Summary
我々は、マウス脳におけるルシフェラーゼ緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する二重レポーターベクターで形質導入されたヒト神経前駆細胞の実質内移植について説明する。移植後、ルシフェラーゼシグナルは、蛍光顕微鏡を用いて脳切片で同定された in vivo 生物発光およびGFP発現移植細胞を用いて繰り返し測定される。
Abstract
細胞療法は、長い間、実験的神経生物学における新たな治療パラダイムであった。しかし、細胞移植研究はしばしばエンドポイント測定に依存しているため、限られた範囲でしか細胞遊走および生存の縦方向の変化を評価することができない。この論文は、成体マウスの脳に神経前駆細胞(NPC)を移植し、縦方向に追跡するための信頼性が高く、低侵襲のプロトコルを提供する。移植前に、細胞は、生物発光(ホタル - ルシフェラーゼ)および蛍光(緑色蛍光タンパク質[GFP])レポーターを含むレンチウイルスベクターで形質導入される。NPCは、感覚運動皮質における定位注射を用いて右皮質半球に移植される。移植後、移植された細胞は、 in vivo 生物発光イメージングを使用して、6,000細胞の分解能限界で最大5週間(0、3、14、21、35日目)無傷の頭蓋骨を通して検出されました。続いて、移植された細胞は、組織学的脳切片において同定され、さらに免疫蛍光で特徴付けられる。したがって、このプロトコルは、マウス脳内の細胞を移植、追跡、定量化、および特徴付けるための貴重なツールを提供します。
Introduction
哺乳類の脳は、傷害や病気後の再生能力が限られており、組織や機能修復を促進するための革新的な戦略が必要です。前臨床戦略は、神経保護、神経新生、血管新生1,2、血液脳関門修復3,4、または細胞療法5,6を含む脳再生のさまざまな側面に焦点を当てる。細胞療法は、これらの修復促進プロセスの多くを同時に促進することができるという利点を有する。細胞の移植実験では、(1)細胞の直接置換と(2)血管新生と神経新生につながるサイトカインの産生によって組織修復が起こっています7。幹細胞技術の最近の進歩は、現在臨床試験のパイプラインにあるスケーラブルで十分に特徴付けられた神経細胞源の開発をさらに促進しました(7,8,9でレビュー)。細胞療法は、いくつかの神経学的疾患(例えば、パーキンソン病10、脳卒中11、および脊髄損傷12)の臨床段階に達しているが、それらの有効性は可変であり、移植片と宿主の相互作用のメカニズムを理解するためには、より多くの前臨床研究が必要である。
多くの前臨床試験の1つの主要な制限は、宿主内部の移植細胞の継続的な追跡である。エンドポイント測定のみが実行されることが多く、ホスト6、13における動的移動および生存プロセスを省略する。これらの制限は、移植された細胞の不十分な特性評価をもたらし、縦方向の変化を理解するために高い動物数を必要とする。これらの限界を克服するために、本研究では、誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の神経前駆細胞を、赤色ホタルルシフェラーゼおよび増強緑色蛍光タンパク質(rFluc-eGFP)からなる市販のデュアルレポーターレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。これらの細胞は、定位イントラップ実質注射を介してマウス脳に移植され、5週間にわたって in vivo 生物発光イメージングを用いて縦方向に追跡される。脳組織採取後、GFP発現移植細胞が同定され、組織学的脳切片においてさらに特徴付けられる。この方法は、げっ歯類の脳 におけるin vivo 適用のための代替形質導入可能な細胞源および移植経路に円滑に適合させることができる。全体として、この手順は、マウス脳における移植片の生存および遊走の縦断的情報を得るために貴重であり、その後の組織学的特徴付けを容易にする。
Protocol
注:マウスを含むすべての実験は、政府、機関、およびARRIVEガイドラインに従って実施され、チューリッヒの州獣医局によって承認されました。成人の雄および雌の非肥満糖尿病SCIDガンマ(NSG)マウス(10〜14週目、25〜35g)を使用した。マウスは、一定の12/12時間の明暗サイクルを有する湿度および温度制御された部屋において、ケージあたり少なくとも2匹の動物のグループで、通常のタイプII/IIIケージに収容された。.).
1. 細胞培養とウイルス形質導入
- 先に説明したように小分子阻害剤を用いて神経前駆細胞(NPC)をiPSCから分化させる14。
- 継代2以降のNPCs15 を神経幹細胞維持培地(NSMM; 表1)ポリオルニチン/ラミニン521(pLO/L521)でコーティングした6ウェルプレート(ウェルあたり2mLの培地)に小分子(表1)を補充した。培地を毎日交換してください。
注:NPCを継代するには、1ウェルあたり1mLの細胞解離試薬を添加し( 材料表を参照)、ほとんどの細胞が剥離するまで37°Cで1分間インキュベートします。- コーティングのために、1ウェルあたり1 mLの0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の150 μLのpLOを室温(RT)で2時間インキュベートする。PBSで3回洗浄した後、1ウェルあたり1mLのPBSに10μgのL521をRTで2時間インキュベートする。
- ウイルス形質導入のために、pLO/L521でコーティングした24ウェルプレートに1ウェルあたり50,000個の細胞をプレートし、パッケージ化されたウイルスベクター(pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro、LL410PA-1)を各ウェルに加える。
注:提供される総感染単位(IFU)は>2×106 IFUであり、感染多重度(MOI)が20で100,000細胞に感染するのに十分である。細胞計数は、自動セルカウンターで行われています。形質導入効率は、使用される細胞株に強く依存する。レンチウイルスを扱うには、バイオセーフティレベル2(BSL-2)製品に関する現地ガイドラインに準拠する必要があります。 - 細胞を37°Cで72時間インキュベートし、毎日培地交換を続けた。
- 蛍光顕微鏡で細胞のGFP発現を確認することにより、形質導入が成功したことを確認する。顕微鏡の倍率を10倍または20倍に設定し、適切な励起(460〜480nm)および発光範囲(490〜520nm)を使用して、形質導入されたGFP発現細胞を検出する。
- 全細胞に対するGFP形質導入の比率を定量化して、一般的な形質導入の有効性を推定する。
注:このプロトコルでは、65〜95%の形質導入率が達成されました。移植前のゴー/ノーゴー基準として>50%の形質導入有効性が推奨されます。50%の形質導入効果が達成できない場合は、ピューロマイシン選択を行うか、フローサイトメトリーを使用して細胞をソートして、形質導入細胞の収量を増加させる。 - オプション: 細胞の凍結
- 細胞をスピンダウン(300×g、5分間)し、上清を捨てる。ペレットを1mLの凍結培地(材料表を参照)に再懸濁し、懸濁液をバイアルに移して106細胞/バイアルを得る。細胞を凍結箱に-80°Cで24時間移し、次いで長期保存のために-150°Cに移す。
2. 移植用細胞製剤
- -150°Cの保存から細胞のバイアルを収集し、実験室に移す。自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。
注:バイアルには1.5-2×106個の 細胞が含まれています。 - 氷結晶が残らなくなるまでバイアルを37°Cの水浴に素早く移す(2〜3分)。
注:細胞膜への損傷を最小限に抑えるために、迅速に解凍することが重要です。バイアルを水浴に完全に浸さないでください。 - バイアルをバイオセーフティキャビネットに移し、全内容物(〜1mL)を滅菌15mL円錐管にピペットで移す。
注:レンチウイルス形質導入細胞を扱うにはBSL-2が必要です。しかしながら、細胞の洗浄および継代は、培地からウイルス粒子を除去する。BSL-2からBSL-1への転送が許可される時期に関する情報は、地方自治体から入手する必要があります。 - 9 mLの滅菌1x PBSを加え、300 × g、RTで5分間遠心分離する。
- ピペット(1〜10mL)を用いて吸引により上清を除去する;サスペンションをピペットチップに向かって静かに傾け、吸引を開始します。ペレットを乱さないように注意してください。
- 10mLの滅菌1x PBSに再懸濁することによって細胞を洗浄する。
メモ: チューブを軽くタブして、残留体積の細胞を再懸濁させます。細胞懸濁液を、凝集塊または凝集物を含まないまで1mLピペットを用いてゆっくりと粉砕する。 - 自動セルカウンターを使用して、最終スピンの前にセルをカウントします。
- 300 × g、RTで5分間遠心分離する。
- 上清を除去し(ステップ2.5)、細胞ペレットを必要量の滅菌PBSに8×104 細胞/μLの濃度に再懸濁し、細胞を氷の上に置き、次の5時間以内に移植に使用する。
注:このプロトコルでは、1.6 ×105 cells/2 μLのPBSの容量が使用されました。
3. 移植手順
- 手術の準備
- 手術器具をきれいにして滅菌します。
- 定位装置とマイクロインジェクションポンプシステムを用意する。
注:開始する前に、ハミルトンシリンジと30G、2インチの針をテストすることが重要です。滅菌0.9%NaClを含むチューブに針を挿入し、溶液をゆっくりと引き出します。 - 麻酔装置をセットアップします。動物を巻き込む前に機械をテストしてください。誘導チャンバーを70%エタノールで清掃する。
- 動物の準備
- 実験前にマウスを標準的な条件下で少なくとも7日間保持し、それらを順応させる。
注:このプロトコルには、雌のNOD/SCID/IL2rγnull(30〜35g、NSGとしても知られる)および雌のC57BL/6J(20〜25g、B6としても知られる)の動物が使用された。この手順は、雄マウスを用いて行うこともできる。 - マウスの体重を測定し、注射する鎮痛剤の投与量を調整します。カルプロフェン(5mg/kg体重)を腹腔内に投与し、痛みを軽減し、炎症反応を予防する。
- 酸素中で気化したイソフルラン(誘導期に3%、手術中の維持期に1.5〜2%)を使用して動物を麻酔する。
注:ガス麻酔は、外科的処置後の迅速な覚醒および麻酔ガスのレベルを容易に調整することができるため好ましい。 - 侵害受容反射を使用して、動物が深く麻酔されていることを確認してください(例えば、つま先のピンチ)。深い麻酔に達したら、動物を誘導チャンバから定位フレームに輸送する。フェイスマスクを使用して麻酔を維持します。
注:呼吸数は、手順全体を通して視覚的に監視する必要があります(毎分40〜60回の呼吸)。処置中の低体温を避けるために、温暖化パッドを使用してください。 - 眼科用潤滑剤を塗布して、目が乾燥するのを防ぎます。
- マウスの頭皮を電気カミソリで剃り、綿棒を使用して5%ベタジン溶液で皮膚を消毒する。
- マウスの頭を固定し、イヤーバーを外部ミータスに挿入します。
メモ:鼓膜を傷つけないように注意してください。耳の棒を挿入する前に、両方の外耳道にリドカイン軟膏を塗布する。動物の頭が安定した位置にあるかどうかを確認するには、頭を慎重に押し下げて動きがあるかどうかを確認します。動きが認められた場合は、イヤーバー、ノーズピースの配置、またはその両方が正しくないため、再調整する必要があります。
- 実験前にマウスを標準的な条件下で少なくとも7日間保持し、それらを順応させる。
- 開頭術
- 外科用ブレードを使用して、ラムダとブレグマのランドマークを明らかにするのに十分な大きさの正中線に沿ってカットを作成します。
注:皮膚リトラクターは、頭蓋骨を露出させておくために適用することができます。 - 骨膜と筋膜をメスで引っ込め、滅菌綿棒を使用して頭蓋骨表面を乾燥させます。
- 耳と口のバーを調整して、頭の位置を標準化します。
メモ: ブレグマとラムダの垂直座標は、前後位置決めで同一である必要があります。 - ブレグマに針を置き、所望の注入点の座標を計算する(このプロトコルのために選択された関心のある座標:前後(AP):+ 0.5mm、内側 - 側方(ML):+ 1.5mm)。針をそのポイントまで動かし、インクでマークします。
注:座標は、Franklin and Paxinos Mouse Brain Atlas 16に基づいて選択されました。距離はブレグマからmmです。 - 滅菌された0.9%NaClを頭蓋骨に塗布し、外科用歯科用ドリルで頭蓋骨に直径2〜3mmの穴を開ける。
- 針を硬膜の表面に移動し、深さ座標を計算します。
- 外科用ブレードを使用して、ラムダとブレグマのランドマークを明らかにするのに十分な大きさの正中線に沿ってカットを作成します。
- 移植手順
- 細胞をチューブに再懸濁し(ステップ2.9)、2 μLの細胞懸濁液をシリンジ(5 μLまたは10 μL)に引き込む。
注:細胞懸濁液に気泡が存在しないことを確認してください。シリンジは、細胞沈降を避けるために定位装置に取り付けられるまで水平位置に保たれる必要がある。 - シリンジを標的部位の上に置き(計算座標:AP:+ 0.5mm、ML:+ 1.5mm)、針を硬膜の表面にゆっくりと動かします。
注:正しい座標がわからない場合は、細胞を移植する前に、色素による注射および注射部位の組織学的評価を行う(詳細については、 17を参照)。 - 針を0.02 mm/sの速度で適切な深さまで脳に導きます(このプロトコルで選択された座標は背腹側(DV)-0.8 mmです)。深さを0.1mmオーバーシュートし、同じ距離にわたって針を引き抜いて、注入された細胞用のポケットを作成する。
- 鉗子を使用して針の周りに組織接着剤を塗布し、細胞の漏出を防ぎます。
- 調製した細胞懸濁液2 μLを3~5 nL/sの一定速度で注入する。
注:注射手順は7〜12分間続きます。 - 注射後、針を少なくとも5分間所定の位置に放置してから、ゆっくりと引き抜いてください。頭蓋骨の穴を密封するために組織接着剤を塗布し、さらに2分間待つ。
- 細胞をチューブに再懸濁し(ステップ2.9)、2 μLの細胞懸濁液をシリンジ(5 μLまたは10 μL)に引き込む。
- 縫合糸とポストケア
- 脱水を避けるために、露出した頭蓋骨に滅菌0.9%NaCl溶液を塗布する。
- 5/0の絹縫合糸で傷口を塞ぐ。
- 0.5mLのリンゲル乳酸溶液を腰に皮下注射して動物を水和させる。
- 麻酔の送達を中断し、マウスを定位装置から慎重に取り出し、加熱パッドに保持されたケージに戻す。
- 急性期の損傷後動物を監視します。縫合糸、動物の体重、および全体的な健康状態を少なくとも1日2回確認してください。
4. インビボ イメージング
- ルシフェリンの調製
- D-ルシフェリンカリウム塩をRTで解凍し、PBS中のD-ルシフェリンの新鮮な原液を30mg/mLで調製する。
- 原液を0.22μmのシリンジフィルターで滅菌します。
メモ: 有効なソリューションをすぐに使用することをお勧めします。必要に応じて、溶解したルシフェリンを-20°Cで保存することができる。 ただし、長期間の保存は、信号の劣化につながる可能性があります。ルシフェリンは光感受性試薬である。可能な限り直射日光を避けてください。代替基質、例えばcyclucも考慮して、分解能限界18を改善する。
- イメージング
- 初期設定
注:生物発光イメージングは、暗室と冷却された電荷結合素子(CCD)カメラからなる in vivo イメージングシステム( 材料表を参照)を用いて実施した。- 「リビング・イメージ」ソフトウェア・アイコンをダブルクリックし、ドロップダウン・リストからユーザー ID を選択します。
- 表示されるコントロールパネルで「初期化」をクリックします。初期化プロセスが完了すると、コントロールパネルの温度ボックスが緑色に変わります。
- コントロールパネルで、[発光]ボックスと[写真]チェックボックスをオンにし、[自動露出(約60秒)]を選択します。視野を選択します(このプロトコルにはD/12.5cmが選択されています)。被写体の高さ(1.5 cm)を入力し、[被写体の高さのフォーカスを使用]オプションを選択します。大きなビニング、f/2、ブロック励起フィルタ、オープンエミッションフィルタのパラメータを手動で設定します。
- D-ルシフェリンの注射量を300mg/kg体重で決定する。注:標準推奨用量は150mg / kgのD-ルシフェリンです。この手順は、300mg/kg18を使用してより高い感度を報告するプロトコルに従って調整された。
- ルシフェリンを腹腔内に注射する(i.p.)。
注:注射前に動物を鎮静する必要がある場合は、ピークルシフェラーゼ発現時間が長くなる可能性があることに注意してください。 - 5分間待ってから、イソフルランの連続供給(誘導段階で4.5%、イメージング手順中の維持段階で1.5-2%)で動物を麻酔します。
- 眼科用潤滑剤を眼に塗布し、その後、従来のヘアシェーバーを使用して頭部領域の鎮静動物を剃る。動物をイメージングチャンバーに入れ、ルシフェリン注入の15分後にコントロールパネルの[取得]をクリックしてイメージングを開始します。
- 初期設定
5. 灌流
- ペントバルビタールナトリウム(150mg / kg体重)のi.p.注射によって動物を麻酔する。マウスがつま先のピンチなどの痛みを伴う刺激に反応しなくなるまで待ちます。
- マウスを背中に置き、ピンセットとハサミを使って胸腔を開きます。
- 標準のはさみを使用してダイヤフラムを開きます。
- 心臓を露出させ、左心室の頂点に針(リンガー/ 4%パラホルムアルデヒド溶液(PFA)を含むチューブから)を挿入します。
注:針の先端を心室の内腔に留めておくように注意してください。 - はさみを使って右心室を切ってください。
- リンガー溶液(RTに保持可能)で3〜4分間灌流する(流量:17mL/分)。心が清くなるまで続けます。
- PFAの流れを可能にするように活栓を切り替え(4°Cで保存し、処置中は氷の上に保管してください)、さらに5分間(〜100mL)灌流します。
- ポンプを停止し、左心室から針を取り外します。
注:PFAによる灌流は、組織の完全性を均一に維持する。それはまた、そうでなければ拡散のために失われるかもしれない移植におけるGFPシグナルの保存を容易にする。
6. 処理
- 組織採取
- 標準的なはさみを使用して頭を取り外し、皮膚に正中線切開を行います。
- 頭蓋骨を露出させるために目の上に皮膚をひっくり返します。
- 頭頂骨の先端にある尾部から始めて、春のはさみを使って小さな切開を行います。はさみを矢状縫合針に沿って吻側に目の間の点まで進めます。尾部から再び開始し、矢状面で平行に約4mm離して2つのカットを作成します。
注:はさみを頭蓋骨の内面に押し付けて脳を傷つけないように注意してください。 - 鉗子を使用して、頭頂骨の片側を慎重に傾けて切断します。反対側でも同じことをしてください。
注: 髄膜から骨を解放するために微小ヘラを使用してください;さもなければ、彼らは頭蓋骨を壊しながら脳を傷つけるかもしれません。前頭骨の一部が残っている場合は、骨板を傾けて折るために小さな切り込みをしてください。 - 脳を解放するには、脳の下の微小ヘラ(嗅球)を慎重にスライドさせ、静かに上に傾けます。
- 採取後、脳を4%PFA溶液中で4°Cで4〜6時間保持する。 その後、滅菌1x PBSに移す。
- 免疫組織化学
- 凍結中の結晶の形成を防ぐために、脳を30%スクロース溶液に4°Cで少なくとも48時間移す。
- スライド式ミクロトームを使用して、厚さ40μmの冠状切片を切断します。切片を自由浮遊切片として(24ウェルプレート中)回収し、凍結保護剤溶液(表1)中で-20°Cでさらに処理するまで保管する。
- 各ウェルの450 μLの1x PBSで切片をすすぎます(3回、各5分、RT)。
- 各ウェルの450 μLのブロッキング溶液(表1)で非特異的部位をRTで1時間ブロックします。
- 各ウェルを450 μLの一次抗体と共に4°Cで一晩インキュベートする。抗体を3%ロバ血清中で1:200に希釈する;0.1% トリトン-X-100 (PBS)宿主環境中のドナー物質を同定するために、ヒト特異的核に対する抗体(抗ヒト核抗体、クローン235-1)を使用する。
- 各ウェルの450 μLの1x PBSで切片を洗浄します(3回、各5分、RT)。
- 各ウェルを450 μLの対応する蛍光二次抗体とともに2~3時間(RT)インキュベートします。抗体を3%ロバ血清で希釈する。0.1% トリトン-X-100 (1x PBS)
- 各ウェルの450 μLの1x PBSで切片を洗浄します(3回、各5分、RT)。
- 450 μL の 0.1 μg/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で核を染色します。
Representative Results
マウス脳内の移植神経前駆細胞を in vivo 生物発光イメージングを用いて縦方向に追跡し、その後の組織学的解析で移植細胞を同定することを目指します(図1A)。したがって、神経前駆細胞は、EF1α−rFluc−eGFPからなるレンチウイルスベクターで形質導入される。移植前に、細胞を インビトロでの eGFPの発現による形質導入の成功について試験した(図1B)。首尾よく形質導入された細胞を、所望の座標でマウス脳内に定位的に移植した(例えば、感覚運動皮質内)。移植後、マウスにrFlucの基質であるD-ルシフェリンを全身注射し、移植細胞のシグナル強度を測定し、移植の成功を確認した(図1C)。
インビボ生物発光イメージングの検出限界を評価するために、6,000〜180,000細胞の範囲をマウスの右感覚運動皮質に移植した(図2A)。<6,000個の細胞と、移植直後の移植細胞数に比例した生物発光シグナルを検出した(図2B)。ヒト細胞源が免疫担当マウスに対して免疫原性であるように、NODシッドガンマ(NSG)免疫不全マウスを用いて、細胞移植片の長期生存を観察した。細胞移植後、最大5週間の長期生存および生物発光シグナルの検出が確認された(図2C、D)。移植された細胞を、eGFPレポーターおよび抗ヒト核および抗ヒトミトコンドリア抗体による免疫染色によるその後の組織学的分析において、エキソビボで首尾よく検出した(図2E)。
図1:神経前駆細胞の移植 。 (A)rFluc-eGFP NPCの生成および移植の概略概要。 (B)形質導入NPCの代表的な免疫蛍光画像(GFPレポーター、緑色)をDAPI(青色)で対比染色した。スケールバー = 5μm. (C) 移植細胞における生物発光シグナルの インビボ 検出;カラーバー = 青 (0, 分, シグナルなし), 赤 (4 フラックス, p / s × 105, 最大シグナル) 略語: NPC = 神経前駆細胞;GFP = 緑色蛍光タンパク質;rFluc-eGFP = 赤色ホタルルシフェラーゼおよび増強された緑色蛍光タンパク質;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;p/s = 光子/秒。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:移植細胞の経時変化 (a)移植用細胞番号の模式図。(b)移植後1時間の移植細胞の検出限界。(C, D)NSGマウスにおける移植の経時変化(180,000細胞)を最大35日間;カラーバー = 青(0、分、信号なし)、赤(4フラックス、p/s×105、最大信号)データはSEM±平均(n = 3)です。(e)移植後5週間の組織学的切片および移植細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー = 10 μm. 略語: D = 移植後日;NSG = 免疫不全NODシドガンマ;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;GFP = 緑色蛍光タンパク質;HuNu = 抗ヒト核抗体、クローン235-1;p/s = 光子/秒。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
機能回復を可能にするために負傷した脳を再生することは、未解決の課題のままです。多くの革新的な前臨床アプローチは、例えば、免疫調節19、20、血管新生1、21、22、23、血液脳関門完全性2、3、24、25、および細胞置換5,26を標的とする進化してきた。.特に近年、細胞ベースの治療法は、幹細胞技術の大きな進歩と効率的な分化プロトコル15,28により、脳の有望な治療戦略として浮上しています。この論文は、マウス脳に神経細胞を移植および追跡するための貴重なプロトコルを提供する。この方法は、マウス脳におけるインビボ適用のためのすべての形質導入可能な細胞株に適用可能である。
提示されたセットアップは、マウスにヒト起源の移植を使用する。これらの移植は、免疫原性のために免疫能を有する野生型マウスにおいて長期的には生存できない。したがって、免疫不全NSGマウスは、この制限を克服するために使用された。あるいは、マウス移植の使用は、免疫原性の側面を克服するために好ましい場合がある。ヒト細胞の移植が必要な場合、ヒト化マウスモデルは、移植片拒絶反応の可能性を低下させるための新たな代替手段である29。
EF1αプロモータ下のホタルルシフェラーゼとeGFPからなる市販のデュアルレポーターウイルスベクターを用いて、移植を可視化した。このプロモータは、高い信号強度15を達成するために選択された。しかし、NPCとは別に、周皮細胞30およびアストロサイト31を含む他の細胞型が傷害後の脳機能を促進することが示されている。したがって、使用される細胞株に応じて、他のプロモーターが高発現レベルを達成するためにより適している可能性がある。さらに、CMVなどの導入遺伝子プロモーターの使用は、特に長期実験において、ダウンレギュレーションをもたらし得る32。レンチウイルスベクターの形質導入効率は、使用される細胞株に強く依存し、単一の実験間で変化し得る。したがって、形質導入効率は 、in vivo 実験を開始する前に評価し、実験間の形質導入有効性の変動を補正する必要があります。移植の脳領域も信号強度に影響します。皮質移植では<6,000個の細胞の検出限界が達成されたが、線条体や海馬などのより深い脳領域でシグナルを検出するためにより多くの細胞が必要になる可能性がある。
マウス脳内の移植量は1〜2μLに制限されている。したがって、実験に適した細胞数を特定することが重要である。細胞数の増加が生存率の低下につながることは以前に観察されており、移植領域における栄養素および酸素の利用可能性が限られているためである可能性が最も高い33。インビボ生物発光イメージングは、MRIまたはCTなどの他のインビボイメージング方法と比較して比較的低い空間分解能を提供する。したがって、移植された細胞の短い遊走経路は、その後の事後分析においてのみ確実に評価することができる。
生物発光の絶対信号強度は、一般に、移植細胞数に比例する。しかし、移植片がより深い脳構造に移植された場合、または信号強度が in vivo イメージングシステムの線形検出スペクトルの外側にある場合、信号強度が低下する可能性があります。現在、cycluc1を含むD-ルシフェリンよりも血液脳関門を横切るより効率的な浸透を確実にするために、新しい基質が開発されている。これらの基質は、移植された細胞の検出限界を将来さらに改善する可能性がある18。全体として、このプロトコルは、マウス脳に移植片を移植および観察するための簡単で低侵襲の手順を可能にする。
Disclosures
著者らは、宣言する潜在的な利益相反はありません。
Acknowledgments
著者RRとCTは、Mäxi財団と3Rコンピテンスセンターからの支援を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral Transduction | |||
| pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
| Consumables | |||
| Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
| Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
| Microscope cover slips | Product of choice | ||
| Microscope slides | Product of choice | ||
| Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
| Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
| Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
| Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
| Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
| Equipment | |||
| Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Heating pad | Product of choice | ||
| High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
| In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
| Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
| Microtome | Leica | HM430 | |
| NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
| Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
| Pharmaceuticals and Reagents | |||
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
| Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
| B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
| Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
| CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
| Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
| DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
| Donkey serum | Product of choice | ||
| Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ethanol; 70% | Product of choice | ||
| FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
| hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
| Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
| Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
| N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
| Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
| Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
| Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
| SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
| Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |
References
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