Summary
We beschrijven de intraparenchymale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen getransduceerd met een dual reporter vector die luciferase-groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen van muizen tot expressie brengt. Na transplantatie wordt het luciferasesignaal herhaaldelijk gemeten met behulp van in vivo bioluminescentie en GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd in hersensecties met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Abstract
Celtherapie is al lang een opkomend behandelingsparadigma in de experimentele neurobiologie. Celtransplantatiestudies zijn echter vaak gebaseerd op eindpuntmetingen en kunnen daarom slechts in beperkte mate longitudinale veranderingen van celmigratie en overleving evalueren. Dit artikel biedt een betrouwbaar, minimaal invasief protocol voor het transplanteren en longitudinaal volgen van neurale voorlopercellen (NPC's) in het volwassen muizenbrein. Vóór transplantatie worden cellen getransduceerd met een lentivirale vector bestaande uit een bioluminescente (firefly-luciferase) en fluorescerende (groen fluorescerend eiwit [GFP]) reporter. De NPC's worden getransplanteerd in de rechter corticale hemisfeer met behulp van stereotaxische injecties in de sensomotorische cortex. Na transplantatie werden getransplanteerde cellen gedetecteerd door de intacte schedel gedurende maximaal vijf weken (op dag 0, 3, 14, 21, 35) met een resolutielimiet van 6.000 cellen met behulp van in vivo bioluminescentie beeldvorming. Vervolgens worden de getransplanteerde cellen geïdentificeerd in histologische hersensecties en verder gekarakteriseerd met immunofluorescentie. Dit protocol biedt dus een waardevol hulpmiddel om cellen in het muizenbrein te transplanteren, te volgen, te kwantificeren en te karakteriseren.
Introduction
Het zoogdierbrein heeft beperkte regeneratieve capaciteiten na letsel of ziekte, waardoor innovatieve strategieën nodig zijn om weefsel- en functioneel herstel te bevorderen. Preklinische strategieën richten zich op verschillende aspecten van hersenregeneratie, waaronder neuroprotectie, neurogenese, angiogenese 1,2, bloed-hersenbarrièreherstel 3,4 of celtherapie 5,6. Celtherapie heeft het voordeel dat het veel van deze pro-reparatieprocessen tegelijkertijd kan bevorderen. In experimenten met transplantatie van cellen heeft weefselherstel plaatsgevonden door (1) directe celvervanging en (2) productie van cytokines die leiden tot angiogenese en neurogenese7. Recente ontwikkelingen in stamceltechnologie hebben de ontwikkeling van schaalbare, goed gekarakteriseerde neurale celbronnen die nu in de pijplijn zitten voor klinische onderzoeken verder vergemakkelijkt (beoordeeld in 7,8,9). Hoewel celtherapieën het klinische stadium hebben bereikt voor een paar neurologische ziekten (bijv. De ziekte van Parkinson10, beroerte11 en dwarslaesie12), is hun werkzaamheid variabel geweest en is meer preklinisch onderzoek nodig om de mechanismen van graft-host interacties te begrijpen.
Een belangrijke beperking van veel preklinische studies is het continu volgen van de getransplanteerde cellen in de gastheer. Vaak worden alleen eindpuntmetingen uitgevoerd, waarbij de dynamische migratie- en overlevingsprocessen in de gastheerworden weggelaten 6,13. Deze beperkingen resulteren in de slechte karakterisering van de getransplanteerde cellen en vereisen hoge dieraantallen om longitudinale veranderingen te begrijpen. Om deze beperkingen te overwinnen, transduceren we in deze studie geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide neurale voorlopercellen met een commercieel verkrijgbare dual-reporter lentivirale vector bestaande uit rode vuurvlieg luciferase en verbeterd groen fluorescerend eiwit (rFluc-eGFP). Deze cellen worden getransplanteerd via stereotaxische intraparenchymale injectie in de hersenen van de muis en worden longitudinaal gevolgd met behulp van in vivo bioluminescentie beeldvorming gedurende 5 weken. Na het verzamelen van hersenweefsel worden de GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd en verder gekarakteriseerd in histologische hersensecties. Deze methode kan soepel worden aangepast aan alternatieve transduceerbare celbronnen en transplantatieroutes voor in vivo toepassingen in het knaagdierbrein. Over het algemeen is de procedure waardevol om longitudinale informatie te verkrijgen over de overleving en migratie van transplantaten in de hersenen van de muis en vergemakkelijkt de daaropvolgende histologische karakterisering.
Protocol
OPMERKING: Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de overheid, instellingen en ARRIVE en werden goedgekeurd door het Kantonaal Veterinair Bureau van Zürich. Volwassen mannelijke en vrouwelijke niet-obese diabetische SCID gamma (NSG) muizen (10-14 weken, 25-35 g) werden gebruikt. Muizen werden gehuisvest in reguliere Type II/III kooien in groepen van ten minste twee dieren per kooi in een vochtigheids- en temperatuurgecontroleerde ruimte met een constante 12/12 uur licht/donker cyclus. .).
1. Celkweek en virale transductie
- Differentieer neurale voorlopercellen (NPC's) van iPSC's met behulp van kleine molecuulremmers zoals eerder beschreven14.
- Kweek NPC's15 vanaf passage 2 in Neural Stem cell Maintenance Medium (NSMM; Tabel 1) aangevuld met kleine moleculen (tabel 1) in 6-putplaten (2 ml medium per put) gecoat met poly-ornithine/laminine521 (pLO/L521). Verander het medium dagelijks.
OPMERKING: Om NPC's te passeren, voegt u 1 ml celdissociatiereagens per put toe (zie de tabel met materialen) en incubeert u gedurende 1 minuut bij 37 °C totdat de meeste cellen loskomen.- Incubeer voor coating 150 μL pLO in 1 ml van 0,1 M fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS) per put gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT). Na drie wasbeurten met PBS, incubeer 10 μg L521 in 1 ml PBS per put gedurende 2 uur bij RT.
- Voor virale transductie, plaats 50.000 cellen per put in een 24-well plaat bedekt met pLO / L521 en voeg voorverpakte virale vectoren (pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro, LL410PA-1) toe aan elke put.
OPMERKING: De totale geleverde infectieuze eenheden (IFU) zijn >2 × 106 IFU en zijn voldoende om 100.000 cellen te infecteren bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 20. Het tellen van cellen is uitgevoerd met een geautomatiseerde celteller. De transductie-efficiëntie is sterk afhankelijk van de gebruikte cellijn. Werken met lentivirus vereist naleving van de lokale richtlijnen voor bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) producten. - Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 72 uur, terwijl de dagelijkse mediumveranderingen worden voortgezet.
- Bevestig succesvolle transductie door de cellen te controleren op GFP-expressie in een fluorescentiemicroscoop. Stel de microscoopvergroting in op 10x of 20x en gebruik de juiste excitatie (460-480 nm) en emissiebereik (490-520 nm) om getransduceerde GFP-expresserende cellen te detecteren.
- Kwantificeer de verhouding tussen GFP-getransduceerde en totale cellen om de algemene transductie-werkzaamheid te schatten.
OPMERKING: Transductiesnelheden van 65-95% werden bereikt met dit protocol. Een transductie-werkzaamheid van >50% wordt aanbevolen als een go/no-go-criterium vóór de transplantatie. Als 50% transductie-werkzaamheid niet kan worden bereikt, voer dan puromycineselectie uit of sorteer de cellen met behulp van flowcytometrie om de opbrengst van getransduceerde cellen te verhogen. - Optioneel: Invriezen van cellen
- Draai de cellen naar beneden (300 × g, 5 min) en gooi het supernatant weg. Resuspend de pellet in 1 ml vriesmedium (zie de tabel met materialen) en breng de suspensie over in injectieflacons om 106 cellen/injectieflacon te verkrijgen. Breng de cellen gedurende 24 uur over in vriesdozen bij -80 °C en vervolgens op -150 °C voor langdurige opslag.
2. Celvoorbereiding voor transplantatie
- Verzamel een injectieflacon met cellen uit -150 °C opslag en breng deze over naar het laboratorium. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller.
OPMERKING: De injectieflacon bevat 1,5-2 × 106 cellen. - Breng de injectieflacon snel over in een waterbad van 37 °C totdat er geen ijskristallen achterblijven (2-3 min).
OPMERKING: Het is belangrijk om snel te ontdooien om eventuele schade aan celmembranen te minimaliseren. Dompel de injectieflacon niet volledig onder in het waterbad, omdat dit het risico op besmetting kan verhogen. - Breng de injectieflacon over naar de bioveiligheidskast en pipetteer de hele inhoud (~ 1 ml) in een steriele conische buis van 15 ml.
OPMERKING: Werken met lentiviraal getransduceerde cellen vereist BSL-2. Wassende en passerende cellen verwijderen echter virale deeltjes uit het medium. Informatie over wanneer een overdracht van BSL-2 naar BSL-1 is toegestaan, moet worden verkregen bij de lokale autoriteiten. - Voeg 9 ml steriele 1x PBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g, RT.
- Verwijder het supernatant door aspiratie met behulp van een pipet (1-10 ml); kantel de ophanging voorzichtig naar de pipetpunt en begin met aspirateren. Pas op dat u de pellet niet verstoort.
- Was de cellen door ze opnieuw te verdelen in 10 ml steriele 1x PBS.
OPMERKING: Plak de buis voorzichtig om cellen in het resterende volume te resuspenderen. Trituraleer de celsuspensie langzaam met behulp van een pipet van 1 ml totdat deze geen klonten of aggregaten bevat. - Tel de cellen voor de laatste spin met behulp van een geautomatiseerde celteller.
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 × g, RT.
- Verwijder het supernatant (stap 2.5) en suspend de celkorrel in het vereiste volume steriel PBS tot een concentratie van 8 × 104 cellen/μL. Plaats de cellen op ijs en gebruik ze voor transplantatie binnen de volgende 5 uur.
OPMERKING: In dit protocol werd een volume van 1,6 × 105 cellen/2 μL PBS gebruikt.
3. Transplantatieprocedure
- Voorbereiding op een operatie
- Reinig en steriliseer de operatieapparatuur.
- Bereid het stereotaxische apparaat en het micro-injectiepompsysteem voor.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de Hamilton-spuit en de naald van 30 G, 2 inch te testen voordat u begint. Steek de naald in een buis met steriele 0,9% NaCl en trek de oplossing langzaam in en uit. - Stel het anesthesieapparaat in. Test de machine voordat u dieren erbij betrekt. Reinig de inductiekamer met 70% ethanol.
- Voorbereiding van dieren
- Houd de muizen minstens 7 dagen voorafgaand aan de experimenten in standaardomstandigheden om ze te laten acclimatiseren.
OPMERKING: De volgende dieren werden gebruikt voor dit protocol: vrouwelijke NOD / SCID / IL2rγnull (30-35 g, ook bekend als NSG) en vrouwelijke C57BL / 6J (20-25 g, ook bekend als B6). De procedure kan ook worden uitgevoerd met mannelijke muizen. - Meet het lichaamsgewicht van de muis en pas de dosis van de in te spuiten pijnstiller aan. Dien carprofen (5 mg/kg lichaamsgewicht) intraperitoneaal toe om pijn te verminderen en/of een ontstekingsreactie te voorkomen.
- Anesthetiseer de dieren met isofluraan (3% in de inductiefase en 1,5-2% in de onderhoudsfase tijdens de operatie) verdampt in zuurstof.
OPMERKING: Gasvormige anesthesie heeft de voorkeur vanwege een snelle wake-up na de chirurgische ingreep en omdat de niveaus van anesthetisch gas gemakkelijk kunnen worden aangepast. - Gebruik nociceptieve reflexen om ervoor te zorgen dat het dier diep wordt verdoofd (bijv. Teen knijpen). Wanneer diepe anesthesie is bereikt, transporteert u het dier van de inductiekamer naar het stereotaxische frame. Zorg voor anesthesie met behulp van een gezichtsmasker.
OPMERKING: De ademhalingsfrequentie moet gedurende de hele procedure visueel worden gecontroleerd (40-60 ademhalingen per minuut). Gebruik een opwarmkussen om onderkoeling tijdens de procedure te voorkomen. - Breng oogheelkundig glijmiddel aan om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
- Scheer de hoofdhuid van de muis met een elektrisch scheermes en desinfecteer de huid met 5% betadine-oplossing met wattenstaafjes.
- Zet de muiskop vast en steek de oorstaven in de externe meatus.
OPMERKING: Pas op dat u de trommelvliezen niet beschadigt. Breng lidocaïnezalf aan op beide gehoorgangen voordat u de oorstaven inbrengt. Om te controleren of het hoofd van het dier zich in een stabiele positie bevindt, duwt u voorzichtig op het hoofd om te zien of er beweging is. Als beweging wordt opgemerkt, zijn de oorbalk, de plaatsing van het neusstuk of beide onjuist en moeten ze opnieuw worden aangepast.
- Houd de muizen minstens 7 dagen voorafgaand aan de experimenten in standaardomstandigheden om ze te laten acclimatiseren.
- Craniotomie
- Gebruik een chirurgisch mes om een snee langs de middellijn te maken die groot genoeg is om de lambda- en bregma-oriëntatiepunten te onthullen.
OPMERKING: Oprolmechanismen voor de huid kunnen worden aangebracht om de schedel bloot te houden. - Trek het botvlies en de fascia terug met een scalpel en gebruik steriele wattenstaafjes om het schedeloppervlak te drogen.
- Pas de oor- en mondbalken aan om de hoofdpositie te standaardiseren.
OPMERKING: De verticale coördinaten voor bregma en lambda moeten identiek zijn voor anteroposterior positionering. - Plaats de naald op de bregma en bereken de coördinaten van de gewenste injectiepunten (de coördinaten van belang gekozen voor dit protocol: anterior-posterior (AP): + 0,5 mm, mediaal-lateraal (ML): + 1,5 mm). Beweeg de naald naar dat punt en markeer deze met inkt.
OPMERKING: De coördinaten zijn gekozen op basis van de Franklin en Paxinos Mouse Brain Atlas 16. Afstanden zijn mm vanaf de bregma. - Breng steriele 0,9% NaCl aan op de schedel en boor een gat met een diameter van 2-3 mm door de schedel met een chirurgische, tandheelkundige boor.
- Verplaats de naald naar het oppervlak van de dura en bereken de dieptecoördinaten.
- Gebruik een chirurgisch mes om een snee langs de middellijn te maken die groot genoeg is om de lambda- en bregma-oriëntatiepunten te onthullen.
- Transplantatie procedure
- Resuspend de cellen in de buis (stap 2.9) en zuig 2 μL celsuspensie in een spuit (5 μL of 10 μL).
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de celsuspensie. De spuit moet in een horizontale positie worden gehouden totdat deze in het stereotactische apparaat is gemonteerd om celbezinking te voorkomen. - Plaats de spuit boven de doelplaats (berekende coördinaten: AP: + 0,5 mm, ML: + 1,5 mm) en beweeg de naald langzaam naar het oppervlak van de dura.
OPMERKING: Als u niet zeker bent van de juiste coördinaten, voer dan injecties uit met een kleurstof en histologische evaluatie van de injectieplaats voordat u cellen transplanteert (zie 17 voor meer informatie). - Leid de naald met een snelheid van 0,02 mm /s in de hersenen tot de juiste diepte (de coördinaat die voor dit protocol is gekozen, is dorsaal-ventraal (DV) - 0,8 mm). Schiet de diepte met 0,1 mm en trek de naald over dezelfde afstand terug om een zak voor de geïnjecteerde cellen te creëren.
- Breng weefsellijm aan rond de naald met een tang om lekkage van cellen te voorkomen.
- Injecteer 2 μL van de bereide celsuspensie met een constante snelheid van 3-5 nL/s.
OPMERKING: De injectieprocedure duurt tussen de 7 en 12 minuten. - Laat de naald na de injectie minstens 5 minuten op zijn plaats voordat u deze langzaam terugtrekt. Breng weefsellijm aan om het gat in de schedel af te dichten en wacht nog eens 2 minuten.
- Resuspend de cellen in de buis (stap 2.9) en zuig 2 μL celsuspensie in een spuit (5 μL of 10 μL).
- Hechtingen en nazorg
- Breng steriele 0,9% NaCl-oplossing aan op de blootgestelde schedel om uitdroging te voorkomen.
- Sluit de wond met een 5/0 zijden hechtdraad.
- Hydrateer het dier met 0,5 ml ringerlactaatoplossing die subcutaan in de onderrug wordt geïnjecteerd.
- Onderbreek de anesthesietoediening en verwijder de muis voorzichtig uit het stereotaxische apparaat en plaats deze terug in een kooi op een verwarmingskussen.
- Monitor de dieren tijdens de acute fase na de verwonding. Controleer de hechting, het gewicht van het dier en de algehele gezondheid minstens twee keer per dag.
4. In vivo beeldvorming
- Bereiding van luciferine
- Ontdooi D-luciferine kaliumzout bij RT en bereid een verse bouillon-oplossing van D-luciferine op 30 mg / ml in PBS.
- Steriliseer de stamoplossing door een spuitfilter van 0,22 μm.
OPMERKING: Onmiddellijk gebruik van de werkoplossing wordt aanbevolen. Indien nodig kan opgelost luciferine worden bewaard bij -20 °C. Langdurige opslag kan echter leiden tot degradatie van het signaal. Luciferine is een lichtgevoelig reagens; houd het waar mogelijk uit direct licht. Alternatieve substraten kunnen ook worden overwogen, bijvoorbeeld cycluc, om de resolutielimiet18 te verbeteren.
- Beeldvorming
- Eerste installatie
OPMERKING: Bioluminescentiebeeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (zie de tabel met materialen) bestaande uit een donkere kamer en een ccd-camera (gekoeld charge-coupled device).- Dubbelklik op het softwarepictogram van Living Image en selecteer een gebruikers-ID in de vervolgkeuzelijst.
- Klik op Initialiseren in het configuratiescherm dat wordt weergegeven. Zodra het initialisatieproces is voltooid, wordt de temperatuurbox in het bedieningspaneel groen.
- Schakel in het configuratiescherm de selectievakjes Luminescent en Photograph in en selecteer Automatische belichting (~60 s). Selecteer een gezichtsveld (D/12,5 cm is gekozen voor dit protocol). Voer de hoogte van het onderwerp (1,5 cm) in en selecteer de optie Voor het gebruik van de hoogte van het onderwerp . Stel handmatig de volgende parameters in: grote binning, f/2, geblokkeerd excitatiefilter en open emissiefilter.
- Bepaal de injectiehoeveelheid D-luciferine bij 300 mg/kg lichaamsgewicht. OPMERKING: De standaard aanbevolen dosis is 150 mg / kg D-luciferine. Deze procedure werd aangepast volgens een protocol dat een hogere gevoeligheid rapporteerde met 300 mg/kg18.
- Injecteer de luciferine intraperitoneaal (i.p.).
OPMERKING: Als het dier vóór de injectie moet worden verdoofd, moet u er rekening mee houden dat dit de piekmoment van luciferase-expressie kan verlengen. - Wacht 5 minuten en verdoof de dieren vervolgens met een continue toevoer van isofluraan (4,5% in de inductiefase en 1,5-2% in de onderhoudsfase tijdens de beeldvormingsprocedure).
- Breng oogheelkundig glijmiddel aan op de ogen en scheer vervolgens de verdoofde dieren op het hoofdgebied met behulp van een conventioneel scheerapparaat. Plaats de dieren in de beeldvormingskamer en begin 15 minuten na de luciferinininjectie met beeldvorming door in het bedieningspaneel op Verwerven te klikken.
- Eerste installatie
5. Perfusie
- Verdoof de dieren door een o.a. injectie van natriumpentobarbital (150 mg/kg lichaamsgewicht). Wacht tot de muis niet meer reageert op pijnlijke prikkels, zoals teenknijpen.
- Leg de muis op zijn rug en gebruik een pincet en schaar om de borstholte te openen.
- Gebruik een standaard schaar om het diafragma te openen.
- Stel het hart bloot en steek een naald (uit de slang met ringer/4% paraformaldehyde-oplossing (PFA)) in de top van de linker ventrikel.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de punt van de naald in het lumen van de ventrikel houdt. - Knip de rechter ventrikel met een schaar.
- Perfuseer met ringeroplossing (kan worden bewaard bij RT) gedurende 3-4 minuten (debiet: 17 ml / min). Ga door totdat het hart schoon is.
- Schakel de stopkraan om de stroom van PFA mogelijk te maken (bewaren bij 4 °C; op ijs houden tijdens de procedure) en nog eens 5 minuten (~ 100 ml) doorlaten.
- Stop de pomp en verwijder de naald uit de linker ventrikel.
OPMERKING: De perfusie met PFA behoudt de weefselintegriteit uniform. Het vergemakkelijkt ook het behoud van GFP-signaal in de transplantaties dat anders verloren kan gaan als gevolg van diffusie.
6. Verwerking
- Weefselverzameling
- Verwijder het hoofd met een standaard schaar en maak een middellijnincisie in de huid.
- Draai de huid over de ogen om de schedel bloot te leggen.
- Begin bij het caudale deel op het punt van het pariëtale bot en maak een kleine incisie met behulp van een veerschaar. Schuif de schaar langs de midsagittale hechting tot een punt tussen de ogen. Begin opnieuw vanaf het caudale deel en maak twee sneden parallel en ~ 4 mm uit elkaar in het sagittale vlak.
OPMERKING: Pas op dat u de hersenen niet beschadigt door de schaar tegen het binnenoppervlak van de schedel te drukken. - Gebruik een tang om voorzichtig een kant van het pariëtale bot te kantelen en af te breken. Doe hetzelfde met de andere kant.
OPMERKING: Gebruik een microspatula om het bot te bevrijden van de hersenvliezen; anders kunnen ze de hersenen beschadigen terwijl ze de schedel afbreken. Als er delen van het voorste bot achterblijven, maak dan een kleine snede om de botplaat te kantelen en af te breken. - Om de hersenen vrij te maken, schuift u de microspatula voorzichtig onder de hersenen (olfactorische bollen) en kantelt u deze voorzichtig naar boven.
- Houd na het verzamelen de hersenen gedurende 4-6 uur bij 4 °C in 4% PFA-oplossing. Breng het daarna over op steriele 1x PBS.
- Immunohistochemie
- Breng de hersenen over op een 30% sucrose-oplossing gedurende ten minste 48 uur bij 4 °C om de vorming van kristallen tijdens het invriezen te voorkomen.
- Gebruik een glijdende microtoom om coronale secties met een dikte van 40 μm te snijden. Verzamel en bewaar de secties als vrij zwevende secties (in een 24-well-plaat) in een cryoprotectieve oplossing (tabel 1) bij -20 °C tot verdere verwerking.
- Spoel de secties af met 450 μL van 1x PBS voor elke put (3 keer, 5 min elk, RT).
- Blokkeer niet-specifieke locaties met 450 μL blokkeringsoplossing voor elke put (tabel 1) gedurende 1 uur bij RT.
- Incubeer elke put met 450 μL primaire antilichamen bij 4 °C 's nachts. Verdun de antilichamen 1:200 in 3% ezelserum; 0,1% Triton-X-100 in PBS. Om donormateriaal in de gastheeromgeving te identificeren, gebruikt u een antilichaam tegen mensspecifieke kernen (Anti-Human Nuclei Antibody, kloon 235-1).
- Was de secties met 450 μL van 1x PBS voor elke put (3 keer, 5 min elk, RT).
- Incubeer elke put met 450 μL overeenkomstige fluorescerende secundaire antilichamen gedurende 2-3 uur (RT). Verdun de antilichamen in 3% ezelserum; 0,1% Triton-X-100 in 1x PBS.
- Was de secties met 450 μL van 1x PBS voor elke put (3 keer, 5 min elk, RT).
- Kleur de kernen met 450 μL 0,1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI).
Representative Results
We streven ernaar om getransplanteerde neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis longitudinaal te volgen met behulp van in vivo bioluminescentiebeeldvorming en de getransplanteerde cellen te identificeren in daaropvolgende histologische analyse (figuur 1A). Daarom worden neurale voorlopercellen getransduceerd met een lentivirale vector bestaande uit EF1α-rFluc-eGFP. Vóór de transplantatie werden cellen getest op succesvolle transductie door expressie van eGFP in vitro (figuur 1B). De succesvol getransduceerde cellen werden stereotiep getransplanteerd in de muizenhersenen op de gewenste coördinaten (bijvoorbeeld in de sensomotorische cortex). Na transplantatie werden de muizen systemisch geïnjecteerd met D-luciferine, het substraat voor rFluc, en werden signaalintensiteiten van de getransplanteerde cellen gemeten om een succesvolle transplantatie te bevestigen (figuur 1C).
Om de detectiegrens van de in vivo bioluminescentiebeeldvorming te evalueren, werd een bereik van 6.000-180.000 cellen getransplanteerd in de rechter sensomotorische cortex van de muis (figuur 2A). We detecteerden <6.000 cellen en een bioluminescentiesignaal dat evenredig is met het aantal getransplanteerde cellen direct na transplantatie (figuur 2B). Omdat menselijke celbronnen immunogeen zijn voor immunocompetente muizen, werden NOD scid gamma (NSG) immunodeficiënte muizen gebruikt om de overleving op lange termijn van de celtransplantaten te observeren. Overleving op lange termijn en detectie van een bioluminescentiesignaal gedurende maximaal 5 weken werden bevestigd na celtransplantatie (figuur 2C,D). De getransplanteerde cellen werden met succes ex vivo gedetecteerd in een daaropvolgende histologische analyse via de eGFP-reporter en immunostaining met anti-menselijke kernen en anti-menselijke mitochondriale antilichamen (figuur 2E).
Figuur 1: Transplantatie van neurale voorlopercellen. (A) Schematisch overzicht van generatie en transplantatie van rFluc-eGFP NPC's. (B) Representatief immunofluorescentiebeeld van getransduceerde NPC's (GFP-reporter, groen) tellers gekleurd met DAPI (blauw); schaalstaven = 5 μm. (C) In vivo detectie van bioluminescentiesignaal in getransplanteerde cellen; color bar = blue (0, min, no signal), red (4 flux, p/s × 105, max signal) Afkortingen: NPC's = neurale voorlopercellen; GFP = groen fluorescerend eiwit; rFluc-eGFP = rode vuurvlieg luciferase en verrijkt groen fluorescerend eiwit; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; p/s = fotonen/s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Tijdsverloop van getransplanteerde cellen. (A) Schematische weergave van celnummers voor transplantatie. (B) Detectiegrens van getransplanteerde cellen 1 uur na transplantatie. (C, D) Tijdsverloop van transplantatie (180.000 cellen) gedurende maximaal 35 dagen bij NSG-muizen; kleurenbalk = blauw (0, min, geen signaal), rood (4 flux, p/s × 105, max signaal) Gegevens zijn gemiddeld ± SEM (n = 3). (E) Representatieve fluorescentiebeelden van histologische secties en getransplanteerde cellen 5 weken na transplantatie. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: D = dag na transplantatie; NSG = immunodeficiënt NOD scid gamma; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; GFP = groen fluorescerend eiwit; HuNu = Anti-Human Nuclei Antibody, kloon 235-1; p/s = fotonen/s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het regenereren van de gewonde hersenen om functioneel herstel mogelijk te maken, blijft een onvervulde uitdaging. Veel innovatieve preklinische benaderingen zijn geëvolueerd gericht op bijvoorbeeld immuunmodulatie19,20, angiogenese 1,21,22,23, bloed-hersenbarrière-integriteit 2,3,24,25 en celvervanging 5,26 . Vooral in de afgelopen jaren zijn celgebaseerde therapieën naar voren gekomen als een veelbelovende behandelingsstrategie voor de hersenen vanwege grote vooruitgang in stamceltechnologie en efficiënte differentiatieprotocollen15,28. Dit artikel biedt een waardevol protocol voor het transplanteren en volgen van neurale cellen in het muizenbrein. De methode is toepasbaar voor alle transduceerbare cellijnen voor in vivo toepassingen in het muizenbrein.
De gepresenteerde opstelling maakt gebruik van transplantaties van menselijke oorsprong in een muis. Deze transplantaties zijn op de lange termijn niet levensvatbaar bij immunocompetente wild-type muizen vanwege immunogeniciteit. Vandaar dat immunodeficiënte NSG-muizen werden gebruikt om deze beperking te overwinnen. Als alternatief kan het gebruik van muistransplantaties de voorkeur krijgen om de immunogene aspecten te overwinnen. Als transplantatie van menselijke cellen nodig is, vormen gehumaniseerde muismodellen een opkomend alternatief om de kans op transplantaatafstoting te verminderen29.
Een commerciële dual-reporter virale vector bestaande uit firefly luciferase en eGFP onder de EF1α promotor werd gebruikt om de transplantaties te visualiseren. Deze promotor werd geselecteerd om een hoge signaalintensiteit15 te bereiken. Afgezien van NPC's is echter aangetoond dat andere celtypen de hersenfunctie na letsel bevorderen, waaronder pericyten30 en astrocyten31; vandaar dat, afhankelijk van de gebruikte cellijn, andere promotors meer geschikt kunnen zijn om hoge expressieniveaus te bereiken. Bovendien kan het gebruik van transgene promotors, zoals CMV, leiden tot downregulatie, vooral in langetermijnexperimenten32. De transductie-efficiëntie van de lentivirale vector is sterk afhankelijk van de gebruikte cellijn en kan variëren tussen afzonderlijke experimenten. Daarom moet de transductie-efficiëntie worden geëvalueerd voordat met de in vivo experimenten wordt begonnen en om variaties in transductie-werkzaamheid tussen experimenten te corrigeren. Het hersengebied van transplantatie beïnvloedt ook de signaalsterkte. Hoewel een detectielimiet van < 6.000 cellen werd bereikt voor corticale transplantaties, kan het zijn dat er meer cellen nodig zijn om een signaal te detecteren in diepere hersengebieden, bijvoorbeeld striatum of hippocampus.
Transplantatievolumes in de hersenen van de muis zijn beperkt tot 1-2 μL. Daarom is het belangrijk om een geschikt celnummer voor de experimenten te identificeren. Eerder is waargenomen dat toenemende celaantallen leiden tot een verminderde overlevingskans, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van beperkte beschikbaarheid van voedingsstoffen en zuurstof in het gebied van transplantatie33. In vivo bioluminescentie beeldvorming biedt een relatief lage ruimtelijke resolutie in vergelijking met andere in vivo beeldvormingsmethoden zoals MRI of CT. Daarom kunnen korte migratieroutes van getransplanteerde cellen alleen betrouwbaar worden beoordeeld in de daaropvolgende post-hocanalyse .
De absolute signaalsterkte van de bioluminescentie is over het algemeen evenredig met het getransplanteerde celnummer. De signaalsterkte kan echter worden verminderd als grafts worden getransplanteerd in diepere hersenstructuren of als de signaalsterkte buiten het lineaire detectiespectrum van het in vivo beeldvormingssysteem ligt. Momenteel worden nieuwe substraten ontwikkeld om te zorgen voor een efficiëntere penetratie over de bloed-hersenbarrière dan D-luciferine, inclusief cycluc1. Deze substraten kunnen de detectiegrens van de getransplanteerde cellen in de toekomst verder verbeteren18. Over het algemeen maakt dit protocol een eenvoudige, minimaal invasieve procedure mogelijk om grafts in de hersenen van de muis te transplanteren en te observeren.
Disclosures
De auteurs hebben geen potentiële belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De auteurs RR en CT erkennen de steun van de Mäxi Foundation en het 3R Competence Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral Transduction | |||
| pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
| Consumables | |||
| Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
| Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
| Microscope cover slips | Product of choice | ||
| Microscope slides | Product of choice | ||
| Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
| Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
| Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
| Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
| Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
| Equipment | |||
| Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Heating pad | Product of choice | ||
| High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
| In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
| Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
| Microtome | Leica | HM430 | |
| NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
| Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
| Pharmaceuticals and Reagents | |||
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
| Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
| B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
| Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
| CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
| Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
| DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
| Donkey serum | Product of choice | ||
| Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ethanol; 70% | Product of choice | ||
| FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
| hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
| Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
| Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
| N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
| Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
| Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
| Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
| SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
| Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |
References
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Rust, R., et al. Anti-Nogo-A antibodies prevent vascular leakage and act as pro-angiogenic factors following stroke. Scientific Reports. 9 (1), 20040 (2019).
- Weber, R. Z., et al. Characterization of the blood brain barrier disruption in the photothrombotic stroke model. Frontiers in Physiology. 11, 58226 (2020).
- Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews. Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
- Wang, Y., et al. 3K3A-APC stimulates post-ischemic neuronal repair by human neural stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (9), 1050-1055 (2016).
- Llorente, I. L., et al. Patient-derived glial enriched progenitors repair functional deficits due to white matter stroke and vascular dementia in rodents. Science Translational Medicine. 13 (590), (2021).
- Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized brain cells for stroke patients using pluripotent stem cells. Stroke. 49 (5), 1091-1098 (2018).
- Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).
- Galgano, M., et al. Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors. Cell Transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).
- Schweitzer, J. S., et al. Personalized iPSC-derived dopamine progenitor cells for Parkinson's disease. The New England Journal of Medicine. 382 (20), 1926-1932 (2020).
- Muir, K. W., et al. Intracerebral implantation of human neural stem cells and motor recovery after stroke: multicentre prospective single-arm study (PISCES-2). Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 91 (4), 396-401 (2020).
- Kawabori, M., et al. Cell therapy for chronic TBI: interim analysis of the randomized controlled STEMTRA trial. Neurology. 96 (8), 1202-1214 (2021).
- George, P. M., et al. Engineered stem cell mimics to enhance stroke recovery. Biomaterials. 178, 63-72 (2018).
- Sancho-Martinez, I., et al. Establishment of human iPSC-based models for the study and targeting of glioma initiating cells. Nature Communications. 7 (1), 1-14 (2016).
- Rust, R., et al. Xeno-free induced pluripotent stem cell-derived neural progenitor cells for in vivo applications. bioRxiv. , (2022).
- Franklin, K., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's the Mouse brain in stereotaxic coordinates, compact: The coronal plates and diagrams. , Academic Press. (2019).
- Baker, S., Götz, J. A local insult of okadaic acid in wild-type mice induces tau phosphorylation and protein aggregation in anatomically distinct brain regions. Acta Neuropathologica Communications. 4, 32 (2016).
- Cao, J., et al. In vivo optical imaging of myelination events in a myelin basic protein promoter-driven luciferase transgenic mouse model. ASN Neuro. 10, (2018).
- Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: an optimized protocol for brain studies. PLoS One. 8 (2), 55662 (2013).
- Roth, S., et al. Brain-released alarmins and stress response synergize in accelerating atherosclerosis progression after stroke. Science Translational Medicine. 10 (432), (2018).
- Rust, R., Hofer, A. -S., Schwab, M. E. Stroke promotes systemic endothelial inflammation and atherosclerosis. Trends in Molecular Medicine. 24 (7), 593-595 (2018).
- Rust, R., Gantner, C., Schwab, M. E. Pro- and antiangiogenic therapies: current status and clinical implications. FASEB Journal. 33 (1), 34-48 (2018).
- Rust, R., Grönnert, L., Weber, R. Z., Mulders, G., Schwab, M. E. Refueling the ischemic CNS: guidance molecules for vascular repair. Trends in Neurosciences. 42 (9), 644-656 (2019).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642 (2018).
- Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
- Montagne, A., et al. APOE4 leads to blood-brain barrier dysfunction predicting cognitive decline. Nature. 581 (7806), 71-76 (2020).
- George, P. M., Steinberg, G. K. Novel stroke therapeutics: unraveling stroke pathophysiology and its impact on clinical treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
- Weber, R. Z., et al. Deep learning based behavioral profiling of rodent stroke recovery. bioRxiv. , (2021).
- Nair, R. R., et al. Uses for humanised mouse models in precision medicine for neurodegenerative disease. Mammalian Genome. 30 (7), 173-191 (2019).
- Kirabali, T., Rust, R. iPS-derived pericytes for neurovascular regeneration. European Journal of Clinical Investigation. 51 (9), 13601 (2021).
- Weber, R. Z., Perron, P., Rust, R. Astrocytes for brain repair: More than just a neuron's sidekick. Brain Pathology. 31 (5), Zurich, Switzerland. 12999 (2021).
- Johansen, J., et al. Evaluation of Tet-on system to avoid transgene down-regulation in ex vivo gene transfer to the CNS. Gene Therapy. 9 (19), 1291-1301 (2002).
- Vogel, S., et al. Initial graft size and not the innate immune response limit survival of engrafted neural stem cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 784-793 (2018).
