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Artículo de método

Un modelo de abrasión epitelial para estudiar la cicatrización de heridas corneales

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DOI:

10.3791/63112

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29 de diciembre de 2021

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1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

En este artículo

Resumen

Aquí, se describe un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo de cicatrización de heridas corneales es altamente reproducible y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de enfermedades.

Resumen

La córnea es crítica para la visión, ya que representa aproximadamente dos tercios del poder refractivo del ojo. Crucial para el papel de la córnea en la visión es su transparencia. Sin embargo, debido a su posición externa, la córnea es altamente susceptible a una amplia variedad de lesiones que pueden conducir a la pérdida de transparencia corneal y eventual ceguera. La cicatrización eficiente de heridas corneales en respuesta a estas lesiones es fundamental para mantener la homeostasis corneal y preservar la transparencia corneal y las capacidades refractivas. En caso de cicatrización comprometida de la herida corneal, la córnea se vuelve vulnerable a infecciones, ulceraciones y cicatrices. Dada la importancia fundamental de la cicatrización de heridas corneales para la preservación de la transparencia y la visión corneales, una mejor comprensión del proceso normal de curación de heridas corneales es un requisito previo para comprender la cicatrización deficiente de heridas corneales asociadas con infecciones y enfermedades. Hacia este objetivo, los modelos murinos de heridas corneales han demostrado ser útiles para promover nuestra comprensión de los mecanismos de curación de heridas corneales que operan en condiciones fisiológicas normales. Aquí, se describe un protocolo para crear una abrasión epitelial corneal central en ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. En este modelo, se utiliza una trefina circular de 2 mm de diámetro, centrada sobre la córnea, para demarcar el área de la herida. El palo de golf se utiliza con cuidado para desbridar el epitelio y crear una herida circular sin dañar la membrana basal epitelial corneal. La respuesta inflamatoria resultante procede como una cascada bien caracterizada de eventos celulares y moleculares que son críticos para la curación eficiente de heridas. Este modelo simple de curación de heridas corneales es altamente reproducible y bien publicado y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de la enfermedad.

Introducción

La córnea es el tercio anterior transparente del ojo. La córnea cumple varias funciones, incluida la protección de las estructuras internas del ojo y la formación de una barrera estructural que protege el ojo contra las infecciones1. Más importante aún, la córnea es crítica para la visión, proporcionando aproximadamente dos tercios del poder refractivo del ojo 2,3. Crucial para el papel de la córnea en la visión es su transparencia. Sin embargo, debido a su posición hacia afuera, la córnea está expuesta a una amplia variedad de lesiones en el día a día que pueden conducir a la interrupción de su función de barrera, pérdida de transparencia y eventual ceguera. La pérdida de transparencia corneal es una de las principales causas de discapacidad visual en todo el mundo 4,5. Las abrasiones corneales son una razón común para las visitas a la sala de emergencias (ER), que representa la mitad de los casos relacionados con los ojos presentados en la ER6. Se estima que más de 1 millón de personas sufren lesiones relacionadas con los ojos anualmente en los Estados Unidos7. La cicatrización eficiente de heridas corneales en respuesta a estas lesiones es fundamental para mantener la homeostasis corneal y preservar su transparencia y capacidades refractivas. En caso de cicatrización comprometida de la herida corneal, la córnea se vuelve vulnerable a infecciones, ulceraciones y cicatrices 8,9. Además, la creciente popularidad de las cirugías refractivas coloca un desafío traumático único en la córnea10. Dada la importancia fundamental de la cicatrización de heridas corneales para la preservación de la transparencia y la visión corneales, una mejor comprensión del proceso normal de curación de heridas corneales es un requisito previo para comprender la cicatrización deficiente de heridas corneales asociadas con infecciones y enfermedades.

Con ese fin, se han desarrollado varios modelos animales de cicatrización de heridas corneales 11,12,13,14,15. Los modelos murinos de curación de heridas corneales han demostrado ser útiles para promover nuestra comprensión de los mecanismos de curación de heridas corneales que operan en condiciones fisiológicas normales. Se han empleado diferentes tipos de heridas corneales en el estudio de la cicatrización de heridas corneales, cada una adecuada para investigar diferentes aspectos del proceso de curación de heridas. Los tipos más comunes de modelos de heridas utilizados en los estudios de cicatrización de heridas corneales son los modelos de heridas mecánicas y químicas. Las heridas corneales químicas, que en su mayoría implican la creación de quemaduras alcalinas en la córnea, son útiles para estudiar las úlceras corneales, la opacificación y la neovascularización13. Las heridas corneales mecánicas implican heridas por desbridamiento (abrasión) y heridas por queratectomía 14,15,16. Una membrana basal epitelial corneal intacta o rota define las heridas de desbridamiento y queratectomía, respectivamente. En las heridas de desbridamiento, la membrana basal epitelial permanece intacta, mientras que en las heridas de queratectomía, la membrana basal se rompe con la penetración principalmente en el estroma anterior. Las heridas de desbridamiento son más útiles para estudiar la reepitelización, la proliferación de células epiteliales, la respuesta inmune y la regeneración nerviosa después de la herida corneal. Las heridas de queratectomía, por otro lado, son más útiles para estudiar la cicatrización corneal14,15.

Aquí, se describe un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo simple de curación de heridas corneales es altamente reproducible y bien publicado y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de la enfermedad17.

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Protocolo

Todos los protocolos de animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Houston y Baylor College of Medicine. Las pautas descritas en la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) sobre el uso de animales en la visión y la investigación oftálmica se siguieron en el manejo y uso de los ratones.

1. Preparación

  1. Preparación de la solución de fluoresceína
    1. Prepare una solución de fluoresceína al 1% disolviendo 10 mg de sal de fluoresceína sódica en 1 ml de solución salina estéril o solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) 1x.
      NOTA: Prepare la solución de fluoresceína sódica el día de uso o un día antes para evitar la contaminación microbiana. Cuando se prepare un día antes de su uso, guarde la solución de fluoresceína a 4 °C lejos de la luz. Envolver tubos con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo.
    2. Divida la solución en alícuotas adecuadas para su uso en un solo experimento. Se utiliza 1-1,5 μL de solución de fluoresceína por ratón por punto de tiempo. Utilice la siguiente fórmula para calcular el volumen de alícuota apropiado para un solo experimento:
      figure-protocol-1
      NOTA: Por ejemplo, si se estudian seis ratones en un solo experimento con el tamaño de la herida monitoreado en cinco puntos de tiempo, el volumen de alícuota adecuado para ese solo experimento sería:
      figure-protocol-2
  2. Preparación de cóctel de ketamina/xilazina para anestesia de ratones.
    1. Para preparar 10 ml de cóctel, mezcle 2,0 ml de ketamina (100 mg/ml) con 1,0 ml de xilazina (20 mg/ml) y agregue 7,0 ml de PBS estéril. Prepare el cóctel de ketamina/xilazina un día antes o el día de la cirugía.
      NOTA: Todas las soluciones deben usarse a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

2. Anestesia

  1. Pesar el ratón (ratones de tipo salvaje C57BL/6 de 8-12 semanas de edad) para determinar la cantidad adecuada de anestésico a administrar. Utilice la técnica de sujeción del ratón a dos manos para sujetar y manipular ratones para la inyección del anestésico18. Administrar el cóctel de ketamina/xilazina por vía intraperitoneal (p.i.) a una concentración final de 80 mg/kg de ketamina y 8 mg/kg de xilazina.
  2. Espere hasta que se logre la anestesia completa antes de realizar una herida corneal en el ratón. Evalúe la profundidad de la anestesia evaluando el reflejo del pedal después del pellizco del dedo del pie. Cuando se logra la anestesia adecuada, el ratón no debe moverse al pellizcar el dedo del pie.
    NOTA: Debido a que los ratones pierden rápidamente el calor corporal durante la anestesia, es importante proporcionar una fuente de calor para que los ratones prevengan la hipotermia. Coloque los ratones en una fuente de calor (almohadilla térmica) durante las etapas de anestesia y recuperación.

3. Creación de herida corneal

  1. Enrolle solo el ojo derecho o izquierdo. Mantener la consistencia con el ojo (es decir, izquierdo o derecho) que se lesiona al pasar del ratón al ratón.
    NOTA: Debido a que las abrasiones dañan los nervios corneales y reducen la agudeza, herir ambos ojos puede causar molestias y deterioro significativos. Dado que los analgésicos tienen el potencial de suprimir las respuestas inflamatorias, su uso puede ser un factor de confusión en ciertos experimentos destinados a comprender la inflamación corneal. Evitar los analgésicos en los experimentos de heridas corneales fue aprobado por nuestro Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
  2. Para crear la herida corneal epitelial
    1. Bajo un microscopio de disección, use la trefina de 2 mm de diámetro (ver Figura 1) para demarcar el centro de la córnea, manteniendo el ojo bien abierto usando el pulgar y el dedo índice para sostener los párpados. Gire suavemente la trefina para causar una impresión en el epitelio corneal.
      NOTA: Se debe tener cuidado de no aplicar una presión excesiva al usar la trefina, ya que esto puede provocar perforación corneal. Además, se debe tener cuidado de colocar la trefina centralmente. Las pupilas se pueden utilizar como un punto de referencia para localizar el centro de la córnea.
    2. Bajo un microscopio de disección, sostenga el palo de golf romo (ver Figura 1) a aproximadamente 45 ° de la superficie de la córnea dentro del área demarcada con la trefina. Raspar cuidadosa y continuamente el epitelio dentro del área demarcada con el spud para desbridar el epitelio.
      NOTA: No aplique fuerza excesiva en el desbridamiento, ya que también puede causar perforación corneal. Los ojos de los ratones pueden secarse durante el proceso de herida, lo que dificulta el desbridamiento. En tal caso, aplique PBS estéril en la superficie ocular para mantener una hidratación óptima.

figure-protocol-3
Figura 1: 2 mm trephine y palo de golf romo spud. La trefina se utiliza para demarcar una región circular en el centro de la córnea, y el palo de golf spud se utiliza para eliminar el epitelio dentro de la región demarcada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Monitoreo del cierre de heridas y reepitelización

  1. Pipetear 1-1.5 μL de solución de fluoresceína al 1% sobre la superficie herida e imagen de la córnea utilizando un microscopio digital con una fuente de luz azul.
  2. Adquiera imágenes dentro del primer minuto de la adición de solución de fluoresceína para evitar que se propague al epitelio circundante, lo que lleva a una sobreestimación del tamaño de la herida. Las córneas heridas se toman imágenes en momentos específicos (es decir, 0 h, 12 h, 18 h, 24 h y 30 h) después de la herida.
    NOTA: En todos los puntos de tiempo, las imágenes se realizan bajo anestesia; La ketamina/xilazina se usa en el momento de la herida, mientras que el isoflurano se usa en puntos de tiempo posteriores. Los ratones se alojan individualmente en jaulas separadas durante la duración del monitoreo del cierre de la herida. Cuando se alojan juntos, los ratones tienden a lamer los ojos de los compañeros de camada, un comportamiento que se ha demostrado que afecta la cicatrización de heridas en diferentes tejidos19,20.
  3. Analice las imágenes capturadas, rastreando el área de la herida utilizando un software de análisis de imágenes. El área de la herida para cada punto de tiempo se expresa como un porcentaje del área original de la herida a 0 h.

5. Imágenes y análisis de inmunofluorescencia

  1. Sacrificar ratones por un método aprobado por IACUC (en este caso, sobredosis de dióxido de carbono seguido de dislocación cervical) en los puntos de tiempo deseados después de la herida.
  2. Cosecha los globos oculares presionando suavemente el canto lateral para desplazar el globo ocular usando una tijera curvada por el iris. Guíe las tijeras detrás del globo ocular para agarrar firmemente el nervio óptico y luego corte el nervio, lo que permite que se elimine el globo ocular.
  3. Fije cada globo ocular en 1 ml de 1 pb pbis que contenga paraformaldehído al 2% durante 1 h a temperatura ambiente, y luego lave tres veces en 1 ml de 1 pbs durante 5 minutos cada uno.
  4. Bajo un microscopio de disección, use una cuchilla quirúrgica para hacer una incisión en la esclerótica, aproximadamente 500 μm distales al limbo, y luego corte a través del globo. Usando fórceps, retire suavemente la materia del iris de la córnea y luego recorte cuidadosamente el tejido escleral, asegurándose de dejar el limbo intacto.
  5. Haga cuatro cortes radiales parciales, cada uno de aproximadamente 1 mm de longitud, que se extienden desde la córnea periférica y se detienen por debajo del centro para permitir que la córnea se aplane.
  6. Permeabilizar y bloquear córneas en 1 ml de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% y TritonX -100 al 0,01% en 1x PBS durante 15 min, seguido de bloqueo en BSA al 2% en 1x PBS durante 45 min adicionales a temperatura ambiente.
  7. Incubar córneas durante la noche a 4 °C en un cóctel de anticuerpos conjugados fluorocromos únicos directamente etiquetados preparados en 1x PBS que contienen 2% de BSA.
    NOTA: Los anticuerpos están dirigidos a etiquetar células y tejidos específicos de interés. Por ejemplo, el endotelio, los neutrófilos y las plaquetas están marcados con anticuerpos anti-CD31 21,22, anti-Ly-6G 23,24 y anti-CD4125,26, respectivamente. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se añade al cóctel de anticuerpos para visualizar los núcleos.
  8. Después de la incubación, lave las córneas tres veces en 1x PBS durante 15 minutos cada una.
  9. Monte córneas en un portaobjetos de microscopio en una gota de medio de montaje de fluorescencia antidesvantilizante, cubra con un labio de cubierta e imagen con el aumento deseado (objetivo de 4x a 100x) usando un microscopio de luz de fluorescencia. Tome imágenes de espesor completo de la córnea a través de diferentes regiones como se ilustra en la Figura 2A.
    NOTA: El patrón de análisis microscópico ilustrado en la Figura 2A se utiliza para analizar cambios regionales específicos en la inflamación y la división celular. Tanto la tinción DAPI como la Ly-6G se utilizan para identificar los neutrófilos extravasculares. Con la tinción DAPI, los neutrófilos esféricos tienen un núcleo distinto en forma de herradura o rosquilla (Figura 2B).

figure-protocol-4
Figura 2: Estrategia de imagen corneal e infiltración de neutrófilos después de la abrasión central. (A) Representación esquemática de un conjunto de córnea que muestra nueve campos microscópicos a lo largo del diámetro de la córnea. El área gris representa el área original de la herida. El ancho de cada región es de 500 μm. (B) Observe la forma distintiva de herradura o rosquilla de los núcleos de neutrófilos con tinción DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

La Figura 3 muestra una micrografía electrónica de transmisión de una herida corneal creada con el palo de golf romo spud, demostrando que la membrana basal epitelial está intacta después de la lesión.

figure-results-1
Figura 3: La membrana basal epitelial permanece intacta después de la abrasión corneal. Micrografía ...

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Discusión

El propósito de este artículo de métodos fue describir un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo murino se ha utilizado para estudiar la inflamación corneal y su contribución a la cicatrización de heridas. Este tipo de modelo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de cicatrización de heridas corneales en condiciones fisiológicas normales y en patologías 17,28,29,41,42.

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Financiamiento: Apoyado por: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. y R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), y Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud, o Sigma Xi.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo anti-CD31BD Bioscience, Pharmingen550274
Anticuerpo anti-CD41BD Bioscience, Pharmingen553847
Anticuerpo anti-Ly6GBD Bioscience, Pharmingen551459
Albúmina sérica bovina (BSA)ThermoFisher scientificB14
C57BL/6 ratonesJackson Laboratories664
DAPISigma AldrichD8417
DeltaVision Microscopio de fluorescencia de deconvolución de campo amplioGE Life Sciences
Microscopio de disecciónLeica microsystems
Balanzas electrónicas de carga superior (báscula de pesaje)Fisher Scientific
EthanolThermoFisher scientificT038181000CS
Espiga para palos de golfStephens instrumentsS2-1135
Tijeras de curva de irisFisher Scientific31212
IsofluranoPatterson veterinario07-893-1389
KetaminaPatterson veterinario07-890-8598
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)ThermoFisher scientificAM9624
Sal de fluoresceína sódicaSigma Aldrich46970
Cuchilla quirúrgica (cuchilla scapel10022-00
TrephineIntegra Miltex33-31
TritonX -100Fisher Scientific50-295-34
PinzaHerramientas Fine Science11923-13
XilacinaPatterson veterinaria07-808-1947

Referencias

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