC-bundne peptider vil elute i 2,0 mL mikrocentrifuge rør.
    12. Eluatet overføres i et nyt 2,0 mL mikrocentrifugerør. Gentag trin 3.1.11 og pulje de 2 eluater (eluaterne, der indeholder MHC-peptidkomplekserne, skal svare til i alt 600 μL og vil blive anvendt i trin 3.2.4).
    13. (VALGFRIT) Der opsamles en aliquot på 6 μL (eller 1/100 af det samlede volumen) til vestlig blotting og fryses straks. Denne fraktion svarer til MHC-peptider komplekser eluted fra perlerne.
  2. Afsaltning og udløsning af MHC peptider
    BEMÆRK: Afsaltning og udløsning af MHC peptider trin kunne gøres ved at installere C18 kolonne på en 2,0 mL mikrocentrifuge rør. For at få en bedre pasform skal du installere de udglød, som producenten stiller til rådighed mellem C18-kolonnen og 2,0 mL mikrocentrifugerøret. I denne protokol anvendes en C18-kolonne med en volumenkapacitet på 5-200 μL (6-60 μg). Alle trin udføres på RT.
    1. Tilsæt 200 μL methanol oven på C18 kolonnen, derefter centrifuge ved 1546 x g i 3 min. Kassér gennemstrømningen.
    2. Tilsæt 200 μL på 80%ACN (acetonitril)/0,1% TFA oven på C18 kolonnen, derefter centrifuge ved 1546 x g i 3 min. Kassér gennemstrømningen.
    3. Tilsæt 200 μL på 0,1% TFA oven på C18 kolonnen, derefter centrifuge ved 1546 x g i 3 min. Kassér gennemstrømningen.
    4. Der indlæsses 200 μL af MHC-peptidkomplekserne fra trin 3.1.12 oven på C18-kolonnen. Centrifuge ved 1546 x g i 3 min og kassér strømmen igennem.
    5. Gentag trin 3.2.4 to gange, indtil hele diskenheden er indlæst. Bemærk, at MHC peptider bevares i C18 kolonnen.
    6. Der tilsættes 200 μL på 0,1% TFA til C18 kolonnen, og centrifuge ved 1546 x g i 3 min. Kassér gennemstrømningen.
    7. C18-kolonnen overføres til et nyt 2,0 mL mikrocentrifugerør. Elute MHC peptider fra C18 kolonnen ved at tilføje 150 μL af 28%ACN/0,1%TFA.
    8. Centrifuge ved 1546 x g i 3 min.
    9. Overfør gennemstrømningen i et nyt 1,5 mL mikrocentrifugerør. Pas på ikke at kassere gennemstrømningen; den indeholder de isolerede MHC-klasse I- eller II-peptider.
    10. Gentag trin 3.2.7-3.2.9 to gange for et samlet volumen på 450 μL.
    11. Frys de 450 μL eluate (renset MHC klasse I eller II peptider) ved -20 °C, indtil prøverne analyseres af LC-MSMS.
    12. Før LC-MS/MS-analyse fordampes de rensede MHC-klasse I- eller II-peptider fra trin 3.2.11 til tørhed ved hjælp af en vakuumkoncentrator med forudindstillinger på 45 °C i 2 timer, vakuumniveau: 100 mTorr og vakuumrampe: 5.
      BEMÆRK: Fordampningen af frosne prøver er yderst effektiv. Tørrede peptider kan re-frosne indtil analyse.

4. Identifikation af MHC klasse I og II peptider af LC-MS/MS

BEMÆRK: Analyser MHC-klasse I og II immunopeptidome ved hjælp af en højtydende Orbitrap og højopløsnings firedobbelt time-of-flight massespektrometre6. Følgende oplysninger gives kun som en indikation, idet der tages hensyn til, at de forskellige eksisterende tandemmassespektrometriinstrumenter fungerer i overensstemmelse med forskellige operationelle standarder. En kort oversigt over trinnene diskuteres nedenfor:

  1. Opløse de tørrede prøver (fra trin 3.2.12) i 50 μL på 4% myresyre (FA).
  2. Læg tre injektioner på 16 μL for hver prøve og adskilles på en hjemmelavet omvendt fase kolonne (150-μm dvs. med en længde på 250 mm, Jupiter 3 μm C18 300 Å) med en gradient fra 5%-30% ACN-0,1% FA og en 600 nL/min flowhastighed på en nano-flow UHPLC forbundet til en MS.
  3. Erhverve hver fuld MS spektrum ved en opløsning på 120000, en AGC på 4 x 105 med automatisk tilstand for injektion tid og spektre ved hjælp af tandem-MS (MS-MS) på de mest rigelige multiplicere opkrævet forløber ioner for højst 3 s.
    BEMÆRK: Tandem-MS-eksperimenter udføres ved hjælp af højenergikollision (HCD) ved en kollisionsenergi på 30%, en opløsning på 30.000, en AGC på 1,5 x 105 og en injektionstid på 300 ms.
  4. Behandle datafilerne fra de tre injektioner/stikprøver ved hjælp af en proteomics LC-MS/MS-analysesoftware (f.eks. PEAKS X) ved hjælp af musen og menneskelige databaser (UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)).
  5. Vælg 'Uspecificeret enzymfordøjelse' for enzymparameteren og 10 ppm og 0,01 Da for massetolerancer på henholdsvis forløbere og fragmentioner.
    BEMÆRK: Variable modifikationer er deamidation (NQ) og oxidation (M). Alle andre søgeparametre er standardværdierne. Endelige peptidlister filtreres ved hjælp af ALC på 80 % og med en falsk opdagelseshastighed (FDR) på 1 % ved hjælp af proteomics LC-MS/MS-analysesoftwaren.

5. Visualisering af immunopeptidomics data

BEMÆRK: Kvaliteten af immunopeptidomics data genereret af MS kan vurderes på flere måder, som for nylig beskrevet22,23. For at visualisere dataene og vurdere deres overordnede kvalitet, sammensætning og MHC-specificitet kan MhcVizPipe (MVP) softwareværktøjet bruges.

  1. Følg alle instruktioner og relateret dokumentation for at installere og køre MVP-softwaren, der er tilgængelig på Caron Lab GitHubs websted24.
    BEMÆRK: MVP giver et hurtigt og konsolideret overblik over stikprøvekvalitet, sammensætning og MHC-specificitet. MVP paralleliserer brugen af veletablerede immunopeptidomics algoritmer (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26, og GibbsCluster27) og genererer organiserede og letforståelige rapporter i HTML (HyperText Markup Language) format. Rapporterne er fuldt bærbare og kan ses på enhver computer med en moderne webbrowser. Se Supplerende data 1-4 for eksempler på HTML-rapporter.

Representative Results

Den generelle arbejdsgang for at isolere MHC-peptidkomplekser til analyse af immunpeptidomer af MS er illustreret i figur 1. Der vises repræsentative resultater med henblik på verifikation af antistoffets (figur 2) (ved hjælp af Y3 anti-H2Kb-antistoffet) og elutionseffektiviteten af MHC-peptidkomplekserne fra perlerne (figur 3) (ved hjælp af anti-HLA-ABC-antistoffet W6/32). Flowcytometribaserede kvantificeringsanalyser21 blev også anvendt til at måle det absolutte antal MHC-klasse I-molekyler pr. EL4-celle (H2Kb og H2Db) og JY-celle (HLA-ABC), som vist i figur 4A.

Den intra- og inter-individuelle reproducerbarhed af resultaterne ved hjælp af den nuværende protokol er vist i figur 4B-E. Repræsentative resultater vises for MHC klasse I peptider identificeret fra 1 x 108 EL4 celler og 1 x 108 JY celler. Resultaterne blev genereret fra to forskellige laboratoriemedlemmer (bruger 1 og bruger 2). For bruger 1 var det gennemsnitlige antal MHCI-specifikke peptider, der blev påvist fra EL4- og JY-celler, henholdsvis 1341 og 6361. for bruger 2, 1933 og 7238 (figur 4B, D). Den gennemsnitlige variationskoefficient (CV) for antallet af peptider, der påvises på tværs af tre forskellige biologiske replikater/forsøg, varierer fra 1,9%-11% (figur 4B, D). Selv om CV'erne for antallet af peptider, der blev påvist på tværs af de tre forskellige forsøg, var relativt små, varierede peptidernes identitet betydeligt (figur 4C, E). Faktisk viser repræsentative Venn-diagrammer, at andelen af peptider, der blev reproducert på tværs af tre biologiske replikater, varierede fra 39% (bruger 2, EL4-celler) til 63% (Bruger 1, JY-celler) (figur 4C, E og supplerende tabel 2).

Heatmaps genereret af MVP software viser forudsagt MHC bindende styrke af de identificerede peptider ved hjælp af NetMHCpan suite værktøjer25,26,28. To GibbsCluster rutine muligheder, som kaldes 'Unsupervised GibbsCluster' og 'Allele-Specifikke GibbsCluster', er også udført af MVP at udtrække MHC peptid-bindende motiver. Bemærk, at MVP har begrænsninger. dens primære mål er ikke at udtrække allel-specifikke motiver og anmærke peptider på en meget præcis måde, men snarere at give et fugleperspektiv på den samlede kvalitet, sammensætning og MHC-specificitet af prøverne.

For muse-MHC-klasse I (H2Db og H2Kb)peptider i EL4-celler (figur 5A; øvre paneler og supplerende data 1) viser et repræsentativt varmekort, at 89 % af alle påviste 8-12-mer peptider forventes at være stærke bindemidler (SB: NetMHCpan %Rank <0,5) eller Weak Binders (WB: NetMHCpan %Rank <2) for H2Db- eller H2Kb-molekyler. Sekvensklynger genereret fra 8-12-mer peptider er i overensstemmelse med rapporterede logoer for H2Db (asparagine ved P5 og Leucine ved P9) og H2Kb (phenylalanin ved P5 og leucin ved P8) (Figur 5)29. Det er værd at nævne, at et tredje dominerende motiv (histidin på P7 og leucin på P9) samt yderligere 'artefaktiske' motiver kan observeres ved hjælp af M1-antistoffet (supplerende data 1). Faktisk er M1-antistoffet kendt for at krydsreagere med det ikke-klassiske Qa2-molekyle, og derfor opdages Qa2-associerede peptider også af MS (supplerende data 1). Her fokuserer figur 5 for nemheds skyld på at vise de veletablerede peptidbindende motiver til de to klassiske H2b-alleler (dvs. H2Db eller H2Kb) udtrykt i EL4-celler.

For menneskelige HLA klasse I (HLA-ABC) peptider i JY celler (Figur 5A, lavere paneler og supplerende data 2), en repræsentativ heatmap viser, at 97% af alle påviste 8-12-mer peptider forventes at være SB eller WB for HLA-A * 0201, -B * 0702 eller -C * 0702. Peptider blev grupperet for at visualisere peptid bindende motiver til HLA-A * 0201 og -B * 0702. Bindende motiv til HLA-C*0702 er ikke vist i figur 5A, fordi C*0702 allele har et relativt lavt udtryksniveau. Derfor blev for få C*0702 peptider isoleret og identificeret til at generere et repræsentativt C*0702-motiv. Bemærk, at C*0702-motivet kan visualiseres i andre studier30,31,32 eller fra NetMHCpan 4.1 Motif Viewer hjemmeside33.

For humane HLA klasse II (HLA-DR) peptider i JY celler (Figur 5B, øvre paneler og supplerende data S3), en repræsentativ heatmap viser, at 70% af alle påviste 9-22-mer peptider forventes at være SB eller WB for HLA-DRB1 * 0404 og -DRB1 * 1301. Peptid bindende motiver for disse to alleler er vist (Figur 5B). Bemærk, at peptidbindende motiver, der vises her, muligvis ikke er i fuldstændig overensstemmelse med de nyligt rapporterede logoer til HLA-DRB1*0404 og -DRB1*130134. Denne uoverensstemmelse fremhæver den nuværende manglende evne til MVP/NetMHCpan præcist at anmærke peptider til HLA klasse II alleler, der er mindre karakteriseret, såsom HLA-DRB1 * 0404 og -DRB1 * 1301 udtrykt i JY celler. Yderligere oplysninger om klasse II peptid bindende motiver kan findes i andre undersøgelser34,35 og fra NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer hjemmeside36.

Endelig viser et repræsentativt varmekort for muse-MHC-celler (H2-IAd- og H2-IEd)-peptider i A20-celler (figur 5B; lavere paneler og supplerende data 4), at 87 % af alle registrerede 9-22-mer peptider forventes at være SB eller WB for H2-IAd eller H2-IEd. Peptid bindende motiver for disse to alleler er i overensstemmelse med rapporterede logoer37.

Komplette HTML-rapporter genereret af MVP-softwaren for at vurdere stikprøvernes overordnede kvalitet og MHC-specificitet er tilgængelige i supplerende data 1-4.

Figure 1
Figur 1: Skematisk for den komplette procedure for isolering af MHC klasse I og II peptider. (A-B)100 millioner celler pelleted og lysed med 0,5% Chaps buffer. (C) Cellelyset centrifugeres, og supernatanten tilsættes til CNBr-sepharoseperler koblet til det ønskede antistof på forhånd og (D) inkuberet 14-18 timer ved 4 °C. (E) Efter immunkapslen overføres perlerne til en polypropylensøjle og vaskes, og MHC-peptidkomplekserne eluteres med en 1% TFA-opløsning. (F) Peptiderne afsaltet og eluteres ved hjælp af en C18-kolonne. (G) Efterfølgende, peptider er hastighed vac tørret og analyseret af tandem massespektrometri. (H) Kvaliteten af de isolerede MHC-klasse I- og II-peptider kan vurderes på grundlag af HLA-undertyperne ved hjælp af den frit tilgængelige MhcVizPipe-software. Figur oprettet med BioRender.com (NT22ZL8QSL). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Coomassie gel farvning til at spore antistof bindende effektivitet til sepharose CNBr-aktiverede perler. Aliquots af tilsvarende mængder blev indlæst på 12% SDS-PAGE gel efterfulgt af Coomassie blå farvning: perler + antistofforkobling (1), ubundet antistof efter koblingstrin (2), supernatant efter sidste vask efter kobling (3) og perler kombineret med antistof (4). Effektiviteten af bindingen illustreres ved et betydeligt fald i signalfarvningsintensiteten af de lette og tunge kæder af H2Kb, når perlerne er kovalent bundet (Bane 4) til CNBr-perlerne sammenlignet med antistoffet før kobling (Bane 1). Figuren er genoptrykt og tilpasset fra bioRxiv38. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Vestlig blotting til sporing af MHC-peptidkomplekser efter sur elution fra antistof-koblede CNBr-aktiverede perler. Aliquots taget fra de trin, der er angivet i protokollen (1/100 af det samlede målte volumen) blev indlæst på en 12% SDS-PAGE gel og overført til nitrocellulosemembran: Perler + lysat efter immuncapture og sidste vask (A); supernatant af sidste vask (B) og MHC-peptid komplekser eluted fra perlerne (C). Det stærke detektionssignal fra MHC-peptidkomplekserne i (C) ved hjælp af anti-HLA-ABC heavy chain antistof (Abcam, #ab 70328, 1:5000) bekræftede isoleringen af MHC-peptidkomplekser efter sur elution. Bemærk, at det er muligt at vurdere andelen af MHC-peptid komplekser, der ikke blev fanget af antistof koblede perler ved at indsamle flow-through fra trin 3.1.6. En aliquot kan føjes til den vestlige blot (ikke vist på denne gel). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Identifikation af MHC klasse I peptider fra JY- og EL4-celler. (A) Histogramme, der viser det absolutte antal celleoverflade H2Db- og H2Kb-molekyler pr. EL4-celle og af HLA-ABC-molekyler pr. JY-celle. Kvantificeringen blev udført af flowcytometri. Middel- og standardfejl i middelværdien blev opnået fra tre biologiske kopier. (B, D) Histogram, der viser det gennemsnitlige antal og standardafvigelsen af gennemsnittet af MHC-klasse I-peptider identificeret af to uafhængige brugere (USER_1 [U1] og USER_2 [U2]). Middeltal og standardafvigelse af gennemsnittet af MHC klasse I peptider opdaget fra mus EL4 celler (B) og menneskelige JY celler (D) er vist. Koefficienter for variation (CV) på tværs af tre uafhængige biologiske replikater er angivet. (C, E) Venn diagrammer, der viser antallet af peptider, der blev reproducerbar opdaget i EL4 (C) og JY celler (E) af to uafhængige brugere (U1 og U2) på tværs af tre uafhængige biologiske replikater. Figur 4A er genoptrykt og tilpasset fra bioRxiv38. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Visualisering af immunopeptidomics data ved hjælp af MVP-softwareværktøjet. Dataanalyse af mus og menneske (A) MHC klasse I og (B) MHC klasse II peptider. Repræsentative bindende affinitetsvarmekort (venstre paneler) og peptidbindingsmotiver (højre paneler) vises. Heatmaps farver repræsenterer MHC bindende affinitet forudsagt af NetMHCpan 4,1 (%rang). Stærke bindemidler er røde (%rang <0,5), Svage bindemidler er blå (%rang <2) og ikke-bindemidler er gule (%Rang >2). Andel (%) af 8-12mer peptider (A) og 9-22mer peptider (B), der er SB eller WB er angivet i parentes. Peptid bindende motiver blev genereret af MVP ved hjælp af 'Allele-specifikke Gibbscluster' mulighed. Disse repræsentative resultater blev opnået fra 1 x 108 celler og ved hjælp af følgende antistoffer og cellelinjer: M1 antistof og EL4-celler til mus MHC klasse I peptider; W6/32 antistof- og JY-celler til MHC-klasse I-peptider; M5 antistof og A20 celler til mus MHC klasse II peptider; L243 antistof- og JY-celler til humane MHC-klasse II-peptider. Se de supplerende data 1-4 for at få adgang til de fulde HTML-rapporter, der genereres af MVP-softwaren. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende data 1-4: Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende data 1: HTML-rapport genereret af MVP-softwaren fra peptider, der blev isoleret fra 1 x 108EL4-celler ved hjælp af M1-antistoffet. Tre biologiske kopier er vist. Denne rapport vedrører figur 4 og figur 5, og repræsentative peptider er opført i supplerende tabel 2.

Supplerende data 2: HTML-rapport genereret af MVP-softwaren fra peptider, der var isoleret fra 1 x 108JY-celler ved hjælp af W6/32 antistof. Tre biologiske replates er vist. Denne rapport vedrører figur 4 og figur 5, og repræsentative peptider er opført i supplerende tabel 2.

Supplerende data 3: HTML-rapport genereret af MVP-softwaren fra peptider, der var isoleret fra 1 x 108JY-celler ved hjælp af L243-antistoffet. Denne rapport vedrører figur 5, og repræsentative peptider er opført i supplerende tabel 2.

Supplerende data 4: HTML-rapport genereret af MVP-softwaren fra peptider, der blev isoleret fra 1 x 108A20-celler ved hjælp af M5-antistoffet. Denne rapport vedrører figur 5, og repræsentative peptider er opført i supplerende tabel 2.

Supplerende tabel 1: Liste over buffere. Opskrifter på alle de buffere, der bruges i protokollen, er beskrevet. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: Repræsentative lister over peptider i forbindelse med H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR og H2-IAd/IEd. Denne tabel indeholder lister over repræsentative MHC klasse I og II peptider isoleret fra mus EL4 og A20 cellelinjer, henholdsvis, og HLA klasse I og II fra menneskelige JY celle linje. Disse data er blevet deponeret på ProteomeXchange (PXD028633). Klik her for at downloade denne tabel.

DATATILGÆNGELIGHED:

Datasæt, der anvendes i dette manuskript blev deponeret på ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset): PXD028633.

Discussion

To musecellelinjer (EL4 og A20), en human cellelinje (JY) og fem kommercielt tilgængelige antistoffer [M1 (anti-H2Db/Kb), Y3 (anti-H2Kb), M5 (anti-H2-IAd/IEd), W6/32 (anti-HLA-ABC) og L243 (anti-HLA-DR)] blev testet og valideret i forbindelse med denne protokol og leverer immunpeptidomics-data af høj kvalitet. Andre anti-HLA antistoffer er tilgængelige (f.eks anti-HLA-A2 BB7.2), men blev ikke testet her. Bemærk, at W6/32 antistoffet er meget udbredt og det mest etablerede antistof i marken; det gør det muligt at isolere peptider præsenteret af alle HLA-ABC molekyler hos mennesker og blev tidligere rapporteret af ekspertlaboratorier til at arbejde fra forskellige biologiske kilder såsom frisk eller frosset væv8,39, perifere blod mononukleare celler og knoglemarvs mononuklear celle40, biopsier41, xenografts41,42, obduktioner43 og plasmaprøver44,45.

Forberedelsen af nye løsninger, der bruges i hele protokollen, er kritisk. Især er brugen af friske sure opløsninger i glasflasker afgørende for at undgå efterfølgende forurening af prøverne analyseret af MS. Derudover, når protokollen er færdig for første gang og / eller med et nyt antistof, er det vigtigt at vurdere, at antistoffet faktisk er koblet til CNBr Sepharose perler ved hjælp af en blå Coomassie gel. Vasketrinene af antistof koblede perler efter immuncapture af MHC-peptidkomplekserne er også afgørende for at undgå forurening af ikke-MHC peptider. Endelig kræves der særlig omhu for ikke at kassere eluaterne efter fortyndingen af MHC-peptidkomplekserne med 1% TFA og udløsningen af peptider fra C18-kolonnen med ACN28%/0,1% FA.

Eksisterende protokoller, der er tilgængelige i litteraturen, beskriver yderligere trin til yderligere rensning af peptider ved afslutningen af isolationsproceduren, f.eks. peptidfraktionering ved forskellige metoder14,46 eller ultrafiltre ved hjælp af 10-30 kDa filtre13,47. Den nuværende protokol indeholder ikke oplysninger om disse yderligere trin og er tilstrækkelig til at levere immunpeptidomics-data af høj kvalitet. Sådanne skridt kan dog overvejes af ikke-eksperter til at ændre og fejlfinde for yderligere at optimere peptidisolationsproceduren.

Typen af perler og typen af sur elution buffer, der bruges til at elute MHC-komplekser fra perlerne kan også ændres til fejlfinding13,14,15,16,17,18,19. I denne henseende er sepharose CNBr-aktiverede perler generelt et godt udgangspunkt, da de er relativt billige ud over at vise fleksibilitet med hensyn til binding med forskellige typer antistoffer. I den nuværende protokol viste sepharose CNBr-aktiverede perler sig at klare sig relativt godt ved hjælp af fem forskellige kommercielt tilgængelige antistoffer (dvs. M1, Y3, W6/32, L243 og M5). Udover sepharose CNBr-aktiverede perler, Protein A eller G eller A / G sepharose 4 Fast Flow perler er også nemme at håndtere, og selv om relativt dyrere, kan generere lignende resultater. En anden faktor at overveje er affiniteten af antistoffet for protein A eller G. Desuden er sepharose magnetiske perler også meget nemme at bruge, men er relativt dyre. Uafhængigt af den type perler, der er valgt af ikke-eksperter, opfordres det til at indsamle aliquots på kritiske trin i protokollen og udføre blå Coomassie-farvede SDS-PAGE geler for at spore antistoffets bindende effektivitet til perlerne, som vist i figur 2.

En anden vigtig faktor, der påvirker succesen af MHC peptider isolation refererer til den type sure elution buffer, der anvendes til at isolere MHC-peptid komplekser fra perlerne. Forskellige buffere er blevet rapporteret, herunder 0,1%, 1% eller 10% TFA, 0,2% FA og 10% eddikesyre. 1% TFA var den elutionbuffer, der arbejdede for alle de testede antistoffer. Dette trin kan også spores ved vestlige blotting mod MHC molekyler, der anvendes til at fange MHC peptider, som vist i figur 3.

Alle buffere, der indeholder acetonitril (ACN) og/eller trifluoracetisk syre (TFA), er aggressive og kan føre til forurening af prøven med små molekylære og polymere stoffer såsom blødgørere, hvis de er i kontakt med plast. For at undgå sådanne problemer fremstilles alle opløsningsløsninger, der indeholder et organisk opløsningsmiddel og/eller TFA, dagligt frisk og opbevares i en glasflaske, indtil de anvendes. De fleste af trinene udføres i Protein LoBind plastrør. Disse rør er specielt designet til proteomics og er lavet af højeste kvalitet, jomfru polypropylen fri for biocider, blødgørere, og latex. De er også produceret med optimerede, meget polerede forme uden brug af slip agenter. Disse forholdsregler er vigtige at overveje for at muliggøre generering af immunpeptidomics-data af høj kvalitet.

Antistoffet er en vigtig begrænsning for isolering af MHC-bundne peptider. W6/32 antistoffet muliggør isolering af peptider præsenteret af alle HLA-ABC klasse I molekyler hos mennesker og er den mest udbredte og etablerede antistof i marken. Høj opløsning HLA skrive af ukarakteriseret menneskelige cellelinjer eller biospecimens er ikke en nødvendighed ved anvendelse af W6/32 antistof, men anbefales ikke desto mindre til visse applikationer til at lette datafortolkning48. HLA/MHC-skriveoplysninger findes også i offentlige ressourcer til flere cellelinjer og musemodeller49. Ud over W6/32 antistoffet er de fire andre antistoffer (M1, M5, Y3 og L243), der blev testet og valideret i forbindelse med denne protokol, alle kommercielt tilgængelige. På den anden side er mange andre antistoffer, der blev rapporteret i tidligere immunopeptidomics-undersøgelser, ikke i vid udstrækning blevet vedtaget af samfundet og er ikke kommercielt tilgængelige eller er tilgængelige gennem hybridomacellelinjernes kultur, hvilket er relativt dyrt.

En anden vigtig begrænsning for isolering af MHC-bundne peptider er mængden af udgangsmateriale, der kræves. Den krævede mængde er omvendt proportional med udtryksniveauet for MHC-molekyler på celleoverfladen, som kan kvantificeres ved flowcytometri (figur 4A). Celler, der viser høje ekspressionsniveauer af MHC-molekyler (f.eks. dendritiske celler og hæmatopoietiske celler generelt), giver generelt immunpeptidomiske data af høj kvalitet. Ekspertlaboratorier bruger fra så lavt som 50 millioner celler50, men 100 millioner til 1 milliard celler anbefales til ikke-eksperter. Brug af vævsbiopsi (<13 mg)41, xenograft42,43, obduktion44 og plasma45,46 prøver blev også rapporteret, men er fortsat udfordrende for ikke-ekspertlaboratorier. Også det samlede antal MHC-associerede peptider forventes er veldokumenteret for etablerede cellelinjer (her mellem ~ 2000 og ~ 10000 peptider afhængigt af cellelinjen og antistof, der anvendes), men de absolutte mængder af naturligt præsenterede peptider, der effektivt trækkes ned af teknikken forbliver debatteret. Tidligere undersøgelser anslog, at isolationsprocedurens effektivitet er peptidafhængig og kan være fra så lavt som 0,5%-2%51. Andre begrænsninger i immunopeptidomics er reproducerbarheden af metoderne og den manglende evne til NetMHCpan suite værktøjer til korrekt anmærke peptider til MHC alleler, der er mindre karakteriseret. I den forbindelse videreudvikles og anvendes relativt nye datauafhængige erhvervelsesmetoder7,32,52 samt nye peptidklynger og MHC peptidbindingsforudsigelsesalgoritmer31,34,53,54 forventes at forbedre reproducerbarheden og nøjagtigheden af peptidanmærkning i immunopeptidomics. Immunopeptidomics står over for andre begrænsninger med hensyn til MS erhvervelse og beregningsmæssige analyse af MHC-associerede peptider og er dækket andetsteds1,6,55.

While isolering af HLA-ABC-associerede peptider fra menneskelige prøver ved hjælp af W6/32 antistof er veletableret og bredt anvendt af mange forskningsgrupper, isolering af mus MHC klasse I- og II-associerede peptider er relativt mindre etableret. Derfor er der behov for robuste protokoller til isolering af mus MHC ligands. Her leverer vi en protokol optimeret til isolering af MHC klasse I peptider og MHC klasse II peptider fra to musecellelinjer af henholdsvis C57BL/6 og BALB/c oprindelse. Specifikt muliggør protokollen isolering af klasse I H2Kb- og H2Db-associerede peptider ved hjælp af M1-antistoffet samt klasse II H2-IAd og H2-IEd-associerede peptider ved hjælp af M5-antistoffet. Formidling og anvendelse af den nuværende protokol bør således lette grundlæggende og translationel immunopeptidomics forskning i forskellige musemodeller.

Protokollen kan bruges til at etablere og standardisere en immunopeptidomics workflow, samt at benchmarke nye protokoller. For eksempel kan det tilpasses og yderligere optimeres til at udføre immunopeptidomics screening i forskellige biologiske matricer lige fra blod / plasma til frisk eller frosset væv til FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded). Desuden vil protokollen fremme reproducerbarheden af prøvepræparationen inden for og mellem laboratorier i immunopeptidomics og forventes derfor at finde bred anvendelse i grundforskning og klinisk forskning.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Pierre Thibault, Eric Bonneil, Joël Lanoix, Caroline Côté (Institut for Forskning i Immunologi og Kræft, Université de Montréal) og Anthony Purcell (Monash University) for deres indsigtsfulde kommentarer. Dette arbejde blev støttet af midler fra Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), Cole Foundation, CHU Sainte-Justine og Charles-Bruneau Foundations, Canada Foundation for Innovation, National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) og Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (#174924).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A20 cell line ATCC TIB-208 mouse B lymphoblast
Acetonitrile, LC/MS Grade FisherScientific A955-4
anti-Human HLA A, B, C (W6/32) - MHC class I BioXcell BE0079
anti-Human/Monkey HLA-DR (L243) - MHC class II BioXcell BE0308
anti-Mouse H2 (M1/42.3.9.8) - MHC class I BioXcell BE0077
anti-Mouse H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC class II BioXcell BE00108
anti-Mouse H2Kb (Y3) - MHC class I BioXcell BE0172
BupH Phosphate Buffered Saline Packs (PBS) ThermoFisher 28372 Pouch contents dissolved in a final volume of 500 mL deionized water (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) EMDMilipore 220201-10MG
CNBr-activated Sepharose Cytivia # 17-0430-01
EL4 cell line ATCC TIB-39 mouse T lymphoblast
epTIPS LoRetention Tips, 1000 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-352 Better results with low retention material
epTIPS LoRetention Tips, 200 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-351 Better results with low retention material
Formic Acid, LC/MS Grade FisherScientific A117-50
Glycine FisherScientific RDCG0250500
Hydrochloric acid solution FisherScientific 60-007-11
JY cell line Sigma Aldrich 94022533-1VL EBV-immortalised B cell lymphoblastoid line
Methanol, LC/MS Grade FisherScientific A456-4
Poly prep chromatography columns (polypropylene column) Bio-Rad 731-1550 referred as polypropylene column in the protocol
Proteases inhibitor ThermoFisher A32963 1 pellet per 10 mL of cell lysis buffer
Qifikit Dako K007811-8
Sodium Bicarbonate Amresco # 0865-1kg
Sodium Chloride FisherScientific MSX04201
Solid phase extraction disk, ultramicrospin column C18 The nest group SEMSS18V capacity of 6–60 µg, max volume of 200 µL
Trifluoroacetic Acid (TFA), LC-MS Grade FisherScientific PI85183
Tris FisherScientific T395-500
Tris-HCl FisherScientific #10812846001
Tube LoBind 1.5 mL/Eppendorf FisherScientific E925000090 Better results with low retention material
Tube LoBind 2 mL/Eppendorf FisherScientific 13-698-795 Better results with low retention material
Water, LC/MS Grade FisherScientific W64

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vizcaíno, J. A., et al. The human immunopeptidome project: A roadmap to predict and treat immune diseases. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 31-49 (2019).
  2. Caron, E., Aebersold, R., Banaei-Esfahani, A., Chong, C., Bassani-Sternberg, M. A case for a human immuno-peptidome project consortium. Immunity. 47 (2), 203-208 (2017).
  3. Arnaud, M., Duchamp, M., Bobisse, S., Renaud, P., Coukos, G., Harari, A. Biotechnologies to tackle the challenge of neoantigen identification. Current Opinion in Biotechnology. 65, 52-59 (2020).
  4. Caron, E., et al. The MHC I immunopeptidome conveys to the cell surface an integrative view of cellular regulation. Molecular Systems Biology. 7 (1), 533 (2011).
  5. Istrail, S., et al. Comparative immunopeptidomics of humans and their pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13268-13272 (2004).
  6. Caron, E., Kowalewski, D. J., Koh, C. C., Sturm, T., Schuster, H., Aebersold, R. Analysis of major histocompatibility complex (MHC) immunopeptidomes using mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (12), 3105-3117 (2015).
  7. Caron, E., et al. An open-source computational and data resource to analyze digital maps of immunopeptidomes. eLife. 4, 07661 (2015).
  8. Bassani-Sternberg, M., et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nature Communications. 7 (1), 13404 (2016).
  9. Gubin, M. M., et al. Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens. Nature. 515 (7528), 577 (2014).
  10. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572-576 (2015).
  11. Laumont, C. M., et al. Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens. Science Translational Medicine. 10 (470), 5516 (2018).
  12. Lill, J. R., et al. Minimal information about an immuno-peptidomics experiment (MIAIPE). Proteomics. 18 (12), 1800110 (2018).
  13. Nelde, A., Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing, methods and protocols. Methods in molecular biology. 1988, Clifton, N.J. 123-136 (2019).
  14. Purcell, A. W., Ramarathinam, S. H., Ternette, N. Mass spectrometry-based identification of MHC-bound peptides for immunopeptidomics. Nature Protocols. 14 (6), 1687-1707 (2019).
  15. Ebrahimi-Nik, H., et al. Mass spectrometry driven exploration reveals nuances of neoepitope-driven tumor rejection. JCI Insight. 5 (14), 129152 (2019).
  16. Schuster, H., et al. A tissue-based draft map of the murine MHC class I immunopeptidome. Scientific Data. 5, 180157 (2018).
  17. Ritz, D., Gloger, A., Weide, B., Garbe, C., Neri, D., Fugmann, T. High-sensitivity HLA class I peptidome analysis enables a precise definition of peptide motifs and the identification of peptides from cell lines and patients sera. PROTEOMICS. 16 (10), 1570-1580 (2016).
  18. Bassani-Sternberg, M. Mass spectrometry based immunopeptidomics for the discovery of cancer neoantigens. Methods Mol Biol. 1719, 209-221 (2018).
  19. Lanoix, J., et al. Comparison of the MHC I Immunopeptidome Repertoire of B-Cell Lymphoblasts Using Two Isolation Methods. Proteomics. 18 (12), 1700251 (2018).
  20. Kuznetsov, A., Voronina, A., Govorun, V., Arapidi, G. Critical review of existing MHC I immunopeptidome isolation methods. Molecules. 25 (22), 5409 (2020).
  21. Urlaub, D., Watzl, C. Coated latex beads as artificial cells for quantitative investigations of receptor/ligand interactions. Current Protocols in Immunology. 131 (1), 111 (2020).
  22. Ghosh, M., et al. Guidance document: Validation of a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry immunopeptidomics assay for the identification of HLA class I ligands suitable for pharmaceutical therapies*. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (3), 432-443 (2020).
  23. Fritsche, J., et al. Pitfalls in HLA ligandomics - How to catch a li(e)gand. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100110 (2021).
  24. Caron Lab. GitHub. , Available from: https://github.com/CaronLab/MhcVizPipe (2021).
  25. Jurtz, V., Paul, S., Andreatta, M., Marcatili, P., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.0: Improved peptide-MHC Class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. The Journal of Immunology. 199 (9), 3360-3368 (2017).
  26. Reynisson, B., Alvarez, B., Paul, S., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data. Nucleic Acids Research. 48, 449-454 (2020).
  27. Andreatta, M., Alvarez, B., Nielsen, M. GibbsCluster: unsupervised clustering and alignment of peptide sequences. Nucleic Acids Research. 45 (1), 458-463 (2017).
  28. Nielsen, M., et al. NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B Locus protein of known sequence. PLoS ONE. 2 (8), 796 (2007).
  29. Fortier, M. -H., et al. The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome. The Journal of Experimental Medicine. 205 (3), 595-610 (2008).
  30. Marco, M. D., Schuster, H., Backert, L., Ghosh, M., Rammensee, H. -G., Stevanovic, S. Unveiling the peptide motifs of HLA-C and HLA-G from naturally presented peptides and generation of binding prediction matrices. The Journal of Immunology. 199 (8), 2639-2651 (2017).
  31. Sarkizova, S., et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nature Biotechnology. 38 (2), 199-209 (2019).
  32. Pak, H., et al. Sensitive immunopeptidomics by leveraging available large-scale multi-HLA spectral libraries, data-independent acquisition and MS/MS prediction. 20, 100080 (2021).
  33. Nielson, M. NetMHNetMHCpan 4.1 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/logos_ps.php (2021).
  34. Racle, J., et al. Robust prediction of HLA class II epitopes by deep motif deconvolution of immunopeptidomes. Nature Biotechnology. 37 (11), 1283-1286 (2019).
  35. Abelin, J. G., et al. Defining HLA-II ligand processing and binding rules with mass spectrometry enhances cancer epitope prediction. Immunity. 51 (4), 766-779 (2019).
  36. Nielson, M. NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/logos.php (2021).
  37. Sofron, A., Ritz, D., Neri, D., Fugmann, T. High-resolution analysis of the murine MHC class II immunopeptidome. European Journal of Immunology. 46 (2), 319-328 (2015).
  38. Kovalchik, K. A., et al. Immunopeptidomics for Dummies: Detailed Experimental Protocols and Rapid, User-Friendly Visualization of MHC I and II Ligand Datasets with MhcVizPipe. bioRxiv. , (2020).
  39. Schuster, H., et al. The immunopeptidomic landscape of ovarian carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 9942-9951 (2017).
  40. Berlin, C., et al. Mapping the HLA ligandome landscape of acute myeloid leukemia: a targeted approach toward peptide-based immunotherapy. Leukemia. 29 (3), 1-13 (2014).
  41. Rijensky, N. M., et al. Identification of tumor antigens in the HLA peptidome of patient-derived xenograft tumors in mouse. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (8), 1360-1374 (2020).
  42. Heather, J. M., et al. Murine xenograft bioreactors for human immunopeptidome discovery. Scientific Reports. 9 (1), 18558 (2019).
  43. Marcu, A., et al. HLA ligand atlas: A benign reference of HLA-presented peptides to improve T-cell-based cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (4), 002071 (2021).
  44. Shraibman, B., et al. Identification of tumor antigens among the HLA peptidomes of glioblastoma tumors and plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (6), 1255-1268 (2019).
  45. Bassani-Sternberg, M., Barnea, E., Beer, I., Avivi, I., Katz, T., Admon, A. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18769-18776 (2010).
  46. Demmers, L. C., Heck, A. J. R., Wu, W. Pre-fractionation extends, but also creates a bias in the detectable HLA class Ι ligandome. Journal of Proteome Research. 18 (4), 1634-1643 (2019).
  47. Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing,. Methods and Protocols. 960, 145-157 (2013).
  48. Bentley, G., et al. High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing. Tissue Antigens. 74 (5), 393-403 (2009).
  49. Boegel, S., Löwer, M., Bukur, T., Sahin, U., Castle, J. C. A catalog of HLA type, HLA expression, and neo-epitope candidates in human cancer cell lines. OncoImmunology. 3 (8), 954893 (2014).
  50. Klaeger, S., et al. Optimized liquid and gas phase fractionation increases HLA-peptidome coverage for primary cell and tissue samples. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100133 (2021).
  51. Hassan, C., et al. Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes. Journal of Proteomics. 109, 240-244 (2014).
  52. Ritz, D., Kinzi, J., Neri, D., Fugmann, T. Data-independent acquisition of HLA Class I peptidomes on the Q exactive mass spectrometer platform. Proteomics. 17 (19), (2017).
  53. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Laserson, U. MHCflurry 2.0: Improved pan-allele prediction of MHC Class I-presented peptides by incorporating antigen processing. Cell Systems. 11 (1), 42-48 (2020).
  54. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Bonsack, M., Riemer, A. B., Laserson, U., Hammerbacher, J. MHCflurry: Open-source Class I MHC binding affinity prediction. Cell Systems. 7 (1), 129-132 (2018).
  55. Faridi, P., Purcell, A. W., Croft, N. P. In immunopeptidomics we need a sniper instead of a shotgun. Proteomics. 18 (12), 1700464 (2018).

Tags

Biokemi udgave 176
Immunopeptidomics: Isolering af mus og human mHC klasse I- og II-associerede peptider til massespektrometri analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette,… More

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (176), e63052, doi:10.3791/63052 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter