Recopilación, expansión y diferenciación de modelos primarios de células epiteliales nasales humanas para la cuantificación de la frecuencia de latido de los cilios

Katelin M. Allan; Sharon L. Wong; Laura K. Fawcett; Alexander Capraro; Adam Jaffe; Cristan Herbert; Elvis Pandzic; Shafagh A. Waters

doi:10.3791/63090

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Artículo de método

Recopilación, expansión y diferenciación de modelos primarios de células epiteliales nasales humanas para la cuantificación de la frecuencia de latido de los cilios

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DOI:

10.3791/63090

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10 de noviembre de 2021

Katelin M. Allan¹^,² , Sharon L. Wong¹^,² , Laura K. Fawcett¹^,²^,³ , Alexander Capraro¹^,² , Adam Jaffe¹^,²^,³ , Cristan Herbert⁴ , Elvis Pandzic⁵ , Shafagh A. Waters¹^,²^,³

¹School of Women's and Children's Health, Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, ²Molecular and Integrative Cystic Fibrosis Research Centre (miCF RC), Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, ³Department of Respiratory Medicine, Sydney Children's Hospital, ⁴Department of Pathology, School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, ⁵Katharina Gaus Light Microscopy Facility, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la recolección, expansión y diferenciación de células epiteliales nasales a modelos organotípicos de células epiteliales de las vías respiratorias y la cuantificación de la frecuencia de latidos de los cilios a través de imágenes de células vivas y guiones personalizados.

Resumen

Las mediciones de la función de los cilios (frecuencia de latido, patrón) se han establecido como herramientas de diagnóstico para enfermedades respiratorias como la discinesia ciliar primaria. Sin embargo, la aplicación más amplia de estas técnicas está limitada por la extrema susceptibilidad de la función ciliar a los cambios en los factores ambientales, por ejemplo, temperatura, humedad y pH. En las vías respiratorias de los pacientes con fibrosis quística (FQ), la acumulación de moco impide el latido de los cilios. La función de los cilios se ha investigado en modelos de células primarias de las vías respiratorias como un indicador de la actividad del canal CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR). Sin embargo, se ha encontrado una considerable variabilidad de paciente a paciente en la frecuencia de latidos de los cilios en respuesta a los fármacos moduladores de CFTR, incluso para pacientes con las mismas mutaciones de CFTR . Además, el impacto de la secreción disfuncional de cloruro regulada por CFTR en la función ciliar es poco conocido. Actualmente no existe un protocolo integral que demuestre la preparación de muestras de modelos de vías respiratorias in vitro , la adquisición de imágenes y el análisis de la frecuencia de latido de los cilios (CBF). Las condiciones de cultivo estandarizadas y la adquisición de imágenes realizadas en una condición ambientalmente controlada permitirían una cuantificación consistente y reproducible de CBF entre individuos y en respuesta a fármacos moduladores de CFTR. Este protocolo describe la cuantificación de CBF en tres sistemas diferentes de modelos de células epiteliales de las vías respiratorias: 1) láminas epiteliales nativas, 2) modelos de interfaz aire-líquido fotografiados en insertos de soporte permeables y 3) organoides tridimensionales incrustados en matriz extracelular. Los dos últimos replican la fisiología pulmonar in vivo , con cilios batidos y producción de moco. La función ciliar se captura utilizando una cámara de vídeo de alta velocidad en una cámara controlada por el entorno. Se utilizan scripts personalizados para el análisis de CBF. Se prevé que la traducción de las mediciones de CBF a la clínica sea una herramienta clínica importante para predecir la respuesta a los fármacos moduladores de CFTR por paciente.

Introducción

Las mediciones de la frecuencia de latido de los cilios (CBF) y el patrón se han establecido como herramientas de diagnóstico para enfermedades respiratorias como la discinesia ciliar primaria (PCD)¹. En la fibrosis quística (FQ), la disfunción del canal de cloruro del regulador de conductancia transmembrana (CFTR) de la FQ causa deshidratación del líquido de la superficie de las vías respiratorias y alteración del aclaramiento mucociliar². La función ciliar ha sido investigada in vitro en modelos de células primarias de la vía aérea como indicador de la actividad del canal CFTR³. Sin emb....