Evaluación fisiopatológica de la retina en un modelo de rata

Summary

La retinopatía diabética es una de las principales causas de ceguera. La histología, el ensayo de ruptura de la barrera hematoencefaliana y la angiografía por fluorescencia son técnicas valiosas para comprender la fisiopatología de la retina, lo que podría mejorar aún más la detección eficaz de medicamentos contra la retinopatía diabética.

Abstract

Una enfermedad ocular del segmento posterior como la retinopatía diabética altera la fisiología de la retina. La retinopatía diabética se caracteriza por un desprendimiento de retina, ruptura de la barrera sangre-retina (BRB) y angiogénesis retiniana. Un modelo de rata in vivo es una valiosa herramienta experimental para examinar los cambios en la estructura y función de la retina. Proponemos tres técnicas experimentales diferentes en el modelo de rata para identificar cambios morfológicos de las células de la retina, la vasculatura retiniana y el BRB comprometido. La histología retiniana se utiliza para estudiar la morfología de varias células de la retina. Además, la medición cuantitativa se realiza mediante el recuento de células de la retina y la medición del grosor de diferentes capas de la retina. Un ensayo de descomposición de BRB se utiliza para determinar la fuga de proteínas extraoculares del plasma al tejido vítreo debido a la descomposición de BRB. La angiografía por fluorescencia se utiliza para estudiar la angiogénesis y la fuga de vasos sanguíneos mediante la visualización de la vasculatura retiniana con el tinte FITC-dextrano.

Introduction

La retinopatía diabética (RD) es una de las complicaciones secundarias más complejas de la diabetes mellitus. También es la principal causa de ceguera prevenible en la población en edad de trabajar en todo el mundo. En un metaanálisis reciente de 32,4 millones de personas ciegas, 830.000 (2,6%) personas eran ciegas debido a ^dr1. La proporción de pérdida de visión atribuida a la diabetes ocupó el séptimo lugar en 2015 con un 1,06% (0,15-2,38) a nivel ^mundial2,3.

La retinopatía diabética se diagnostica por anomalías vasculares en los tejidos oculares posteriores. Clínicamente, se divide en dos etapas: DR no proliferativa (NPDR) y DR proliferativa (PDR), según la vascularización en la retina. La hiperglucemia es considerada el potente regulador de la RD ya que implica varias vías implicadas en la neurodegeneración4,5, la ^{inflamación6,7} y la microvasculatura8 en la retina. Las múltiples complicaciones metabólicas inducidas debido a la hiperglucemia incluyen la acumulación de productos finales de glicación avanzada (AGE), la vía del poliol, la vía de la hexosamina y la vía de la proteína quinasa-C. Estas vías son responsables de la proliferación celular (células endoteliales), la migración (pericitos) y la apoptosis (células retinianas neurales, pericitos y células endoteliales) basadas en diferentes etapas de la retinopatía diabética. Estas alteraciones metabólicas pueden conducir a cambios fisiológicos como desprendimiento de retina, pérdida de células retinianas, ruptura de la barrera sangre-retina (BRB), aneurismas y ^{angiogénesis9}.

La diabetes tipo 1 inducida por estreptozotocina (STZ) es una práctica bien establecida y bien aceptada en ratas para evaluar la patogénesis de la diabetes y sus complicaciones. Los efectos diabetogénicos de la STZ se deben a la destrucción selectiva de las células β de los islotes pancreáticos10. Como resultado, los animales sufrirán deficiencia de insulina, hiperglucemia, polidipsia y poliuria, todas las cuales son características de la diabetes mellitus tipo 1 ^humana11. Para la inducción de diabetes grave, STZ se administra a 40-65 mg / kg de peso corporal por vía intravenosa o intraperitoneal durante la edad adulta. Después de aproximadamente 72 h, estos animales presentan niveles de glucosa en sangre superiores a 250 mg/^dL10,12.

Para comprender las alteraciones fisiológicas de la retina debidas a la neurodegeneración, la inflamación y la angiogénesis, se deben optimizar diferentes técnicas en modelos animales experimentales. Los cambios estructurales y funcionales en las células de la retina y los vasos retinianos se pueden estudiar mediante diversas técnicas, como la histología, el ensayo de descomposición de BRB y la angiografía por fluorescencia.

La histología implica el estudio de la anatomía de las células, tejidos y órganos a nivel microscópico. Establece una correlación entre la estructura y la función de las células/tejidos. Se realizan varios pasos para visualizar e identificar las alteraciones microscópicas en la estructura tisular, comparando así contrapartes sanas y ^enfermas13. Por lo tanto, es esencial estandarizar cada paso de la histología meticulosamente. Varios pasos involucrados en la histología retiniana son la fijación de la muestra, el recorte de la muestra, la deshidratación, el aclaramiento, la impregnación con parafina, la incrustación de parafina, la seccionamiento y la tinción (tinción de hematoxilina y eosina)^13,14.

En una retina sana, el transporte de moléculas a través de la retina está controlado por BRB, compuesto por células endoteliales y pericitos en el lado interno, y células epiteliales pigmentarias de la retina en el lado externo. Sin embargo, las células endoteliales internas del BRB y los pericitos comienzan a degenerar durante la enfermedad, y el BRB también se ve ^{comprometido15}. Debido a esta descomposición del BRB, muchas moléculas de bajo peso molecular se filtran en el tejido vítreo y ^retiniano16. A medida que la enfermedad progresa, muchas otras moléculas de proteínas (bajo y alto peso molecular) también se filtran en el tejido vítreo y retiniano debido a la alteración de la ^{homeostasis17}. Conduce a varias otras complicaciones y, en última instancia, edema macular y ceguera. Por lo tanto, cuantificar los niveles de proteínas en el vítreo y comparar los estados saludables y diabéticos compromete las medidas de BRB.

La angiografía por fluorescencia es una técnica utilizada para estudiar la circulación sanguínea de la retina y la coroides utilizando tinte fluorescente. Se utiliza para visualizar la vasculatura de la retina y la coroides mediante la inyección de colorante de fluoresceína por vía intravenosa o inyección ^cardíaca18. Una vez que se inyecta el tinte, primero llega a las arterias de la retina, seguido de las venas de la retina. Esta circulación de tinte generalmente se completa dentro de los 5 a 10 minutos posteriores a la inyección de ^tinte19. Es una técnica importante para diagnosticar diversas enfermedades oculares del segmento posterior, incluyendo la retinopatía diabética y la neovascularización ^coroidea20. Ayuda a detectar cambios en la vasculatura mayor y menor en condiciones normales y enfermas.

Protocol

Este protocolo sigue todas las pautas de cuidado animal proporcionadas por el Comité Institucional de Ética Animal, BITS-Pilani, campus de Hyderabad.

1. Histología de la retina

1. Enucleación y fijación del ojo
   1. Sacrificar a una rata macho Wistar diabética de 2 a 3 meses de edad junto con el control de la misma edad (14 a 15 semanas de edad) utilizando una dosis alta de pentobarbital (150 mg / kg) inyectado a través de la vía intraperitoneal. Ningún latido cardíaco detectable confirma la muerte dentro de 2-5 min.
   2. Enucle el ojo haciendo incisiones usando una cuchilla de bisturí en las regiones nasal y temporal del ojo. Luego corte a lo largo de sus bordes usando fórceps y micro tijeras para extraer el ojo de la cavidad orbitaria.
      NOTA: Antes de sacrificar ratas, mantenga las soluciones fijadoras listas.
      PRECAUCIÓN: El formaldehído irrita la piel, los ojos, la nariz y las vías respiratorias. También puede causar cáncer, ya que es un potente sensibilizador de la piel. Use guantes y manipule debajo del ^capó21.
   3. Lave bien el ojo con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una placa de Petri para eliminar la sangre. Retire el exceso de grasa que rodea el ojo para facilitar la penetración de la solución fijadora.
   4. Coloque inmediatamente el ojo en 5 ml de solución fijadora con la ayuda de fórceps y asegúrese de que no esté pegado a las paredes de los viales de vidrio. Revuelva suavemente durante unos segundos y reemplace la tapa con el etiquetado adecuado. Incubar el ojo en solución fijadora durante 24 a 48 h en condiciones de oscuridad a temperatura ambiente.
2. Recorte de tejido
   1. Después de la fijación, retire el ojo de la solución fijadora, lávelo con 10 ml de PBS y colóquelo en una placa de Petri que contenga 10 ml de PBS refrigerado a 4 °C.
   2. Usando micro pinzas, sostenga el ojo con el nervio óptico y haga un corte en pars plana con la ayuda de micro tijeras. Corte a través de todo el margen de la córnea para separar la copa anterior de un ojo. Usando fórceps, levante la lente suavemente, deséchela y corte el nervio óptico.
   3. Usando micro tijeras curvas, hacer una sección longitudinal del ocular posterior, pasando a través del disco óptico dividiéndolo en dos mitades. Colóquelo en la base del cassette y cierre la tapa correctamente sin ninguna perturbación en el tejido. Etiquete los casetes con el nombre y la fecha de la muestra de tejido.
3. Deshidratación, limpieza e impregnación de parafina del tejido
   1. Deshidratar el tejido recortado por transferencia gradual en 80 mL de 50%, 70%, 90% y 100% etanol. Mientras transfiere los casetes de una concentración a otra, asegúrese de aplicarlos en papel de seda limpio para minimizar la contaminación.
      NOTA: Permita que el tejido permanezca de pie en cada transferencia durante 30 minutos (dos veces). El tiempo total consumido para este paso es de aproximadamente 4 h.
   2. Tras la deshidratación, transfiera los casetes a 80 ml de xileno durante 30 minutos (dos veces) para reemplazar el etanol con xileno.
      NOTA: Después de la incubación con xileno, el tejido se vuelve translúcido.
      PRECAUCIÓN: El xileno es un compuesto aromático con un anillo de benceno. Irrita el ojo y la membrana mucosa y también puede causar depresiones.
   3. Finalmente, impregne el tejido con parafina precalentada a 60 °C para reemplazar el xileno en el tejido. Frote los casetes varias veces en papel de seda para minimizar el contenido de xileno y colóquelos en 200 ml de parafina (líquido a 60 °C) durante 2 h (1 h x 2).
      PRECAUCIÓN: Evite inhalar parafina derretida, ya que produce pequeñas gotas de lípidos que pueden causar molestias respiratorias.
4. Incrustación de parafina
   1. Encienda la máquina de incrustación de parafina al menos 1 h antes de usarla para fundir la parafina y para que las estaciones alcancen las temperaturas deseadas. Llene un molde de acero con cera de parafina derretida colocándola sobre una superficie caliente, luego retire un cassette a la vez del recipiente de parafina.
   2. Mueva el molde de acero de una superficie caliente a una fría (4 °C). En este punto, la cera en el molde comenzará a solidificarse. Antes de que se solidifique por completo, coloque el tejido en cera con la ayuda de fórceps y oriente el tejido de modo que la porción del disco óptico de la copa posterior esté orientada hacia la base del molde.
      NOTA: Asegúrese de que el tejido no se mueva y mantenga la orientación deseada. De lo contrario, vuelva a colocar el molde en la superficie de trabajo caliente hasta que toda la parafina se licúe, luego comience de nuevo con el paso 1.4.2.
   3. A medida que la cera en el molde comienza a solidificarse, coloque inmediatamente la base del cassette sobre el molde. Llene cuidadosamente el molde con parafina por encima del borde superior del cassette y transfiéralo lentamente a una superficie fría (cerca de -20 ° C) para una solidificación rápida. Hasta que se solidifique, repita el proceso con otros casetes del paso 1.4.2.
   4. Una vez que todos los moldes estén solidificados, separe el molde de acero del cassette. Si es difícil, espere un poco más e inténtelo de nuevo (no lo retire con fuerza). La separación se vuelve más fácil después de la solidificación completa. Ahora el cassette se convierte en la base del bloque de parafina que se sujetará durante el seccionamiento por microtomo.
      NOTA: Este bloque se puede almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior. En este punto, el proceso se puede detener y continuar más tarde (si es necesario).
5. Seccionamiento
   1. Instale una cuchilla de microtomo desechable en el soporte de la cuchilla. Retire el exceso de cera de parafina alrededor de los casetes para que tanto la parte superior como la inferior de los bloques permanezcan paralelas al cuchillo. Coloque el bloque en el soporte del cassette.
   2. Desbloquea el volante de mano para avanzarlo hasta que la superficie del bloque esté en contacto con el filo del cuchillo. Recorte el exceso de cera de parafina en el bloque hasta que el tejido se visualice en la superficie del bloque. Ajuste el grosor de la sección a 5 μm y corte una cinta de cinco a seis secciones.
   3. Con fórceps, transfiera suavemente la cinta a la superficie del baño de agua precalentada (alrededor de 50 °C) para desplegar la cinta. Recoge secciones en un portaobjetos de vidrio recubierto con albúmina de Mayer sosteniendo la diapositiva debajo de la sección. Levante suavemente las secciones y deje que los toboganes se sequen horizontalmente durante la noche a 37 °C.
      NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar a temperatura ambiente en cajas secas durante varios meses. En este paso, el proceso se puede detener y continuar más tarde.
6. Tinción
   1. Calentar los portaobjetos a teñir en un horno de aire caliente a 60 °C durante 1 h antes de usar para que la parafina se derrita, y siga los pasos mencionados en la Tabla 1.
      PRECAUCIÓN: Las manchas de hematoxilina y eosina son tóxicas cuando se inhalan o ingieren. Se ha informado que son cancerígenos.

Reactivo	Tiempo de pie	Repetición (Número de veces)
Xileno	5 minutos	2
100% Etanol	5 minutos	2
90% Etanol	5 minutos	2
70% Etanol	5 minutos	2
50% Etanol	5 minutos	2
Agua	5 minutos	2
Hematoxilina	4 minutos	1
Lavado con agua
1% de alcohol ácido en etanol al 70%	30 s	1
Lavado con agua
El agua de Scott	1 min	1
Lavado con agua
50% Etanol	1 min	1
95% Etanol	1 min	1
0.25% Eosina	5 s	1
Lavado con agua
Agua	2 min	1
95% Etanol	1 min	1
100% Etanol	1 min	1
Xileno	5 minutos	2
Montante y funda

Tabla 1. Procedimiento de tinción de hematoxilina y eosina

2. Ensayo de ruptura de la barrera hematoencefálica

1. Recolección de sangre y vítreo
   1. Anestesiar a una rata macho Wistar diabética de 2 a 3 meses de edad junto con el control de la misma edad (14 a 15 semanas) usando ketamina (80 mg / kg) y xilazina (8 mg / kg). Confirme el estado anestésico mediante el reflejo de extracción del pedal (pellizco del dedo del pie). Recolecte inmediatamente 1 ml de sangre por punción cardíaca en un tubo recubierto de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para separar el plasma de la sangre total.
   2. Eutanasiar a la rata usando una dosis alta de pentobarbital (150 mg/kg), inyectado a través de la vía intraperitoneal. Ningún latido cardíaco detectable confirma la muerte dentro de 2-5 min. Enucle el ojo e inmediatamente colóquelo sobre hielo seco.
   3. Coloque el ojo en una placa de Petri limpia sobre hielo seco (recomendado) y comience a diseccionar el ojo como se menciona en el paso 1.2.2.
   4. Retire la lente, extraiga el vítreo con cuidado de la copa posterior con micro pinzas y colóquelo en un tubo de homogeneización que contenga de tres a cuatro cuentas de vidrio (2-4 mm).
      NOTA: Se recomienda la disección en hielo seco ya que la eliminación del cristalino y el vítreo es más fácil en condiciones de congelación.
2. Preparación de muestras
   1. Homogeneizar el humor vítreo en un homogeneizador de cuentas a velocidad media durante 10 s.
   2. Transfiera la sangre (1 ml) y las muestras vítreas (10-20 μL) a los tubos de la microcentrífuga y centrifugue ambas muestras a 5200 x g durante 10 min a 4 °C.
      NOTA: En el caso de una homogeneización exitosa, el vítreo tiene una consistencia uniforme después de la centrifugación. Sin embargo, en el caso de consistencia no uniforme del vítreo, repetir a partir del paso 2.2.1 con mayor tiempo de homogeneización.
   3. Recolecte sobrenadante de ambas muestras y diluya el humor vítreo y las muestras de plasma en proporción 1:10 y 1:20, respectivamente, con PBS.
3. Cuantificación de proteínas y relación proteína vítreo-plasma
   1. Para cuantificar la concentración de proteínas en muestras de humor vítreo y plasma, agregue 5 μL de muestras diluidas a 250 μL de reactivo Bradford, mezcle bien y lea la absorbancia a 590 nm en 40 min.
      NOTA: Si el valor de absorción de las muestras es superior a 1.0, diluya aún más las muestras y repita el procedimiento del paso 2.2.3.
   2. Normalizar el nivel de proteína vítrea a nivel de proteína plasmática de la misma rata y medir la diferencia de pliegue entre ratas sanas vs. diabéticas.

3. Angiografía por fluorescencia

1. Inyección de colorante _{FITC-dextran70000}
   1. Anestesiar una rata macho Wistar diabética de 2 a 3 meses de edad junto con el control de la misma edad (14 a 15 semanas) utilizando isoflurano al 3% y confirmar el reflejo de extracción del pedal (pellizco del dedo del pie). Sumerja la cola en un vaso de precipitados que contenga agua tibia (37-40 °C). Limpie la cola con etanol al 70% antes de inyectar el tinte. Localice la vena lateral de la cola y marque la posición de inyección en la parte inferior de la cola.
      NOTA: Si la inserción de la aguja falla, intente insertarla en otra ubicación por encima de la posición actual (punta a la base de la cola). Sin embargo, se recomienda inyectarse una vez, ya que los pinchazos repetidos pueden conducir al desarrollo de estrés en la rata, lo que podría causar vasoconstricción.
   2. Inyecte 1 ml de solución de tinte _{FITC-dextran70000 de 50} mg/ml a través de la vena de la cola y deje que el tinte circule durante 5 min. Eutanasiar a la rata con una dosis alta de pentobarbital (150 mg / kg), inyectado a través de la vía intraperitoneal. Ningún latido cardíaco detectable confirma la muerte dentro de 2-5 min. Enucle el ojo como se menciona en el paso 1.1.1.
      NOTA: Si es necesario, el ojo se puede fijar en solución de formaldehído al 4%, durante no más de 30 min.
2. Preparación de montaje plano
   1. Para preparar soportes planos, mantenga las herramientas de disección listas junto con las diapositivas y los cubrebocas. Coloque el ojo en una placa de Petri llena de PBS refrigerado y comience a diseccionar el ojo como se menciona en el paso 1.2.2.
   2. Ahora coloque la punta de un forceps puntiagudo entre la esclerótica y la retina. Muévalo suavemente a lo largo del borde de la copa, asegurándose de que la retina no esté unida a la esclerótica en ningún momento. Si hay alguna obstrucción, corte lentamente esa porción a lo largo del borde con micro tijeras curvas.
   3. Una vez que se confirma que la retina no está unida a la esclerótica desde ningún lado, corte cerca del disco óptico, haciendo un pequeño orificio tal que la retina se desprenda completamente de la esclerótica. Empuje lentamente la retina en la solución de PBS y colóquela en un portaobjetos plano limpio con la ayuda de una espátula o fórceps.
   4. Usando micro tijeras o cuchillas de bisturí, haga cortes menores en el tejido de la retina, dividiéndolo en cuatro cuadrantes. Asegúrese de que los cortes estén al menos a 2 mm de distancia del orificio dejado por el disco óptico en el centro, como se muestra en la Figura 1.
   5. Retire el exceso de PBS de los lados del tejido con puntas de 0,2 ml sin perturbar el soporte plano.
   6. Coloque una gota de medio de montaje antidesvanecimiento (50 μL a 100 μL) en un soporte plano, cúbralo con un estuche y visualice inmediatamente bajo un microscopio confocal.
      NOTA: Mantenga la luz mínima durante todo el procedimiento.
3. Visualización de montaje plano
   1. Visualice el montaje plano bajo el objetivo 10x de un microscopio confocal. Realice el escaneo de mosaicos para capturar todo el montaje plano como una sola imagen. El número de baldosas depende del tamaño de la montura plana retinal. Además, realice el apilamiento Z para visualizar las venas y arterias en diferentes focos (el tamaño preferido para la pila Z es de 5 μm, dependiendo de cuál, el número de pasos de la pila Z varía).
   2. Utilice el detector PMT y HyD en % de ganancia como 700-900 y 100-150, respectivamente. Elija el rango de emisión entre 510-530 nm para el tinte FITC-dextrano.

Results

Histología retiniana
En la retina diabética, las células de la retina sufren degeneración. Además, el grosor de las capas retinianas aumenta debido al ^edema22. Las imágenes obtenidas después de la tinción de hematoxilina y eosina se pueden utilizar para el recuento celular y la medición del grosor de diferentes capas, como se muestra en la Figura 2 utilizando ImageJ.

Ensayo de ruptura de la barrera sangre-retina<...

Discussion

Histología
La histología retiniana se realiza para visualizar los cambios morfológicos de las células y capas de la retina. Se deben optimizar varios pasos, incluida la elección de la solución fijadora, la duración de la fijación, la deshidratación y la impregnación de parafina. El tamaño del tejido no debe exceder los 3 mm, ya que la penetración del fijador se vuelve lenta. El paraformaldehído al 4% comúnmente utilizado conduce al desprendimiento de retina incluso en el ojo sano debido a la osmolarid...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histología
Reactivos
Isoflurano	Abbott		Agente anestésico
Clorhidrato de ketamina	Troikaa Pharmaceuticals		Agente anestésico
Xilacina	Inmunológicos indios Agente	anestésico
Pentobarbital sódico	Zora Pharma		Agente de eutanasia
Solución fijadora (1 % formaldehído, 1,25 % Glutaraldehído	HiMedia, Avra	MB059, ASG2529	Preparado internamente
Etanol	Hayman	F204325	Deshidratación
Xileno HiMedia		MB-180	Limpieza de etanol o parafina
Cera de parafina	HiMedia GRM10702		utilizado para la inclusión de tejidos
Glycerol	HiMedia	TC503	Para preparar portaobjetos recubiertos de albúmina. El glicerol y la albúmina de huevo se mezclan en una proporción de 1:1 para recubrir en portaobjetos
Ácido clorhídrico	Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.	65955	Para la preparación de alcohol ácido al 1 %
Ácido acético	HiMedia	AS119	Para la preparación de eosina
Agua de Scotts	Leica	3802900	Reactivo azulado
Solución de Papanicolaou 1b Solución de hematoxilina	Sigma	1.09254.0500	Tinción de núcleos
Eosina	HiMedia	GRM115	Tinción de citoplasma, se preparó una solución al 0,25 % Medios de
montaje DPX	Sigma	6522	Visualización y protección de secciones de retina
Equipments
	Borosil
Stephens Instruments	S5-1200	Pinza	disección
Colibri	Stephens Instruments	S5-1135	Disección
Micro tijera curva	Stephens Instruments	S7-1311	Disección
Tijera Vannas	Stephens Instruments	S7-1387
Disección Tijera de iris	Stephens Instruments	S7-1015	disección
	HiMedia	PW1292	Para sujetar el tejido durante el procesamiento de histología
Baño de agua	GT Sonic	GT Sonic-D9	Mantenimiento de la temperatura
Estación de inclusión de parafina	Myr	EC 350	Preparación de bloques de parafina
Microtome	Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.	YD-335A	Cuchillas de seccionamiento
	Leica	Leica 818	Portaobjetos de seccionamiento
	HiMedia	BG005	Sujeción de secciones de tejido de parafina
Cubreobjetos	HiMedia	BG014C	Para cubrir el tejido después de añadir medios
de montajeRuptura de la barrera de la retina sanguínea>
Reactivos
	Sigma	B6916	Cuantificación
de proteínasEquipos
pinza corneal	Stephens Instruments	S5-1200	disección
Colibri	Stephens Instruments	S5-1135	Disección
Micro tijera curva	Stephens Instruments	S7-1311	Disección
Tijera Vannas	Stephens Instruments	S7-1387	Disección
Tijera de iris	Stephens Instruments	S7-1015	Cristalería de disección
	Borosil	No aplicable
Tubos recubiertos de EDTA	J.K Diagnostics	No aplicable	Separar el plasma de la sangre total
Tubos de homogeneización	MP Biomedicals	SKU: 115076200-CF	Homogeneización de vítreo
Tapones de homogeneización	MP Biomedicals	SKU: 115063002-CF	Homogeneización de perlas de vidrio vítreas
	MP Biomedicals	SKU: 116914801	Homogeneización del vítreo
Homogeneizador	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A	Homogeneización de placa vítrea de
96 pocillos - Grenier transparente		GN655101	Cuantificación de proteínas
Lector de placas Dispositivos	moleculares	SpectrMax M4	Medición de absorbancia
Centrífuga	REMI	CPR240 Plus	Centrifugación
fluorescencia fuerte
Reactivos
Isoflurano	Abbott	B506	Anestesia
FITC-dextrano 70 kD (FITC, Dextrano, Dilaurato de Dibutilina, DMSO	FITC, Dextrano y Dilaurato de Dibutilina de Sigma; DMSO de HiMedia	FITC-F3651,Dextran-31390,Dilaurato de dibutilina -29123, DMSO-TC185	Preparado internamente
Sigma	fluoroshiado	F6182	Montaje antidecoloración mediana
Equipos
	Stephens Instruments	S5-1200	Pinza de disección
Colibri	Stephens Instruments	S5-1135	Disección
Micro tijera curva	Stephens Instruments	S7-1311	Disección
Vannas tijera	Stephens Instruments	S7-1387	Disección
Tijera de iris	Stephens Instruments	S7-1015	Disección
Cristalería	Borosil	No aplicable
Portaobjetos HiMedia		BG005	Preparación de montaje plano
Cubreobjetos	HiMedia	BG014C	Para cubrir el tejido después de añadir medios de montaje
Microscopio confocal	Leica	DMi8	Visualización de montaje plano