Summary
Nanopartikül izleme analizi (NTA), hücre dışı vezikülleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu makale, NTA deneysel parametrelerini ve kontrollerini ve ayrıca MISEV2018 ve EV-TRACK tarafından laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirlik için önerilen kılavuzları desteklemek için gerekli numunelerin ve seyrelticilerin tek tip bir analiz ve karakterizasyon yöntemini vurgulamaktadır.
Abstract
Nanopartikül izleme analizi (NTA), 2006 yılından bu yana hücre dışı vezikül (EV) araştırmaları için kullanılan çeşitli karakterizasyon yöntemlerinden biri olmuştur. Birçoğu, NTA cihazlarının ve yazılım paketlerinin minimum eğitimin ardından kolayca kullanılabileceğini ve boyut kalibrasyonunun şirket içinde mümkün olduğunu düşünmektedir. Hem NTA edinimi hem de yazılım analizi EV karakterizasyonunu oluşturduğundan, Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi 2018'de (MISEV2018) ele alınmıştır. Ek olarak, EV deneylerinin sağlamlığını artırmak için Şeffaf Raporlama ve Hücre Dışı Vezikül Araştırmalarında Merkezi Bilgi (EV-TRACK) tarafından izlenmiştir (örneğin, kontrolsüz faktörler nedeniyle deneysel varyasyonu en aza indirmek).
Yöntemlerin ve kontrollerin raporlanmasını teşvik etme çabalarına rağmen, yayınlanan birçok araştırma makalesi, orijinal NTA gözlemlerini çoğaltmak için gereken kritik ayarları rapor etmede başarısız olmaktadır. Çok az sayıda makale, negatif kontrollerin veya seyrelticilerin NTA karakterizasyonunu, fosfat tamponlu salin veya ultra saf damıtılmış su gibi ticari olarak temin edilebilen ürünlerin partikülsüz olduğunu varsayarak açıkça bildirmektedir. Benzer şekilde, pozitif kontroller veya boyut standartları, parçacık boyutlandırmasını doğrulamak için araştırmacılar tarafından nadiren rapor edilir. Stokes-Einstein denklemi, parçacık yer değiştirmesini belirlemek için numune viskozitesini ve sıcaklık değişkenlerini içerir. Bu nedenle, tüm numune video toplama işlemi sırasında kararlı lazer odası sıcaklığının raporlanması, doğru replikasyon için önemli bir kontrol ölçüsüdür. Numunelerin veya seyrelticilerin filtrasyonu da rutin olarak rapor edilmez ve eğer öyleyse, filtrenin özellikleri (üretici, membran malzemesi, gözenek boyutu) ve depolama koşulları nadiren dahil edilir. Uluslararası Hücre Dışı Vezikül Derneği'nin (ISEV) kabul edilebilir deneysel ayrıntıların asgari standartları, EV'lerin karakterizasyonu için iyi belgelenmiş bir NTA protokolü içermelidir. Aşağıdaki deney, bireysel araştırmacı tarafından bir NTA analiz protokolünün oluşturulması gerektiğine ve tek vezikül karakterizasyonu için MISEV2018 gereksinimlerini yerine getirme seçeneklerinden biri olarak NTA karakterizasyonunu kullanan yayın yöntemlerine dahil edilmesi gerektiğine dair kanıtlar sunmaktadır.
Introduction
EV'lerin ve diğer nanometre ölçekli parçacıkların doğru ve tekrarlanabilir analizi, araştırma ve endüstri genelinde çok sayıda zorluk ortaya koymaktadır. EV araştırmasının çoğaltılması, kısmen, veri toplama ile ilişkili gerekli parametrelerin raporlanmasında tekdüzelik olmaması nedeniyle zor olmuştur. Bu eksiklikleri gidermek için ISEV, EV araştırmacıları için asgari bir biyokimyasal, biyofiziksel ve fonksiyonel standartlar kümesi olarak endüstri kılavuzları önerdi ve bunları genellikle MISEV20141 olarak adlandırılan bir pozisyon beyanı olarak yayınladı. EV araştırmasının hızlanan hızı, güncellenmiş bir kılavuz gerektiriyordu ve "MISEV2018: ISEV'in bir pozisyon beyanı", MISEV2014 kılavuzlarınıgenişletti 2. MISEV2018 makalesi, tablolar, önerilen protokollerin ana hatları ve belirli EV ile ilişkili karakterizasyonu belgelemek için izlenecek adımları içeriyordu. Deneylerin yorumlanmasını ve çoğaltılmasını kolaylaştırmak için bir başka önlem olarak, EV-TRACK, EV biyolojisinin ve yayınlanan sonuçlar için kullanılan metodolojinin daha şeffaf bir şekilde raporlanmasını sağlamak için kitle kaynaklı bir bilgi tabanı (http://evtrack.org) olarak geliştirilmiştir3. Yöntemlerin standartlaştırılmış raporlaması için bu önerilere rağmen, alan yayınlanan sonuçların çoğaltılması ve doğrulanması konusunda acı çekmeye devam etmektedir.
Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Bilim Vakfı'nın kalite değerlendirme araçlarına yönelik çabalarına uyan bu makale, ISEV'in veri değerlendirme araçlarının laboratuvarlar arasında sonuçların çoğaltılması amacıyla uygulanabilmesi için yöntemlerin ve ayrıntıların standartlaştırılmış bir şekilde raporlanmasını gerektirdiğini göstermektedir. Hücre kaynaklarının raporlanması, hücre kültürü prosedürleri ve EV izolasyon yöntemleri, EV popülasyonunun niteliklerini tanımlamak için önemli faktörlerdir. NTA cihazları arasında, algılama ayarları, taşıyıcı sıvının kırılma indisi, polidispersiteye katkıda bulunan heterojen parçacık popülasyonları, standartlaştırılmış raporlama gereksinimlerinin eksikliği ve gözlemciler arası ve gözlemciler arası ölçüm sonuçlarının bulunmaması gibi faktörler, laboratuvarlar arasında NTA karşılaştırmasını zorlaştırır veya imkansız hale getirir.
2006'dan beri kullanımda olan NTA, şu anda EV araştırmacılarının yaklaşık% 80'i tarafından kullanılan nanopartikül boyutu ve konsantrasyon tayini için popüler bir yöntemdir4. MISEV2018 Kılavuzları, NTA'nın popüler seçeneklerden biri olduğu iki tür tek vezikül analizi gerektirir. NTA, geniş erişilebilirliği, numune başına düşük maliyeti ve basit kurucu teorisi (Stokes-Einstein denklemi) nedeniyle EV karakterizasyonu için ortak kullanımda olmaya devam etmektedir. NTA tarafından yapılan EV değerlendirmesi, lazer ışık saçılması ve Brownian hareket analizi kullanılarak bir partikül boyutu dağılımı ve konsantrasyon tahmini oluşturur ve alt algılama sınırı EV'nin kırılma indisi tarafından belirlenir. Bilinen viskozite ve sıcaklığa sahip akışkan bir numune kullanıldığında, EV'lerin yörüngeleri, ortalama kare yer değiştirmelerini iki boyutta belirlemek için izlenir. Bu, parçacık difüzyon katsayısının hesaplanmasını ve modifiye edilmiş bir Stokes-Einstein denklemi 5,6,7 ile küreye eşdeğer bir hidrodinamik çapa dönüştürülmesini sağlar. NTA'nın parçacık-parçacık analizi, heterojen bir EV popülasyonundaki aglomeralar veya daha büyük parçacıklar tarafından diğer karakterizasyon yöntemlerinden daha az girişime sahiptir7. Birkaç büyük parçacık boyutlandırma doğruluğu üzerinde minimum etkiye sahip olsa da, küçük miktarlarda büyük, yüksek ışık saçan parçacıkların varlığı, azaltılmış yazılım EV algılama ve izleme8 nedeniyle daha küçük parçacıkların algılanmasında kayda değer bir azalmaya neden olur. Bir ölçüm tekniği olarak, NTA'nın genellikle daha büyük parçacıklara veya parçacık agregalarına karşı önyargılı olmadığı düşünülür, ancak bireysel parçacık analizi9 yoluyla çok boyutlu popülasyonları çözebilir. Parçacıklar tarafından ışık saçılmasının kullanılması nedeniyle, NTA analizinin sınırlamalarından biri, EV'lere kıyasla benzer kırılma ve boyut özelliklerine sahip toz, plastik veya toz gibi herhangi bir partikülün bu karakterizasyon yöntemiyle gerçek EV'lerden ayırt edilememesidir.
NanoSight LM10 (nanopartikül boyutu analizörü) ve LM14 (lazer modülü) 2006'dan beri satılmaktadır ve bu cihazın daha yeni modelleri geliştirilmiş olmasına rağmen, bu özel model birçok temel tesiste bulunur ve güvenilir bir iş gücü olarak kabul edilir. Boyut ve konsantrasyonun yüksek çözünürlüklü ölçümleri için NTA ayarlarını uygun şekilde optimize etmek için eğitim gereklidir. Optimum video kayıtları için gereken iki önemli ayar (1) kamera seviyesi ve (2) algılama eşiğidir. Bunlar, numunenin özelliklerine göre operatör tarafından ayarlanmalıdır. NTA analizinin en önemli kısıtlamalarından biri, 107 ila 109 partikül / mL arasındaki numune konsantrasyonlarının önerilmesidir, bu numune seyreltmesini sağlamak içingerekli olabilir 10. Fosfat tamponlu salin, 0,15 M salin veya ultra saf su gibi seyreltme için kullanılan çözeltiler, NTA ölçümlerini etkileyebilecek 220 μm'den küçük parçacıklardan nadiren arındırılmıştır. Seyreltme için kullanılan çözeltilerin NTA karakterizasyonu, analiz edilen nanopartikül örnekleri ile aynı kamera seviyesinde ve algılama eşiğinde yapılmalıdır. EV numune seyreltmeleri için kullanılan seyrelticilerde bulunan nanopartiküllerin büyüklüğü ve konsantrasyonu, EV'lerin NTA analizini içeren yayınlara nadiren dahil edilir.
Bu protokol, kamera seviyesinin, algılama eşiğinin veya örnek filtrasyonunun NTA veri kümesi üzerindeki sistematik etkilerini analiz etmek için seçilen kamera seviyeleri, algılama eşikleri ve numunelerin mekanik filtrelenmesi kullanılarak değerlendirilen sentetik EV benzeri lipozomların NTA analizini kullanır. Lipozomlar Ek Dosya S1'de açıklandığı gibi sentezlendi. Bu deneyde sentetik lipozomlar, boyut homojenlikleri, fiziksel özellikleri ve 4 ° C'de depolamadaki stabiliteleri nedeniyle kullanılmıştır. EV'lerin gerçek örnekleri kullanılmış olsa da, EV'lerin depolama sırasındaki heterojenliği ve stabilitesi bu çalışmayı ve yorumlanmasını zorlaştırmış olabilir. (A) lipozomlardan ve (B) EV'lerden NTA raporlarındaki benzerlikler, bu makalede lipozomlar için ortaya konan sistematik etkilerin muhtemelen EV karakterizasyonu için de geçerli olacağını göstermektedir (Şekil 1). Bu bulgular birlikte, kritik yazılım ayarlarının tam raporlanmasının ve seyreltici, seyreltme ve filtreleme gibi örnek işlemenin tanımının NTA verilerinin tekrarlanabilirliğini etkilediği fikrini desteklemektedir.
Bu makalenin amacı, NTA ayarlarının (sıcaklık, kamera seviyesi ve algılama eşiği) ve numune hazırlamanın değiştirilmesinin toplanan sonuçları değiştirdiğini göstermektir: sistematik, boyut ve konsantrasyonda önemli farklılıklar elde edilmiştir. NTA, MISEV2018 karakterizasyon spesifikasyonunu yerine getirmek için popüler seçeneklerden biri olduğundan, bu sonuçlar tekrarlanabilirliği sağlamak için numune hazırlama ve NTA ayarlarının raporlanmasının önemini göstermektedir.
Şekil 1: Temsilci NTA, lipozomları EV'lerle karşılaştırmak için rapor verir. (A) Lipozomlar: 12 Mart 2020'de NTA'da karakterize edilen filtrelenmemiş numune. (B) EV'ler: 26 Ağustos 2021 tarihinde NTA'da karakterize edilen filtrelenmemiş numune. Kısaltmalar: NTA = Nanopartikül izleme analizi; EV'ler = hücre dışı veziküller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genel protokol yönergeleri
- Mikroskopu bir hava tablasında veya en azından titreşimsiz bir masada tutun. Yabancı titreşimlerin (örneğin, yere ayak vurma, masaya dokunma, kapı kapatma, laboratuvar trafiği) minimumda tutulduğundan emin olun.
- Lazer Modül'ün sıcaklığını tüm video kayıtları için sabit bir sıcaklıkta ayarlayın ve koruyun.
NOT: Seçilen sıcaklık 25 °C idi, çünkü nanopartikül boyutu analizörü bu sıcaklıkta kalibre edildi. Bu nedenle, cihazın tüm kullanıcılarının kalibre edilmiş sıcaklığı bilmesi ve kullanması önemlidir. Oda sıcaklığı kabul edilebilir bir ayar değildir, çünkü değişebilir. - Negatif kontroller olarak da adlandırılan tüm seyrelticilerin (örneğin, Dulbecco'nun Fosfat tamponlu Salin (DPBS), ultra saf damıtılmış su [DW]), ölçülen nanopartikül örnekleriyle aynı kamera seviyesi ve algılama eşiği kullanılarak NTA ile karakterize edildiğinden emin olun. Lazer modülünün yıkanması ve numunelerin seyreltilmesi için karakterize edilmiş DPBS kullanın. Negatif kontrol DPBS'sindeki faktör kirleticiler, seviyeleri önemliyse numune sonuçlarına dönüşür.
- Değerlendirmeden önce numuneleri 4 ° C'de saklayın ve lipozom örneğini bozacağı için asla dondurmayın. Numuneleri/standartları/seyrelticileri analizden önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığına ısıtın.
NOT: Numune işleme, incelenen malzemeye özgüydü. - NTA analizleri için en uygun olduğu belirlenen 10adet 7 ila 109 partikül/mL (yaklaşık 50 ila 100 partikül/NTA video ekranı) elde etmek üzere uygun bir seyreltme oluşturmak üzere Hızlı ölçümü kullanarak numuneyi ve standartları değerlendirin.
NOT: Yazarlar, bu aralığın üst ucundaki parçacık konsantrasyonlarının daha tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar ürettiğini bulmuşlardır. - Kullanılan seyreltme ve seyreltici de dahil olmak üzere hem Hızlı hem de Standart ölçümler için SÇP sekmesinin Yakalama kutusundaki ilgili tüm alanları doldurun.
2. 50 nm ve 100 nm boyutlarında kalibrasyon standartlarının hazırlanması
NOT: Malzeme tablosuna bakın.
- 50 nm boyutunda Transfer Standartları seyreltilmiş 1:5.000
- İki kez durulanmış 15 mL konik tüpe ultra saf DW'de 9.998 μL 0,22 μm filtrelenmiş 10 mM potasyum klorür (KCl)/%0,03 Ara 20'ye 50 nm standartlarının 2 μL'sini ekleyin. Seyreltilmiş 50 nm standardını 4 ° C'de bir yıla kadar saklayın.
- 100 nm boyutunda Transfer Standartları seyreltilmiş 1:333
- İki kez durulanmış 15 mL konik tüpe ultra saf DW'de 9.970 μL 0,22 μm filtrelenmiş 10 mM KCl/%0,03 Tween 20'ye 100 nm standartlarının 30 μL'sini ekleyin. Seyreltilmiş 100 nm standardını 4 ° C'de bir yıla kadar saklayın.
3. Lazer Modül'ün temizlenmesi ve montajı
- Lazer Modül ve akış hücresi kapak pencerelerinde çizikler veya kusurlar olup olmadığını görsel olarak inceleyin.
NOT: Her iki cam yüzey de çizilirse, görüntüleme etkilenebilir. - Her iki cam yüzeyi de kaliteli bir lens temizleyici ve lens kağıdı ile nazikçe temizleyin. Cam yüzeylerde mendil veya kağıt havlu kullanmayın.
- Montajdan önce O-ring contasının akış hücresi kapağının oluğuna düzgün bir şekilde oturduğundan emin olun.
- Akış hücresi kapağını lazer modülüne yerleştirin ve elektrik kontaklarının doğru yönde olduğundan emin olun. Yaylı 4 parmak vidayı akış hücresi plakasından geçirin ve lazer modülünün dişlerini tutturun, ancak ayrı ayrı sıkmayın.
- Akış hücresi kapağına eşit basınç uygulayarak, vidaları sıkışana kadar alternatif bir diyagonal şekilde düzgün bir şekilde sıkın. Sadece parmak vidalarını parmak sıkışana kadar sıkın. Aşırı sıkmayın.
NOT: Parmak vidalarının eşit olmayan şekilde sıkılması lazer modül yüzeyini çatlatabilir. Daha yeni tasarlanmış kelebek vidalar, olası aşırı sıkmayı önleyerek uygun basınçta "aşağıdan yukarıya" çıkar.
4. Lazer Modül için numunelerden önce ve numuneler arasında yıkama prosedürü
- Yeni açılmış bir DPBS ve aliquot kabını üçlü durulanmış 15 mL polipropilen tüplere kullanın. Numuneleri yıkamak veya seyreltmek için kullanılan ürünlerin, kullanımdan önce NTA karakteristikli olduğundan emin olun (bkz. adım 1.3).
- Partikül kalıntılarını gidermek için iki adet 1 mL tüberkülin şırıngasını kayar kilit adaptörleriyle 3 kez 1 mL DPBS ile yıkayın. Her iki bağlantı noktasını da giriş olarak kullanın, ancak deneme sırasında tutarlı bir şekilde kullanın. Şırınganın artan ağırlığından ve boyutundan şırınga portlarını kırma tehlikesi nedeniyle daha büyük şırıngalar kullanmayın.
- Pistonu 1. tüberkülin şırıngasından çıkarın ve atın ve boş bir seyreltici / numune rezervuarı olarak hizmet etmek için kalan porta yerleştirin.
NOT: Pistonun çıkarılmaması, numune odasında basıncın artmasına ve contanın etrafında sızıntıya neden olur. - 2. şırıngayı 1 mL DPBS ile doldurun ve akış hücresi kapağının giriş portuna takın.
- DPBS lazer modülüne yavaşça enjekte edilirken havanın odadan temizlenmesini sağlamak için lazer modülünü çıkış şırınga portu yükseltilmiş olarak eğin önünde tutun.
- Giriş bağlantı noktasına 1 mL hava enjekte ederek kalan DPBS'leri lazer modülden yıkayın. Yıkama işlemini 2 kez daha tekrarlayın.
- Son yıkamadan sonra lazer modülünü mümkün olduğunca tamamen boşaltın.
NOT: 50 nm standardının NTA analizini takiben, bu parçacıklar lazer modülünde devam ettiğinden, kapsamlı ve dikkatli bir yıkama gereklidir. Lazer Modül artık kullanıma hazırdır.
5. Lazer Modül'ün mikroskop aşamasına yerleştirilmesi
- Mikroskop kolundaki lazer modül odak hizalama kılavuzlarını bulun (Şekil 2) ve odak düğmesini kullanarak hizalayın.
Şekil 2: Lazer Modül odak hizalama kılavuzu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Mikroskopa bakacak şekilde, lazer modülünü yivli aşamaya yerleştirin ve yavaşça mümkün olduğunca sağa kaydırın.
NOT: Dikkatli bir şekilde yapılırsa, hizalama ve odak noktasının numuneler arasında bulunması daha kolay olacaktır. - Lazer kontrol kutusundaki rocker düğmesini açın.
6. Lazer Modül'ün odaklanması ve konumlandırılması
NOT: Bu, odadaki sıvı ile yapılmalıdır.
- NTA yazılımını masaüstünden yükleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: "Sıcaklık S/B COM3'te bulunamadı" şeklinde bir hata görüntülenebilir. Düzeltmek için yazılımı kapatıp yeniden açmanız yeterlidir. - Sol üst köşedeki kutudaki Yakala sekmesinin altındaki Kamerayı Başlat'ı tıklatın. Kamera 5 dakika sonra otomatik olarak kapanırsa, yeniden başlatmak için Kamerayı Başlat'ı tekrar tıklamanız yeterlidir.
- Aynı sekmede, lazer çizgisini aydınlatmak ve parçacık tanımlamayı ve odaklamayı basitleştirmek için Kamera Seviyesi'ni 14 ila 16 olarak ayarlayın.
- Başlığın sol tarafındaki üst kaydırıcıyı içeri veya dışarı hareket ettirerek görüntüyü fotoğraf makinesinden göz merceklerine yönlendirin.
- Genellikle parmak izi olarak adlandırılan artan yoğunluk alanını bulun. Parmak izini görüş alanında dikey olarak ortalayın ve odaklayın.
NOT: Lazer çizgisi parmak izinin solunda olacaktır. Odayı karartmak, parmak izini bulmayı ve lazer çizgisine odaklanmayı kolaylaştırmaya yardımcı olabilir. - Lazer çizgisini görüş alanında ortalayın; bilgisayar ekranında gözlemlendiği gibi ışığı kameraya yönlendirmek için üst kaydırıcıyı hareket ettirin.
NOT: Artık ekranda görünen lazer çizgisi, göz merceği görüntüsünün ayna görüntüsüdür; göz merceklerinde sol, bilgisayar ekranında sağ olacaktır. - Netleme düğmesiyle ekrandaki tek tek hareket eden parçacıkların görüntüsünü keskinleştirmek için odağı ayarlayın.
NOT: Odak derinliği nedeniyle, tüm parçacıklar odakta olmayacaktır, bu da kabul edilebilir. Odak dışında kalan parçacıklar bile kamera tarafından yakalanacak ve yazılım tarafından analiz edilecektir.
7. NTA analizi için lazer modüle standartların/numunelerin/seyrelticilerin yüklenmesi
- Durulanmış 1 mL tüberkülin şırıngasına 1 mL standart/numune/seyreltici çekin ve akış hücresi kapağının giriş portuna takın. Çıkış portuna bağlı açık şırıngada sıvı belirginleşene kadar pistonu ilerletin.
- Kamera görünümünde, lazer çizgisinin sağına doğru düzgün sayıda parçacık içeren bir alana gidin. Gerekirse, yatay ışık bantlarını ortalamak için dikey yönü ayarlayın. En yüksek sayıda parçacık görünene kadar yeniden odaklanın. Sonraki tüm önlemler için bu pozisyonun mümkün olduğunca yakından korunmasını sağlayın.
- Kamera Seviyesini, kamera görünümünün sağ üst köşesinde Koyu bilgi sembolünün aralıklı olarak yanıp söneceği şekilde ayarlayın.
NOT: Bu, her veri toplama serisi için minimum hassasiyet düzeyinde tutarlı bir kamera düzeyi seçiminin yapılmasını sağlamaya yardımcı olur.
NOT: Kamera Seviyesi çekim sırasında değiştirilemez.
8. Kalibrasyonun doğrulanması
NOT: Numune analizinden önce modül kalibrasyonunun boyut standartlarını (bkz. bölüm 2) kullanarak doğrulanması önerilir. Doğru ölçümler sağlamak için rutin doğrulama gereklidir. Çok kullanıcılı bir laboratuvarda, yazılım yapılandırma ayarlarının bireysel kullanıcı ayarlamaları yanlışlıkla yanlış veri toplanmasına neden olabilir. Kritik veri toplama için günlük doğrulama, iyi bir laboratuvar uygulaması meselesidir. Doğrulamanın günlük tekrarlanabilirliği, rapor edilen sonuçlara dahil edilmelidir. Genellikle, kalibrasyon teknisyen tarafından ayarlanır ve kullanıcının yönetici erişimi olmadığı sürece bireysel kullanıcı tarafından ayarlanamaz. Bu, bireysel kullanıcılar tarafından yetkisiz yeniden yapılandırmayı önler.
- Sıcak seyreltilmiş standartlar (bakınız bölüm 2) 30 dakika boyunca oda sıcaklığına.
- Standartları kısaca vorteksleyin ve ardından bölüm 7'de açıklandığı gibi yükleyin.
- Bölüm 10'da açıklandığı gibi numune NTA'yı gerçekleştirin ve doğru kalibre edilirse %2'den az olması gereken varyasyon katsayısının daha sonra hesaplanması için değerleri kaydedin.
9. NTA için numune konsantrasyonunun optimize edilmesi
NOT: Kamera seviyesi ve numune konsantrasyonu uygun şekilde ayarlandığında ekran, 50 ila 100 arasında ölçülebilir parçacık içermelidir. Bir numunenin uygun bir parçacık numarasına sahip olup olmadığı hakkında herhangi bir soru varsa, bu noktada numune üzerinde Hızlı Ölçüm çalıştırılabilir (bkz. adım 9.1 ila 9.7). Daha uzun video çekimlerinden önce örnek özellikleri hızlı bir şekilde değerlendirmek için kullanılır. Hızlı Ölçüm sekmesi, ortadaki alt kutuda yer alan SÇP sekmesinde bulunur.
- Yakalama süresi'ni 30 sn olarak ayarlayın.
- Mevcut temel dosya adını kabul edin veya oluşturulan veriler için yeni bir depolama sitesi için ... sekmesini tıklatarak yeni bir dosya adı girin.
- Hedef sıcaklık kutusunu işaretleyin ve istediğiniz sıcaklığı girin.
- Örneği daha önce açıklandığı gibi yükleyin (adım 7.1) ve Komut Dosyası Oluştur ve Çalıştır'ı tıklatın.
- 30 s videonun tamamlanmasından sonra video ekranının sağ alt köşesinde kare başına parçacık sayısının görüntülenmesini bekleyin. Parçacık sayısı 100'den büyükse, lazer modülünü 3 kez yıkayın (daha önce adım 4.6'da açıklandığı gibi).
- Numuneyi, karakterize edilen seyrelticiyi kullanarak istenen konsantrasyon aralığına kadar seyreltin.
- Uygun şekilde seyreltilmiş numuneyi yıkanmış lazer modüle yükleyin ve numunenin kabul edilebilir aralıkta olduğunu doğrulamak için Hızlı Ölçüm'ü çalıştırın.
10. Örnek NTA
NOT: Standart Ölçüm sekmesi, alt orta kutudaki SÇP sekmesi içindedir ve rutin numune analizi için kullanılır (bkz. 10.1 ila 10.12 arası adımlar).
- Süreyi 30 veya 60 sn'ye ve video sayısını 5 olarak ayarlayın.
- Mevcut temel dosya adını kabul edin veya oluşturulan veriler için yeni bir depolama sitesi için ... sekmesini tıklatarak yeni bir dosya adı girin.
- Hedef sıcaklık kutusunu işaretleyin ve istediğiniz sıcaklığı girin.
- Bu Standart Ölçümü yeniden kullanmak için Komut Dosyası Oluştur'u tıklatın.
- Örnek bölüm 7'de açıklandığı gibi yüklendikten ve deneme çalışmaya hazır olduktan sonra, Komut Dosyası Oluştur ve Çalıştır'ı tıklayın.
- Rapor Ayrıntılarını Ayarla açılır ekranındaki alanları işleç, numune açıklaması, numunenin seyreltilmesi ve kullanılan seyreltici hakkında bilgilerle doldurun.
NOT: Bu bilgiler nihai deney raporuna kaydedilecek ve basılacaktır. - İstediğiniz tüm alanlar doldurulduğunda, komut dosyasını başlatmak için Tamam'ı tıklatın.
NOT: Hedef sıcaklık seçiliyse, ısıtıcı, komut dosyasının ölçüme devam etmesine izin vermeden önce lazer modüldeki numuneyi istenen sıcaklığa 5 sn boyunca stabilize edecektir. Ekranın sol alt köşesindeki tanılama panelinde ISITICI AÇIK olarak okunur ve numunenin sıcaklığı görüntülenir. - Her video çekiminden önce, pistonu manuel olarak ilerletme istemini arayın. Numunenin ~ 0,05 mL'sini lazer odasına enjekte edin ve parçacıkların "dinlenmesine" izin verin (yani, akmıyor) ve ardından Tamam'a tıklayın.
- 5. video çekiminin tamamlanmasının ardından bir Ayarlar Onayı kutusunun görünmesini ve İşlem kutusunun yanıp sönmesini bekleyin. Video ekranının altından manuel olarak ilerletilen kareler ekranda parçacıkları işaretleyen mavi çarpıların sayısını not ederek numunenin işlenmesi için Algılama Eşiğini ayarlayın. Çerçeveler ilerledikçe her ekranda parçacıkları işaretleyen 3-4'ten fazla mavi çarpı işareti varsa, Algılama Eşiği'ni artırın.
NOT: Tek tek parçacıklar üzerindeki mavi çarpılar, akış sitometrisindeki "sürü" etkisine benzerdir ve veri toplamanın optimum doğruluğu ve tekrarlanabilirliği için en aza indirilmelidir. - Algılama Eşiği kabul edilebilir olduğunda Ayarlar Tamam'ı tıklatın.
- Tamam'ı tıklatmadan önce videoların otomatik olarak işlenmesini ve sonuçların histogramının ve tamamlandığına dair bir iletişim kutusu bildiriminin görüntülenmesini bekleyin.
- Dışa Aktarma Ayarları kutusu göründüğünde, Dışa Aktar'ı tıklatarak sonuçları kaydedin.
NOT: Videolardan ve analizlerden elde edilen tüm sonuçlar, adım 10.2'de tanımlanan hedef dosyada saklanacaktır. Bu, büyük miktarda depolama alanı gerektirir. Gerektiğinde izleyin ve ikincil bir depolama cihazına aktarın.
11. Mevcut numunenin farklı tespit eşiklerinde yeniden analizi
NOT: NTA analizinin hemen ardından (adım 10), veriler farklı Algılama Eşiği ayarları kullanılarak yeniden analiz edilebilir. Ancak, Kamera Seviyesi çekimden sonra değiştirilemez.
- Geçerli Deneme'de listelenen 5 yakalama videosunun tümünü vurgulayın.
- Seçili Dosyaları İşle'yi tıklatın ve Algılama Eşiği'ni değiştirmek için Ayar Onayı kutusunun ve İşlem kutusunun yanıp sönmesini bekleyin.
- Algılama Eşiğini istediğiniz düzeye ayarlayın ve Tamam Ayarına tıklayın.
- Tamam'ı tıklatmadan önce videoların otomatik olarak işlenmesini ve sonuçların histogramının ve tamamlandığına dair bir iletişim kutusu bildiriminin görüntülenmesini bekleyin.
- Dışa Aktarma Ayarları'nı tıklatın. En son örnek üzerinde ek değerlendirmeler yapıldığında, örnek yeniden analizinin ardından Sonuçları Dışa Aktar açılır kutusu görüntülenmeyeceğinden, Geçerli Denemedeki Sonuçları Dışa Aktar kutusunu tıklattığınızdan emin olun.
NOT: Bunu yapmak için herhangi bir hatırlatma olmadığından, kolayca göz ardı edilebilir ve analiz kaybolur. Ancak, temel alınan veriler kalır ve daha sonra yeniden analiz edilebilir.
12. Arşivlenen dosyaların analizi
NOT: Daha önce analiz edilen deneyler kaydedilmemişse veya bu numuneler üzerinde ek analizler yapılması gerekiyorsa, tek tek dosyalar ek Algılama Eşiği değerlendirmeleri için NTA yazılımına yeniden yüklenebilir. Kamera Seviyesi değişiklikleri çekimden sonra değiştirilemez.
- NTA yazılımını masaüstünden yükleyin.
- Alt orta paneldeki Analiz sekmesini tıklatın.
- Denemeyi Aç'ı tıklayın ve istediğiniz .nano dosyasına gidin.
NOT: Seçilen .nano denemesiyle ilişkili video dosyaları, ana deney dosyasıyla aynı klasörde olmalıdır; aksi takdirde, dosyaları işlemeye çalışırken bir hata görünecektir. Dosya adının ilk 6 basamağı, denemenin çalıştırıldığı tarihtir (xx-xx-xx). Dosya adının son 6 basamağı, videonun kaydedildiği saattir (xx-xx-xx) ve tek tek video tanımlayıcısıdır. Her birleştirilmiş deneyin PDF dosyası, bu analiz için dahil edilen .nano dosyalarını listeler. - Çözümlemeyi çalıştırmak için Seçili Dosyaları İşle'yi tıklatın.
- Algılama Eşiği'nde değişikliklere izin vermek için İşlem kutusu yanıp söndüğünde, eşiği istediğiniz düzeye ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın.
- Tamam'ı tıklatmadan önce videoların otomatik olarak işlenmesini ve sonuçların histogramının ve tamamlandığına dair bir iletişim kutusu bildiriminin görüntülenmesini bekleyin.
- Sonuçları Dışa Aktar'ı tıklayın. Geçerli Denemede Sonuçları Dışa Aktar kutusunu tıklattığınızdan emin olun, çünkü yeniden analizin ardından Sonuçları Dışa Aktar açılır kutusu görüntülenmez.
NOT: Bunu yapmak için herhangi bir hatırlatma olmadığından, kolayca göz ardı edilebilir ve analiz kaybolur.
13. Lazer Modül'ün temizlenmesi ve sökülmesi
- Lazer kontrol kutusunu kapatın.
- Tüm numuneyi lazer modülden temizleyin ve düzgün bir şekilde atın.
- DPBS lazer modüle yavaşça enjekte edildiğinden ve çıkış şırınga bağlantı noktasından yıkandığından, lazer modülünü açık şırınga bağlantı noktası yükseltilmiş olarak eğin açık şırınga bağlantı noktası yükseltilmiş olarak tutun.
- Kalan DPBS'yi lazer modülden temizleyin ve atın.
- Yıkama işlemini 2 kez daha tekrarlayın ve son yıkamadan sonra lazer modülünü mümkün olduğunca tamamen boşaltın.
- Akış hücresi kapağına eşit basınç uygulayarak, vidaları dişlerden ayrılana kadar alternatif çapraz bir şekilde eşit şekilde gevşetin, parmak vidalarını çıkarın ve lazer modül kasasında saklayın.
- Akış hücresi kapağını lazer modülünden çıkarın.
- Her iki cam yüzeyi de kaliteli bir lens temizleyici ve lens kağıdı ile nazikçe temizleyin. Cam yüzeylerde kağıt mendil veya kağıt havlu kullanmayın.
- Lazer modül ve akış hücresi kapağı "pencerelerini" kullanımdan sonra çizikler veya kusurlar için görsel olarak inceleyin ve süpervizöre rapor verin.
- Depolama sırasında cam yüzeylerin zarar görmesini önlemek için lazer modülünü ve akış hücresi kapağını kasalarında değiştirin.
14. Örnek analiz protokolü
- Filtrelenmemiş numuneler
- Yüklemeden önce numuneyi vorteksleyin ve yukarıda açıklandığı gibi Kamera Seviye 12 ve Algılama Eşiği Seviye 3'te 5 x 60 s videolar kaydedin. Algılama Eşikleri 2 ve 5'i kullanarak bu videoları yeniden analiz edin.
- Aynı örneklemin video koleksiyonlarını Kamera Düzeyleri 13 ve 14 ve Algılama Eşiği Düzeyi 3'te tekrarlayın. Algılama Eşikleri 2 ve 5'i kullanarak bu 2 ek videoyu yeniden analiz edin. SÇP ayarında 5 x 30 sn'lik videolar kullanarak tüm süreci tekrarlayın.
- Filtrelenmiş numuneler
- Numuneyi vorteksleyin ve ardından aynı anda doğrudan lazer modülüne yükleyin ve filtreleyin (0,22 μm şırınga filtresi).
NOT: Şırınga filtresi, herhangi bir yerleşik partikülü çıkarmak için kullanılmadan önce filtre ölü alanının hacminin 2 katı ile yıkanmıştır. Şırınga filtreleri ( Malzeme Tablosuna bakınız) 0,5 mL'lik ölçülen bir ölü alana sahipti ve ölçümlerden önce numunenin 1,0 mL'si ile yıkandı. SÇP veri alanlarındaki filtre türünü not alın. Filtrelenmiş numune, adım 14.1'de filtrelenmemiş numuneler için tam olarak açıklandığı gibi işlenmiştir.
- Numuneyi vorteksleyin ve ardından aynı anda doğrudan lazer modülüne yükleyin ve filtreleyin (0,22 μm şırınga filtresi).
15. NTA sonuçlarının istatistiksel analizi
- Ana etkilerin veya etkileşimlerin analizi için, ANOVA varsayımlarının (normallik, unimodal, varyansın homojenliği) kontrolünü takiben varyans analizi yapın. ANOVA varsayımlarının başarısız olması durumunda Kruskal-Wallis tek yönlü ANOVA'yı rütbelerde kullanın.
- Önemli ana etkilerin geri dönüşünü takiben, önceden planlanmış karşılaştırmalar için araç testi yapmak için Dunn'ın yöntemini kullanın. İki kuyruklu testte 0.05'lik bir p değerinin anlamlı olduğunu düşünün.
NOT: Burada oluşturulan veri dosyaları, bir malzeme transfer sözleşmesinin tamamlanmasının ardından yazarlardan temin edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tablo 1 , lipozom örnekleri (18 filtrelenmiş ve 18 filtrelenmemiş) ve temsili bir DPBS seyreltici için NTA videolarının sonuçlarını içermektedir. Bu yazıda kamera seviyesi veya algılama eşiğinden bağımsız olarak iki grup arasındaki karşılaştırmalar tamamlanmıştır. Filtrelenmiş numunelerin ortalama parçacık çapı 108.5 nm, parçacık modu 86.2 nm ve konsantrasyonu 7.4 × 108 parçacık/mL idi. Buna karşılık, filtrelenmemiş numunelerin ortalama parçacık çapı 159.1 nm, parçacık modu 105.7 nm ve 7.6 × 108 parçacık / mL konsantrasyonu vardı. Kamera seviyesinden veya algılama eşiğinden bağımsız olarak, filtrelenmiş ve filtrelenmemiş örnekler için ortalama ve mod değerleri istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.05). Kamera seviyesinden veya algılama eşiğinden bağımsız olarak, filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numuneler arasındaki konsantrasyon farklılıkları anlamlı değildi (p = 0.86).
| Filtrelenmiş ve Filtrelenmemiş Örneklerin Karşılaştırılması | ||||||||||||
| Örnek | Kam Leva | Det Thr | Demek | Ortalama %CV | Aziz Dev. | × 108 | St. Dev. × 107 | |||||
| Filtre | Filtrelenmemiş | Filtre | Filtrelenmemiş | Filtre | Filtrelenmemiş | Filtre | Filtrelenmemiş | Filtre | Filtrelenmemiş | |||
| Lipozom | 12 | 3 | 138.3 | 162.1 | 55.5 | 47.5 | 76.7 | 77 | 3.2 | 6.48 | 1.74 | 3.16 |
| Lipozom | 12 | 2 | 126.3 | 153.7 | 58.7 | 49.8 | 74.2 | 76.5 | 4.94 | 8.23 | 2.74 | 3.5 |
| Lipozom | 12 | 5 | 155 | 172.2 | 51.8 | 45.6 | 80.3 | 78.6 | 1.91 | 5.05 | 1.02 | 2.9 |
| Lipozom | 13 | 3 | 102.7 | 169 | 43.5 | 51.3 | 44.7 | 86.7 | 6.72 | 7.75 | 1.91 | 1.17 |
| Lipozom | 13 | 2 | 95.8 | 161.4 | 43.3 | 52.7 | 41.5 | 85 | 10.3 | 9.7 | 1.61 | 1.83 |
| Lipozom | 13 | 5 | 110.7 | 176.1 | 42.5 | 47.1 | 47 | 83 | 4.16 | 6.28 | 1.83 | 1.07 |
| Lipozom | 14 | 3 | 98 | 147.6 | 42.4 | 43.8 | 41.6 | 64.6 | 10.6 | 8.56 | 2.4 | 1.66 |
| Lipozom | 14 | 2 | 92.9 | 142.1 | 42.6 | 45.2 | 39.6 | 64.3 | 14.9 | 10.7 | 2.54 | 1.83 |
| Lipozom | 14 | 5 | 103.8 | 153.8 | 41.1 | 42.6 | 42.7 | 65.5 | 7.42 | 7.02 | 2.37 | 1.51 |
| Lipozom | 12 | 3 | 105.6 | 179.4 | 22.2 | 46.7 | 23.4 | 83.7 | 5.2 | 5.81 | 1.06 | 4.28 |
| Lipozom | 12 | 2 | 100.3 | 170.8 | 24.3 | 49.1 | 24.4 | 83.8 | 7.76 | 7.39 | 1.61 | 4.41 |
| Lipozom | 12 | 5 | 112 | 187.2 | 20.4 | 42.9 | 22.8 | 80.4 | 3.27 | 4.68 | 0.815 | 3.93 |
| Lipozom | 13 | 3 | 99.8 | 153.3 | 23.4 | 52.1 | 23.4 | 79.8 | 7.19 | 7.34 | 3.37 | 1.5 |
| Lipozom | 13 | 2 | 94.3 | 143.6 | 25.8 | 53.2 | 24.3 | 76.4 | 10.8 | 9.53 | 4.3 | 2.46 |
| Lipozom | 13 | 5 | 106.8 | 162 | 21.3 | 49.4 | 22.7 | 80 | 4.64 | 5.76 | 2.63 | 1.01 |
| Lipozom | 14 | 3 | 103.4 | 142.3 | 31.7 | 49.6 | 32.8 | 70.6 | 9.91 | 8.66 | 3.29 | 12.5 |
| Lipozom | 14 | 2 | 97.8 | 136 | 33.3 | 51.4 | 32.6 | 69.9 | 13.8 | 11.5 | 2.98 | 15.7 |
| Lipozom | 14 | 5 | 109.5 | 151.4 | 31.1 | 49.5 | 34 | 74.9 | 7.27 | 6.76 | 3.42 | 10.1 |
| Ortalama | 108.5 | 159.1 | 36.4 | 48.3 | 40.5 | 76.7 | 7.4 | 7.6 | 2.3 | 4.1 | ||
Tablo 1: Filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numuneler için toplanan değerlerin, standart sapmanın ve varyasyon yüzdesi katsayısının veri tablosu. Kısaltmalar: Cam Lev = kamera seviyesi; Det Thr = algılama eşiği; CV = varyasyon katsayısı; St. Dev. = standart sapma; Conc. = konsantrasyon.
Lipozom örnek sonuçları tespit eşiği (2, 3, 5) ve kamera seviyesi (12, 13, 14) ile ayrıştırıldığında, sonuçlar anlamlı değildi (Şekil 3). Bu bireysel seviyelerin her birinde sadece 3 değerlendirme (n = 3) olduğu belirtilmelidir. Her kamera seviyesindeki bu küçük örneklem boyutu ve algılama eşiği, muhtemelen bireysel karşılaştırmaların önemli olmamasına katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, filtrelenmiş ve filtrelenmemiş örnekler (n = 3) genelinde kamera düzeyine bakılmaksızın algılama eşiği (2, 3, 5) örnekleri değerlendirildiğinde, hem ortalama boyut (Şekil 3A) hem de mod boyutu (Şekil 3B) anlamlı olarak farklıydı (p < 0.05). Buna karşılık, filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numune konsantrasyonları arasındaki farklar (Şekil 3C) anlamlı derecede farklı değildi.
Şekil 3: Kamera seviyesinin ve algılama eşiğinin ölçülen partikül boyutu ve filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numunelerin konsantrasyonu üzerindeki etkileri. Ortalama (A) ve Mod (B) parçacık boyutu kombine kamera seviyeleri 12, 13, 14 olarak tespit eşiği 2'den 3'e 5'e (n = 3) yükseltildi ve filtrelenmiş numunelerin parçacık boyutlarında önemli bir düşüş olduğunu gösterdi. Algılama eşiği 2'den 3'e 5'e yükseltildiği için birleşik kamera seviyeleri 12, 13, 14'teki partikül konsantrasyonları (C), filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numuneler arasında anlamlı bir fark olmadan algılama eşiği arttıkça konsantrasyon düşüşü göstermektedir. Kamera seviyesi 12'den 14'e (n = 3) yükseldikçe, birleşik algılama eşiklerinde ortalama (D) ve Mod (E) parçacık boyutu, filtrelenmiş numunelerin parçacık boyutunda bir azalma olduğunu gösterir. Kamera seviyeleri 12'den 14'e (n = 3) yükseldikçe birleşik algılama eşiklerindeki partikül konsantrasyonları (F), filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numuneler arasında önemli bir fark olmaksızın kamera seviyesi arttıkça konsantrasyon artışı gösterir. Kısaltma: DT = algılama eşiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3 kamera seviyesi (12, 13, 14) algılama eşik düzeyine (n = 3) bakılmaksızın değerlendirildiğinde, filtrelenen örneklerde hem ortalama boyut (Şekil 3D) hem de mod boyutu (Şekil 3E) artmıştır. Kamera seviyesi 12'den 14'e yükseldikçe numune konsantrasyonları artma eğilimi gösterdi (Şekil 3F). Farklı kamera seviyelerinde değerlendirilen filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numune konsantrasyonları arasındaki farklar anlamlı olarak farklı değildi.
Ek Dosya 1: Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanopartiküllerin boyutunu ve konsantrasyonunu tahmin etmek için çeşitli yöntemler vardır11. Bunlar, dinamik ışık saçılması (DLS), santrifüjlü çökeltme ve tek parçacık seviyesi analizi-elektron mikroskobu, NTA, atomik kuvvet mikroskobu ve ayarlanabilir dirençli darbe algılama dahil olmak üzere bir popülasyondan boyut tahmini üreten topluluk yöntemlerini içerir. Bunlardan DLS ve NTA, ideal bir ortamda Brownian hareketine dayanan tahribatsız boyut ve konsantrasyon ölçüm yöntemleridir. DLS, ışığın saçılmasına dayanır ve yoğunluk, parçacık hacminin karesi ile orantılıdır. Bu nedenle, DLS, büyük parçacıkların, agregaların veya polidispers popülasyonların varlığına karşı NTA'dan daha hassastır.
NTA, ardışık video karelerinde ölçülen tek tek parçacıkların yol uzunluğundan difüzyon katsayısını hesaplar. NTA'nın ana sınırlaması, DLS ve diğer ölçüm yöntemlerine kıyasla değerlendirebileceği dar parçacık konsantrasyonu aralığıdır, böylece bireysel parçacık yol uzunlukları mikroskopun kırınım sınırına ve izleme yazılımının yeteneklerine girmelidir. DLS ve NTA, Brownian hareketine bağlı olduğundan, her ikisinin de monodağınık popülasyonlarda iyi bir boyut anlaşması göstermesi beklenebilir; polidispers popülasyonları ve agregaları olanları değerlendirirken farklılaşırlar. İkincisi, DLS'yi işe yaramaz hale getirir ve NTA parçacık boyutu tahminini önemli ölçüdeartırır 12. NTA'nın en iyi bilinen sınırlaması, diğer ölçüm yöntemlerinden çok daha düşük partikül konsantrasyonu (veya daha fazla seyreltme) gerektirmesidir. Buna rağmen, NTA karakterizasyonu nanomalzeme araştırmalarında popülerdir. NTA boyutu ve konsantrasyon tahminleri, kayıt uzunluğu, kamera seviyesi, algılama eşiği ve numune seyreltme dahil olmak üzere tanımlanmış sıcaklık, video yakalama ayarlarının yüksek oranda tekrarlanabilir olması nedeniyle daha seyreltilmiş bir popülasyona bağlı olduğundan, bu makale tekrarlanabilir sonuçlar üretmek için bunları raporlama ihtiyacına odaklanmaktadır.
Bu makale, standartlaştırılmış bir protokol kullanmanın sonuçların çoğaltılmasını sağladığını ve boyut standartları gibi pozitif kontrollerin kullanılmasının makinenin kalibrasyonu hakkında bilgi sağladığını göstermektedir. Ayrıca, bu sonuçlar lazer modül oda sıcaklığının, kamera seviyelerinin, algılama eşiğinin ve filtrasyonun (filtre tipi ve boyutu) raporlanmasının önemini göstermiştir. Buna karşılık, lazer modül oda sıcaklığı, seyreltici ve seyreltme faktörü, doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar için eşit derecede önemlidir. Ne MISEV2018 ne de EV-TRACK özellikle bu bilgilerin dahil edilmesini önermese de, bu ayrıntıların dahil edilmesinin yayınlanan sonuçların bağımsız olarak doğrulanmasını sağlamasını ve deneysel tasarıma sağlamlık katmasını öneriyoruz.
EV analizinde NTA kalibrasyonu için lateks boyutlu kalibrasyon standartlarının kullanılmasının sınırlamaları kabul edilir ve benzer boyuttaki lipit çift katmanlı nanopartiküllere kıyasla bilinen kırılma indisi farklılıklarını içerir. Bu yazıda, lateks boncuklar, ölçümlerden önce makine kalibrasyonunu doğrulamak ve algılama sınırlarını belirlemek için kullanılmamıştır. Lipozomlar, doğal olarak oluşan EV'lerinkine benzer bir zara sahiptir ve kırılma indisi de aynı şekilde EV'leri temsil edecektir. Boyut standartları ve lipozom örnekleri monodispers popülasyonlardır; bu nedenle, boyut dağılımları Gauss veya log-normal dağılımını izleyecektir. Doğal EV'ler polidisperstir ve boyut dağılımları bir güç yasası işlevi13'ü izleyecektir.
Tarihsel olarak, NTA karakterizasyonunu kullanan yayınlar, araştırma sonuçlarını çoğaltmak için gerekli ayrıntıları tutarsız bir şekilde bildirmektedir. NTA verilerini yeniden oluşturma yeteneği, özgün verileri yakalamak için kullanılan ayarları çoğaltma yeteneğine dayanır. Bu bilgi olmadan, NTA kullanarak deneysel sonuçların çoğaltılması son derece zor olacaktır. Belirlenmiş bir protokole sıkı sıkıya bağlı kalınarak ve NTA ile kullanılan ayar parametrelerinin yayınlanmasıyla, sonuçların doğru bir şekilde çoğaltılması sağlanabilir. Aşağıdaki öneriler, bir nanopartikül boyutu analizörü kullanılarak boyut, konsantrasyon, bileşim ve saflığın nanopartikül karakterizasyonunun tutarlılığını artırmak için yapılmıştır.
İlk olarak, lateks boyut standartları gibi uygun boyut standartlarını kullanarak nanopartikül boyutu analizörünün kalibrasyonunu daima kontrol edin. Bu düzenli olarak yapılmalı ve cihaz günlüğüne ve kritik numunelerin analizinden önce kaydedilmelidir. İkinci olarak, lazer modül hazne sıcaklığı, kamera seviyeleri ve algılama eşikleri gibi tüm ayarlanabilir parametreler, kullanılan seyreltmeler ve seyrelticiler gibi Numune Günlüğü dosyasındaki her numune için kaydedilmelidir. Bu parametreler, operatöre bağımlı oldukları ve NTA ölçümlerini etkiledikleri için raporlanmalıdır. Üçüncüsü, numune seyreltme için kullanılan seyrelticilerin nanopartikül içeriği için karakterize edilmesi ve raporlanması gerekir. Tek tek nanopartikül numuneleri için kullanılan seyrelticilerin, seyreltilmiş numune için kullanılanlarla aynı kamera seviyesi ve algılama eşiği ayarları kullanılarak değerlendirilmesi gerekecektir. Dördüncüsü, şırınga filtreleri, üretim sürecinden kalan çok sayıda partikülü temizlemek için veri toplama veya numune hazırlama adımlarından önce ölü alan hacminin iki katı ile yıkanmalıdır. Beşincisi, numune içindeki nanopartiküllerin konsantrasyonu, önerilen optimum 1.0 × 107 ila 1.0 × mL başına 109 içinde ayarlanmalıdır.
Bu çalışmada yukarıda açıklanan sınırlamaları kabul ederek, NTA tarafından elde edilen boyut ve konsantrasyon değerlerinin kamera seviyeleri ve algılama eşikleri gibi NTA parametrelerinden etkilenebileceğini ve konsantrasyonun değil, büyüklüğün numune hazırlamadan etkilenebileceğini gösteriyoruz. Bu, bu parametreleri nanomalzeme ve EV literatüründe raporlamanın kritik önemini eve götürerek, EV kaynağının, izolasyonunun ve diğer deneysel değişkenlerin etkisini sistematik olarak araştırabilmemiz için sağlam, tekrarlanabilir literatürün üretilmesini sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbirinde çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Çalışma, Kansas eyaleti tarafından Midwest Karşılaştırmalı Kök Hücre Biyolojisi Enstitüsü'ne (MICSCB), Johnson Kanser Araştırma Merkezi'nden MLW'ye ve NIH R21AG066488'den LKC'ye desteklendi. OLS, MICSCB'den GRA desteği aldı. Yazarlar, bu projede kullanılan lipozomları sağladığı için Dr. Santosh Aryal'a ve yararlı konuşmalar ve geri bildirimler için Weiss ve Christenson laboratuvarlarının üyelerine teşekkür ediyor. Dr. Hong He'ye teknik destek için teşekkür edilir. MLW, Betti Goren Weiss'a desteği ve danışmanlığı için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Pipetter | |||
| Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| Lens Cleaner | |||
| Lens Paper | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 Laser Module | Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA Software Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| Paper Towels | |||
| Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding | BioExpress | P -3243-200X | |
| Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile | BioExpress | P-3243-1250 | |
| Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg) | Gibco | 14190-144 | |
| Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL) | Malvern | NTA4088 | |
| Standards, Latex Transfer- 50 nm (3 mL) | Malvern | NTA4087 | |
| Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile | Fisher brand | 09-720-004 | |
| Syringe, TB, 1 mL, slip tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| Waste fluid container |
References
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Danaei, M., et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).
- Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
- Malvern analytical Ltd. NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).
- Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly. Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).
- Gollwitzer, C., et al. A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium. Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).
- vander Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
