Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatiserad tvådimensionell Spatiotemporal analys av mobila enmolekyliga FRET-sonder

Published: November 23, 2021 doi: 10.3791/63124
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Institute of Applied Physics, TU Wien, 2Institute for Hygiene and Applied Immunology, Center for Pathophysiology, Infectiology and Immunology, Medical University of Vienna

Summary

Denna artikel presenterar en metod för spatiotemporal analys av mobila, en-molekyl Förster resonans energiöverföring (smFRET)-baserade sonder med hjälp av widefield fluorescence mikroskopi. Den nyutvecklade mjukvaruverktygssatsen gör det möjligt att bestämning av smFRET-tidsspår av rörliga sonder, inklusive rätt FRET-effektivitet och de molekylära positionerna, som tidens funktioner.

Abstract

Enmolekylig Förster resonansenergiöverföring (smFRET) är en mångsidig teknik som rapporterar om avstånd i subnanorometern till nanometerområdet. Det har använts i ett brett spektrum av biofysiska och molekylärbiologiska experiment, inklusive mätning av molekylära krafter, karakterisering av konformationell dynamik av biomolekyler, observation av intracellulär colocalization av proteiner och bestämning av receptor-ligand interaktionstider. I en widefield mikroskopi konfiguration utförs experiment vanligtvis med hjälp av yto immobiliserade sonder. Här presenteras en metod som kombinerar enmolekylspårning med alternerande excitation (ALEX) smFRET-experiment, vilket möjliggör förvärv av smFRET-tidsspår av ytbundna, men mobila sonder i plasmamembran eller glasstödda lipidbilayers. För analys av inspelade data utvecklades en automatiserad insamling av programvara med öppen källkod som stöder (i) lokalisering av fluorescerande signaler, ii) spårning av en partikel, iii) bestämning av FRET-relaterade kvantiteter inklusive korrigeringsfaktorer, iv) strikt verifiering av smFRET-spår och (v) intuitiv presentation av resultaten. De genererade data kan bekvämt användas som indata för vidare utforskning via specialiserad programvara, t.ex. för bedömning av sonders diffusionsbeteende eller undersökning av FRET-övergångar.

Introduction

Förster resonans energiöverföring (FRET) har varit en viktig drivkraft i molekylär biologisk och biofysisk forskning, eftersom det möjliggör undersökning av processer vid sub-nanometer upplösning. Eftersom effektiviteten i energiöverföringen mellan donator- och acceptorfluoforer starkt beror på interfärgningsavståndet i subnanorometern till nanometerområdet, har den effektivt använts som spektroskopisk linjal för att utforska statisk och dynamisk konformation av biomolekyler1,2,3,4. Dessutom har FRET-fenomenet använts i stor utsträckning för colocalization studier av membranassocierade och intracellulära proteiner på en bulknivå5,6. Under de senaste två decennierna har metoden anpassats för övervakning av smFRET-händelser7, vilket bidrog till att avsevärt öka tidsmässiga och rumsliga upplösningen och löste även sällsynta subpopulationer i heterogena prover. Utrustad med dessa tekniker fick unika insikter om dynamiken i molekylära maskiner som transkriptionsbehandlingshastigheten för RNA-polymeras II8, replikeringshastighet för DNA-polymeraser9,10, nukleosomflyttningshastighet11, transkripteringssplissering och stallningsgrad för monterade splitsosomer12, aktiviteten hos ribosomala subpopulationer13 och gåhastigheten hos kinesinmotorer14 , för att nämna några. Receptor-ligand interaktion varaktigheter15 och molekylära krafter16 har kvantifierats.

Intensitetsbaserade smFRET-studier förlitar sig vanligtvis på sensibiliserade utsläpp för att mäta FRET-effektivitet: en stråldelare i emissionsbanan separerar rumsligt ljus som härrör från givaren och acceptor fluoroforer på givarens excitation, vilket möjliggör kvantifiering av individuell fluorescensintensiteter. Effektiviteten kan därefter beräknas som den del av fotoner som avges av acceptorn med avseende på det totala fotonantalet17. Dessutom tillåter acceptor excitation efter givarens excitation (ALEX) mätning av stökiometrin hos FRET-händelserna, vilket bidrar till diskriminering mellan sanna låga FRET-signaler från signaler som uppstår, t.ex. från sonder med en fotobleached acceptor fluorophore18.

Fret-experiment med en molekyl utförs ofta på ett av två sätt. För det första belyses en liten region i provvolymen med hjälp av ett konfokalt mikroskop. En sondmolekyler i lösning är upphetsade när de råkar spridas inom brännvolymen. Med denna teknik kan snabba fotonräkningsdetektorer användas, vilket möjliggör tidsupplösning under mikrosekunder. För det andra immobiliseras sonder specifikt på ytor och övervakas via widefieldmikroskopi, ofta med hjälp av total intern reflektion (TIR) konfiguration för att minimera bakgrundsfluorescens. Probe immobilisering möjliggör mycket längre inspelningstider än att använda den första metoden. Dessutom tillåter det större synfältet övervakning av flera sonder parallellt. Behovet av en kamera gör denna metod långsam jämfört med den som beskrivs ovan. Tidsupplösningen är begränsad till millisekunden till andra intervallet.

Om det krävs långa tidsspår, t.ex. för att studera dynamiska processer på en millisekund till andra gången, är den första metoden inte tillämplig, eftersom fluorescenssprängningarna vanligtvis är för korta. Det andra tillvägagångssättet misslyckas när immobilisering inte är möjligt, t.ex. i experiment med levande celler med sonder som sprider sig i cellmembranet. Dessutom har det observerats att biologiska modellsystem kan variera sitt svar dramatiskt beroende på den kontaktade ytans rörlighet16.

Medan kombinerade smFRET- och single-particle tracking experiment som registrerar mobila FRET-sonder har utförts under de senaste19, finns det ingen offentligt tillgänglig programvara för utvärdering av data. Detta föranledde utvecklingen av en ny analysplattform, som möjliggör bestämning av flera egenskaper hos mobila fluorescerande sonder, inklusive smFRET-effektivitet och stökiometri, positioner med subpixelnoggrannhet och fluorescensintensiteter som tidens funktioner. Metoder för att filtrera de resulterande spåren genom att undersöka stegvis blekningsbeteende, närmaste granne avstånd, utsläpp intensiteter och andra egenskaper fastställdes för att uteslutande välja korrekt syntetiserade och funktionella en-sond molekyler. Programvaran stöder också experimentella och analytiska tekniker som nyligen överenskommits i en multilaboratory studie för att producera tillförlitliga, kvantitativa smFRET-data17. I synnerhet följer genomförandet de validerade förfarandena för beräkning av FRET-effektivitet och stökiometri. Fluorescensintensiteter vid givarens excitation i givarens utsläppskanal IDD och acceptor emissionskanal IDA används för beräkning av den uppenbara FRET-effektiviteten Eapp med Eq (1).

Equation 1 (1)

Med hjälp av fluorescensintensiteten i acceptorutsläppskanalen vid acceptor excitation IAA beräknas den uppenbara stökiometrin med eq (2).

Equation 2 (2)

FRET-effektiviteten E och stökiometrin S kan härledas från Eapp och Sapp genom att beakta fyra korrigeringsfaktorer.

Equation 3

α beskriver läckaget av donatorfluorescens i acceptorens utsläppskanal och kan bestämmas med hjälp av ett prov som endast innehåller donatorfluoforer eller genom att analysera delar av banor där acceptorn har blekts. δ korrigerar för direkt excitation av acceptorn av givarexcitationsljuskällan och kan mätas med hjälp av ett prov med endast acceptorfluoforer eller genom att analysera delar av banor där givaren har blekts.

Equation 4.

γ skalar IDD för att korrigera olika detektionseffektivitetseffektivitet i givar- och acceptorutsläppskanaler och olika kvanteffektivitetsvinster hos fluoroforerna. Faktorn kan beräknas genom att analysera ökningen av donatorintensiteten vid acceptor blekning i banor med hög FRET-effektivitet20 eller genom att studera ett prov med flera diskreta FRET-tillstånd.

Equation 5

β skalar IAA för att korrigera för olika effektivitetsvinster av givare och acceptor excitation. Om γ fastställdes via acceptans blekningsanalys kunde β beräknas utifrån ett prov av känt förhållande mellan donator och acceptor21. Annars ger det flerstatliga FRET-exemplet också β.

Tillsammans möjliggör korrigeringarna beräkningen av den korrigerade FRET-effektiviteten med eq (3).

Equation 6 (3)

och den korrigerade stökiometrin med Eq (4).

Equation 7 (4)

Helst ger den korrigerade stökiometrin för ett 1:1 donator-till-acceptor-förhållande S = 0,5. I praktiken ger ett minskat signal-till-brus-förhållande en spridning av de uppmätta värdena för S, vilket hindrar diskrimineringen från signaler endast för donatorer (S = 1) och endast acceptanssignaler (S = 0). De resulterande tidsspåren kan användas som indata för en mer detaljerad analys av enmolekylbanorna för att erhålla information som spatiotemporala kraftprofiler16, rörligheten för enmolekylhändelserna22 eller övergångskinetik mellan olika tillstånd1.

Följande protokoll beskriver experimentella parametrar och procedurer för smFRET-spårningsexperiment, samt arbetsprincipen bakom dataanalys med hjälp av den nyutvecklade programvarusviten. För förvärv av experimentella data rekommenderas att man använder en mikroskopiinställning som uppfyller följande krav: i) förmåga att upptäcka utsläpp av enstaka färgämnesmolekyler; ii) Belysning av bredfält: särskilt för experiment med levande celler rekommenderas total intern reflektion (TIR23,24,25) konfiguration. iii) Rumslig separation av emissionsljuset efter våglängd så att givarens och acceptorfluorescensen projiceras på olika regioner i samma kamerachip25 eller olika kameror. iv) Modulering av ljuskällor för donator och acceptor excitation med millisekundsprecision, t.ex. med hjälp av direkt modulerbara lasrar eller modulering via acoustooptiska modulatorer. Detta tillåter stroboscopic belysning för att minimera fotobleaching av fluoroforer samt alternerande excitation för att bestämma stoichiometrier; v) utdata för en fil per inspelad bildsekvens i ett format som kan läsas av PIMS Python-paketet26. I synnerhet stöds TIFF-filer med flera sidor.

Protocol

1. Programvaruförutsättningar

  1. Installera miniconda Python distribution27 (minsta nödvändiga Python-version: 3.7).
  2. Öppna en Anaconda-prompt på Windows Start-menyn eller öppna en terminal och kör conda aktiveras om du använder Linux eller macOS.
  3. Aktivera den community-underhållna conda-smedge-paketdatabasen28 genom att köra följande kommandon:
    conda config --add channels conda-forge
    conda config --set channel_priority strikt
    conda uppdatering --all
  4. Installera de nödvändiga Python-paketen genom att köra:
    conda installera opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab
  5. Bekanta dig med JupyterLab, analysprogramvarans användargränssnitt (se programvarudokumentationen29).
  6. Installera git-versionskontrollsystemet, som kommer att användas senare för att ladda ner och uppdatera analysprogramvaran. Om du använder Linux använder du distributionens pakethanteringsprogram för att ladda ner och uppdatera. Annars kör du:
    conda install git
  7. Du kan också installera sidecar Python-paketet för att visa data uppsättningar efter filtrering av steg under analysen:
    conda installera sidovagn

2. Mätning av prover

Figure 1
Bild 1: Bildförvärv. (A) Excitationssekvens. Efter att ha spelat in en valfri bild av en färgladdad cell med 405 nm laser, är givaren och acceptorn upphetsad växelvis och upprepade gånger för belysningstid till med 532 nm respektive 640 nm lasrar. Tiden mellan donator och acceptor excitation måste vara tillräckligt lång för att möjliggöra bildavläsning av kameran. Fördröjningstiden tdelay kan användas för att justera förvärvsramhastigheten och därmed observationstiden före fotobleaching. Denna panel är modifierad från 16. B) Fiducial markörer används för beräkning av koordinattransformeringarna mellan de två utsläppskanalerna. Matchande fiducials indikeras av färg. Flera skiftade bilder bör spelas in för att säkerställa att hela synfältet omfattas. C) Laserprofiler för korrigering av planfält registreras med hjälp av ett tätt märkt prov. Acceptorprofilen registreras och fotobleacheras, följt av förvärv av donatorprofilen. Flera bilder bör tas i olika provregioner, medelvärdet och jämnas ut för att minska påverkan av provfel (t.ex. den ljusa punkten i bildens mitt-topp). D) Flatfield korrigeringskarta p(x,y) beräknad från 20 laserprofil som registrerats enligt beskrivningen i C. Förkortningar: FRET = Förster resonans energiöverföring; ImDD = bilden av donatorutsläpp vid donatorexcitation; ImDA = acceptor emissionsbild vid donatorexcitation; ImAA = acceptor emissionsbild vid donatorexcitation. Skalningsstaplar = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. När du använder en emccd-kamera (Elektronförökande laddningskopplingsenhet) gör det möjligt för EM-förstärkningen att observera enmolekylssignaler vid höga signal-till-brus-förhållanden (se tillverkarens instruktioner).
  2. Excitationssekvens (se figur 1A för ytterligare information).
    1. Du kan också spela in en bild för segmentering för att begränsa dataanalysen till vissa regioner i synfältet. Till exempel excitera Fura-2-laddade celler med en 405 nm laser och fånga deras utsläpp runt 510 nm för att utvärdera endast sonder som finns i gränssnitt mellan celler och stödda lipidbilayers (SLBs). Vänta därför på att tiden tr tillåter kameraavläsning.
      OBS: På EMCCD-kameror beror tr på antalet rader i den valda intresseregionen (ROI). Därför kan det vara fördelaktigt att välja en liten AVKASTNING eftersom det minskar fördröjningen mellan bildrutor och storleken på inspelade data. Dessutom möjliggör aktivering av ramöverföringsläge ytterligare minskning av tr.
    2. Alternativt excitera donator och acceptor fluorophores upprepade gånger.
      1. Excitera donatorn för en belysningstid till (5-10 ms är vanligtvis tillräckligt kort för att undvika rörelseoskärpa) samtidigt som kameran utlöses.
      2. Vänta tills tiden tr tillåter kamera avläsning.
      3. Excitera acceptorn för när du utlöser kameran.
      4. Vänta på en tidsdär.
        OBS: Detta måste vara längre än tr för att aktivera avläsning av kameran men kan annars väljas godtyckligt. Den ska balansera kraven på tidsupplösande och spårlängd.
      5. Upprepa steg 2.2.2.1-2.2.2.4. Välj antalet upprepningar som ska vara tillräckligt stort för att säkerställa fotobleaching av minst en fluorofor per sond inom synfältet, vilket möjliggör stegvis fotobleaching analys för diskriminering av enmolekyliga signaler från aggregat.
        OBS: Att välja lämpliga till- och excitationslaserintensiteter kräver vanligtvis vissa experiment: Ju längre belysningstiderna och ju högre laserintensiteter, desto bättre är signal-till-brus-förhållandet i de resulterande bilderna, men desto kortare är de resulterande tidsspåren.
  3. Spela in ett tillräckligt antal filmer för varje prov.

3. Ytterligare mätningar för bestämning av korrigeringsfaktorer

  1. Registrera en serie slumpmässigt placerade fiduksmarkörer som är synliga i båda utsläppskanalerna för bildregistrering (dvs. att hitta den omvandling som kartlägger koordinater för givarutsläppskanalen på acceptorutsläppskanalen och vice versa). Se figur 1B.
    OBS: Bildregistrering utförs av programvaran; se steg 6.1.4.
  2. Mät intensitetsprofilen för både givar- och acceptor excitationsljuskällor för korrigering av planfält (dvs. korrigering för inhomogen excitation över hela synfältet). För detta ändamål, förbered ett prov med en hög densitet av FRET-sonder och först förvärva en bild vid acceptor excitation, följt av fotobleaching av acceptorn och efterföljande inspelning av en bild vid donator excitation. För ökad stabilitet, upprepa flera gånger i olika urvalsområden. Se figur 1C,D. Alternativt kan du spela in ett prov dekorerat med endast donatormolekylen och ett andra prov dekorerat med endast acceptorfluoforerna.
    OBS: Flatfield-korrigering utförs av analysprogramvaran; se steg 8.1.2.
  3. Registrera ett enmolekylsprov (som i avsnitt 2) av en sond utan en acceptorfluofor för att bestämma donatorutsläpp som läcker in i acceptorkanalen.
    OBS: Donatorläckage kan också beräknas från de faktiska sondernas tidsspår efter acceptor blekning. Om ett tillräckligt antal sådana händelser registreras krävs ingen ytterligare mätning. Båda alternativen stöds av analysprogramvaran; se Kompletterande information, avsnitt 3.15.
  4. Skaffa inspelningar av en sond utan donatorfluofor för kvantifiering av direkt acceptor excitation av givaren excitation ljuskälla.
    OBS: Direkt acceptor excitation kan också härledas från de faktiska sondernas tidsspår efter donatorblekning. Om ett tillräckligt antal sådana händelser registreras krävs ingen ytterligare mätning. Båda alternativen stöds av analysprogramvaran; se Kompletterande information, avsnitt 3.15.
  5. Registrera ett enmolekylsprov med två distinkta FRET-effektivitetsvinster för att korrigera för olika detektionseffektivitetseffektivitet hos givaren och acceptorutsläppskanaler och olika kvantutbyten av färgämnena.
    OBS: Sådana prover kan till exempel vara Holliday-korsningar1, som fluktuerar mellan två konformationer, eller DNA-stavar som har FRET-par fästa på olika, väldefinierade avstånd. Om sonder har hög och tillräckligt konstant FRET-effektivitet kan korrigeringen också beräknas från acceptor blekningshändelser av sonders tidsspår, i vilket fall inga ytterligare mätningar behövs. Båda alternativen stöds av analysprogramvaran; se Kompletterande information, avsnitt 3.15.

4. Enmolekylära lokaliseringsalgoritmer

OBS: Flera analyssteg kräver enmolekylslokalisering. Välj mellan en Gaussisk monteringsalgoritm30 och massberäkning i mitten31, beroende på signaltäthet, bakgrund och signal-till-brus-förhållande.

  1. För att utföra Gaussian fitting väljer du 3D-DAOSTORM30-algoritmen via respektive användargränssnitt.
    OBS: 3D-DAOSTORM är utformad för att skilja jämna signaler med överlappande punktspridningsfunktioner. Även om detta i allmänhet är en fördel, kommer det med en varning: enstaka, ljusa signaler identifieras ibland som två intilliggande, vilket kan förvirra spårningsalgoritmen och resultera i upptäckt av två korta banor istället för en enda lång.
    Ange följande parametrar (för mer information, se dokumentationen för sdt-python-biblioteket32, som tillhandahåller algoritmens implementering).
    1. radie: Ange det ursprungliga σ värdet för gaussisk passformsfunktion i pixlar beroende på den effektiva pixelstorleken.
    2. tröskelvärde: Ange en minsta amplitud (dvs. ljusaste pixelvärde, korrigerat för den uppskattade lokala bakgrunden) för att en maximal lokal intensitet ska vara i form.
      OBS: Tröskelvärdet är utan tvekan den viktigaste parametern. Om det ställs in för lågt kan buller betraktas som en fluorescenssignal, och ljusa signaler kan vara försedda med två Gaussier. Om de är för höga är dunkla signaler inte lämpliga.
    3. modell: Ställ in på 2d för att passa cirkulära Gaussians.
      OBS: De andra modellerna är inte tillämpliga på smFRET-data.
    4. hitta filter: Använd ett filter innan du hittar lokal maxima för att minska bruset, vilket är användbart i situationer med lågt signal-till-brus-förhållande. Detta kan vara i) identitet: inget filter; ii) Crocker-Grier: bandpassfilter från Crocker-Grier algoritm31,33; eller iii) Gaussisk: en gaussisk oskärpa med σ inställd av sigmaparametern.
      OBS: För Crocker-Grier bör parametern feat. size vara ungefär radien för en punktspridningsfunktion i pixlar.
      OBS: Montering utförs med hjälp av ofiltrerade rådata.
    5. min. avstånd: Montera två framåtblickande signaler åtskilda av färre än min.
      OBS: Detta kan hjälpa till i det ovan nämnda scenariot där en ljus signal felaktigt detekteras som två intilliggande signaler.
    6. storleksområde: Välj minsta och högsta σ av passformerna för att ta bort detekteringar från falska signaler på grund av brus.
  2. Välj Crocker-Grier-algoritmen via respektive användargränssnitt för att utföra massberäkning (en förfinad algoritm31 baserad på Crockers och Griers idé33).
    OBS: Denna algoritm är mycket robust även i scenarier med låg signal-till-brus och när det gäller att hantera signaler med en rad intensiteter men kan inte passa molekyler med överlappande punktspridningsfunktioner exakt.
    1. radie: Ange radien (i bildpunkter) på en disk som är tillräckligt stor för att innehålla hela punktspridningsfunktionen.
    2. signal trösk.: Ställ in minsta amplitud (ljusaste pixeln över uppskattad bakgrund) för en maximal lokal intensitet som ska analyseras.
      OBS: Om det är för lågt kan buller betraktas som en fluorescenssignal. Om de är för höga är dunkla signaler inte lämpliga.
    3. massa trösk.: Ange den minsta totala intensiteten (summan av bakgrundskorrigerade pixelvärden) för en signal som ska analyseras.
      OBS: Samma överväganden som ovan gäller.

5. Initiering av programvara

  1. Ladda ner analysskript. I en Anaconda-prompt navigerar du till en mapp för att spara analysen (med kommandot cd ) och kör
    git klon https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git målmapp
    1. Ersätt målmappen med ett beskrivande namn som 2021-06-14_Force-FRET-experiment.
      ANALYSPROGRAMVARAN kommer att hamna i den här mappen; se till att den här mappen inte finns i förväg. Vi rekommenderar att du hämtar en kopia av analysskripten för varje experiment. På så sätt är det möjligt att gå tillbaka till analysen senare, återkalla de parametrar som används och göra ändringar.
  2. Kopiera Jupyter anteckningsböcker (01. Tracking.ipynb, 02. Analys.ipynb, 03. Plots.ipynb) i den nyskapade mappen (hädanefter kallad rotmappen). Om det här är första gången du använder programvaran hämtar du dem från undermappen för anteckningsböcker i rotmappen.
    Om liknande datamängder redan har analyserats kan kopiering av anteckningsböckerna från ett tidigare experiment vara ett bekvämt alternativ, eftersom parametrarna bara kan ha ändrats något.
  3. Starta JupyterLab-servern genom att köra följande kommando i Anaconda-prompten för att öppna ett webbläsarfönster som visar JupyterLab.
    jupyter lab
    Obs: Webbläsaren är bara gränssnittet, medan processen som körs i Anaconda-prompten gör det faktiska arbetet. Som en följd av detta har stängning av webbläsarfönstret bara minimal effekt; sessionen kan återställas genom att komma åt http://localhost:8888. Om du avbryter JupyterLab-processen i prompten eller stänger prompten avslutas analysen, vilket leder till förlust av osparat arbete.
  4. I webbläsarfönstret JupyterLab använder du den vänstra rutan för att navigera till rotmappen. Dubbelklicka på 01. Tracking.ipynb för att starta den första bärbara datorn. När du har startat letar du efter en ny flik som visar rutor, så kallade celler, av Python-kod.
    Alla Jupyter-anteckningsböcker har kommentarer som beskriver funktionaliteten i varje kodcell. Dessutom kan dokumentation för varje metodanrop visas genom att placera textmarkören omedelbart före öppningen ( och trycka på Skift+Tabb.
  5. Se figur 2 för en översikt över dataanalysprocessen.

Figure 2
Bild 2: Översikt över en typisk analyspipeline. Observera att filtreringssteg är föremål för anpassning enligt den experimentella designen. Denna siffra ändras från 16. Förkortning: FRET = Förster resonans energiöverföring. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Exempeldata för att prova programvaran kan laddas ner från https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files

6. Lokalisering, spårning och fluorescensintensitetsanalys av enskilda molekyler (01. Tracking.ipynb).

  1. Använd 01. Tracking.ipynb Jupyter notebook för tillförlitlig analys av fluorescensintensitetsvärden för enmolekyliga signaler, som är skräddarsydd för exakt kvantifiering, särskilt av svaga signaler som ofta förekommer i FRET-mätningar (t.ex. på grund av låga givarsignaler vid höga FRET-händelser och vice versa).
    OBS: För detta ändamål implementeras direkt integrering av pixelintensiteterna i rådata med korrigering för den lokala bakgrunden. För skärmbilder av varje analyssteg och beskrivning av parametrar för funktionsanrop, se Kompletterande information.
    1. Ange belysningssekvensen för att tillåta val av givar- och acceptorexcitationsramar, samt bildsegmenteringsramar från inspelade bildsekvenser.
      OBS: Eftersom programvaran tillåter behandling av data som registrerats med godtyckliga belysningsprotokoll, är det nödvändigt att ange vilken ram i en bildsekvens som förvärvades samtidigt som det är spännande vilken typ av fluorofor; se Kompletterande information, avsnitt 1.2, steg 3. Bildsekvensens bildnummer bevaras.
    2. Beskriv och ladda datamängder. Analysera flera data uppsättningar samtidigt, förutsatt att de spelades in med samma belysningsinställningar. Tilldela en identifierare och ett mönster som matchar respektive bildsekvensfilnamn till varje datauppsättning. Definiera dessutom specifika datamängder för särskilda ändamål, till exempel inspelningar av fiducialmarkörer för bildregistrering, excitationsljusprofiler för korrigering av planfält och prover som endast är för givare och endast accepterare för att fastställa korrigeringsfaktorer.
    3. Välj utsläppskanaler i råa bilder om båda kanalerna spelades in med en enda kamera. För detta använder du lämplig grafisk widget för att välja lämpliga regioner för givar- och acceptorutsläpp.
    4. Lokalisera fiducial markörer i båda emissionskanalerna och utför bildregistrering. Använd det angivna användargränssnittet för att hitta lämpliga parametrar för lokaliseringsalgoritmen för både givarens och acceptorens utsläppskanaler. Se avsnitt 4 för information om lokaliseringsalgoritmer som stöds.
      OBS: Slumpmässigt fördelade fiduciella markörer kan identifieras över utsläppskanaler genom den rumsliga fördelningen av sina närmaste grannar (figur 1B). En anpassad implementering av algoritmen som föreslås för selektiv planbelysningsmikroskopi34 i sdt-python-biblioteket matchar automatiskt positionen för varje markör i givarutsläppskanalen med positionen i acceptorutsläppskanalen. En omvandling T som kartlägger givareutsläppskanalens koordinater till acceptorens emissionskanals koordinater hittas via en linjär minsta kvadrat som passar en affinomvandling till markörernas positioner35. RANSAC används för att ta hänsyn till avvikande värden, till exempel felaktigt matchade positioner från föregående steg.
    5. Lokalisera FRET-avsökningar oberoende av givaren och acceptor excitation i alla ramar och sammanfoga resultat till en tabell som innehåller det ursprungliga bildrutenumret, 2-dimensionella koordinater och en identifierare som refererar till källbildfilen.
      FÖR detta ändamål tillhandahåller programvaran användargränssnitt för att hitta lämpliga alternativ för lokaliseringsalgoritmen.
      1. Lokalisera FRET-sonder på donator excitation i summan av de bilder som erhållits från givarutsläpp ImDD och acceptor utsläpp ImDA, som knappast beror på FRET effektivitet. Information om alternativen för lokaliseringsalgoritmen finns i avsnitt 4.
        VARJE summabild beräknas genom att omvandla ImDD med hjälp av omvandlingen T som tidigare erhållits från bildregistrering och lagts till pixelvis i ImDA.
      2. Lokalisera sonder vid acceptor excitation i acceptor emissionskanalen ImAA (se avsnitt 4 för information om lokaliseringsalgoritmerna).
    6. Utför mätning av spårnings- och fluorescensintensitet.

Figure 3
Figur 3: Mätning av enmolekylsintensitet. (A) För en fluorofor som är placerad vid den orangea pixeln bestäms dess okorrigerade intensitet Iuncorr genom att summera alla pixlars intensiteter i en skiva (gula och orange pixlar) som är tillräckligt stora för att täcka alla pixlar som påverkas av signalen: Equation 9. Den lokala bakgrunden beräknas som medelvärdet av pixlarna i en ring (blå pixlar) runt disken: Equation 10, där nring är antalet pixlar i ringen. Fluorescensintensiteten I är resultatet av att subtrahera bakgrunden från den okorrigerade intensiteten, I = Iuncorr - b × ndisk, där ndisk är antalet pixlar på disken. Cirkelradien anges via feat_radius parametern för spårningsmetoden. Ringens bredd anges av parametern bg_frame. Om punktspridningsfunktionen för en signal överlappar bakgrundsringen på en annan (nederkantspanel) undantas de berörda pixlarna (röda) från lokal bakgrundsanalys. Om tvåpunktsspridningsfunktioner överlappar varandra kan fluorescensintensiteterna inte beräknas på ett tillförlitligt sätt och kasseras därför. (B, C) Simuleringar visar att applicering av en gaussisk oskärpa med en standardavvikelse på 1 pixel förbättrar signal-till-brus-förhållandet upp till en faktor på nära 2 vid låga fluorescensintensiteter (B) och introducerar knappast något fel (liten underskattning på mindre än 1%, (C))16. Dessutom är det relativa felet (dvs. (Imeas - Itruth)/Itruth, där Itruth är grundsanningen och Imeas är resultatet av analysen) konstant över hela intensitetsintervallet och avbryter därför för ratiometriska mängder som FRET-effektivitet och stoichiometrier. Alla tomter är baserade på tidigare publicerat arbete16. Förkortningar: SNR = signal-till-brus-förhållande; FRET = Förster resonans energiöverföring. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

  1. Välj lämpliga alternativ för trackpy36algorithm som används för att länka FRET-sondlokaliseringar till banor. Ställ särskilt in det maximala sökavståndet från en bildruta till nästa och antalet på varandra följande bildrutor för vilka en signal kan gå oupptäckt, vilket kan uppstå på grund av blekning eller missade lokaliseringar.
    OBS: Dessa luckor fylls via interpolation mellan föregående och efterföljande positioner. Dessa interpolerade positioner markeras och används först senare för att avläsa intensitetsvärden men inte för diffusionsanalys. Spår analyseras i koordinatsystemet för acceptorutsläppskanalen. För analys av fluorescensintensitet (steg 6.1.6.2) omvandlas spåren dessutom till koordinatsystemet för givarutsläppskanalen med hjälp av den omvända omvandlingen T-1 som erhålls via bildregistrering (se steg 6.1.4).
  2. Välj alternativ för fluorescensintensitetsberäkningsalgoritmen (se bild 3A för mer information). Ange i) radien på en disk som, när den centreras på en signals position, innehåller alla pixlar som påverkas av signalen och ii) bredden på en ring runt varje disk som används för att bestämma den lokala bakgrunden.
    OBS: För att minska bruset i de erhållna intensitetsmätningarna appliceras en Gaussisk oskärpa med en standardavvikelse på 1 pixel på bilderna (figur 3B,C).
  1. Använd analysprogramvarans funktionalitet för att bearbeta hjälpbilddata från bildsekvenser.
    1. Extrahera ytterligare bilder inspelade för att underlätta segmentering (se steg 2.2.1, märkt med s i excitationssekvensen (se Kompletterande information, avsnitt 1.2, steg 3).
    2. Bestäm givar- och acceptor-excitationsljusprofiler över synfältet från bilder som spelats in på ett tätt märkt prov (se steg 3.2).
      Pixel-för-pixel-medelvärdet beräknas från bilderna för att beräkna ljusprofilerna. Kamerans baslinje subtraheras. Bilderna är suddiga med hjälp av ett Gaussiskt filter för att minska effekterna på grund av provföroreningar. Slutligen divideras de resulterande bilderna pixelvis med sitt maximala värde för att få profilp(x,y) mappningskoordinaterna till intervallet [0,1].

7. Visualisering av FRET-banor (valfritt)

  1. Använd inspektörsapplikationen för att visa enmolekylsspår i rådata och motsvarande fluorescensintensiteter och uppenbara FRET-effektivitets- och stoichiometrier.
    OBS: Detta är ett värdefullt verktyg för att bedöma giltigheten av valda parametrar och manuellt acceptera eller avvisa enskilda tidsspårningar. Se Kompletterande information för en skärmdump och detaljerad användningsinformation.

8. Analys och filtrering av enmolekylsdata (02. Analys.ipynb)

  1. Använd 02. Analys.ipynb Jupyter bärbar dator för analys och filtrering av enmolekylsdata som erhållits via 01. Tracking.ipynb anteckningsbok. Se stegen nedan för en typisk analyspipeline.
    OBS: Olika vetenskapliga frågor och experimentella mönster kan kräva justeringar av inställningarna. Användningen av Jupyter-anteckningsböcker möjliggör enkel anpassning genom att utelämna, omorganisera och ändra analyssteg. För skärmbilder av varje analyssteg och beskrivning av parametrar för funktionsanrop, se Kompletterande information.
    1. Utför de första filtreringsstegen.
      1. Kassera signaler med överlappande punktspridningsfunktioner eftersom det är svårt att bestämma deras fluorescensintensiteter på ett tillförlitligt sätt.
      2. Vid inhomogen belysning, acceptera endast signaler som finns i väl upplysta områden inom synfältet för att säkerställa ett bra signal-till-brus-förhållande.
      3. Om du studerar intramolekylär FRET, begränsa analysen till de banor som finns från början av bildsekvensen för att säkerställa att alla blekningssteg registreras och kan utvärderas korrekt senare under den stegvisa fotoblekningsanalysen.
        OBS: Vid experiment med intermolekylära FRET-sonder, där donator- och acceptorfluoforer inte ingår i ett förformat komplex, kanske det inte är möjligt att begränsa analysen till initialt närvarande banor.
    2. Utför flatfieldkorrigering, som använder excitationsljuskällan profiler som erhålls i steg 6.1.7.2 för att vända de positionsberoende fluorescensintensitetsvariationerna som orsakas av inhomogen belysning.
      OBS: Fluorescensintensiteten I(x,y) hos en sond i positionen (x,y) korrigeras via Equation 8 ; se figur 1C,D.
    3. Beräkna den skenbara FRET-effektiviteten Eapp (dvs. den del av energin som överförs från donatorfluoforen till acceptorfluoforen) och den uppenbara stoichiometrisapp (dvs. antalet donatorfluoroforer dividerat med det totala antalet fluoroforer inom en diffraktionsbegränsad plats).
      OBS: Genom att plotta E vs. S för varje datapunkt är det möjligt att skilja förändringar i de uppmätta FRET-effektivitetsvinsterna på grund av förändring i givar-acceptoravstånd från förändringar på grund av förändringar i stökiometri18. Detta möjliggör differentiering mellan E = 0 på grund av färgseparation från E = 0 på grund av frånvaron av en aktiv acceptor. E-S-tomter används genom hela analysen som ett verktyg för kvalitetsbedömning. se figur 4 som ett exempel.
    4. Utför stegvis analys av fotobleaching för diskriminering mellan enmolekylära sonder och aggregat. Välj att acceptera något av följande alternativ.
      OBS: För detta ändamål tillämpar analysprogramvaran en anpassad implementering32 av changepointdetekteringsalgoritmen PELT37 separat på fluorescensintensiteten vid donatorexcitation (IDD + IDA) och acceptor excitation (IAA).
      1. Välj alternativ 1, där acceptor fluorofor bleker i ett enda steg medan givaren inte visar någon partiell blekning (dvs. det finns inget blekningssteg till icke-nollintensitet).
        OBS: Detta alternativ avvisar ytterligare banor där donatorn bleker före acceptorn i ett enda steg. Alternativ 1 är det föredragna valet vid höga acceptansfotobleaching priser.
      2. Välj alternativ 2, där donatorn bleker i ett enda steg medan det inte finns någon partiell acceptor blekning.
        OBS: Detta alternativ avvisar ytterligare banor där donatorn bleker efter acceptorn i ett enda steg. Alternativ 2 är det föredragna valet vid höga fotobleaching-priser för donatorer.
      3. Välj alternativ 3, där antingen fluorofre bleker i ett enda steg medan det andra inte delvis bleker.
        Alternativ 3 ger högre flexibilitet än alternativ 1 och 2 och skulle vara den föreslagna preferensen för dataanalys.
      4. Välj alternativ 4, där donator- och acceptorfluoforer visar enstegsfotobleaching eller ingen fotobleaching alls.
        OBS: Alternativ 4 är att föredra vid låga fotobleaching priser.
    5. Beräkna korrigeringsfaktorerna för givarutsläppsläckage i acceptorkanalen α, direkt acceptor excitation δ, detektionseffektivitet γ och excitationseffektivitet β 17.
    6. Använd korrigeringsfaktorerna för att beräkna FRET-effektiviteten E från den skenbara effektiviteten Eapp och stökiometriN S från den uppenbara stökiometrin Sapp.
    7. Utför ytterligare filtreringssteg. Välj endast datapunkter från före den första blekningshändelsen i varje bana. Acceptera dessutom endast banor med minst 75% av datapunkterna som uppfyller 0,35 < S < 0,6 för att begränsa analysen till enmolekylsonder (siffrorna är justerbara).
      OBS: De övre och nedre gränserna för bör väljas i enlighet med spridningen av intressepopulationen jämfört med de populationer som ska uteslutas från analysen (t.ex. populationer endast för givare och godtagbara). Baserat på erfarenhet visade sig 0,35 < S < 0,6 vara ett bra val för många experimentella situationer.
    8. Utför bildsegmentering via globala eller anpassningsbara tröskelvärden35 på lämpliga hjälpbilder (se steg 2.2.1 och 6.1.7) för att begränsa analysen till distinkta regioner inom synfältet.
      OBS: Detta möjliggör till exempel exklusiv utvärdering av sonder som finns i ett cell-SLB-gränssnitt eller på en mönstrad struktur.

9. Intrigering av resultat och ytterligare analys (03. Plot.ipynb)

Obs: Se Kompletterande information för skärmdumpar av Jupyter-anteckningsboken och beskrivning av parametrar för funktionssamtal.

  1. Skapa E-S-tomter för att verifiera att signaler om felaktig stökiometri har identifierats och tagits bort korrekt.
  2. Plot histogram av FRET effektivitet för att ge en väletablerad översikt över FRET effektivitet distributioner. Gruppera histogrammen för bekväm jämförelse av resultat från olika experiment.
  3. Utvärdera data ytterligare (t.ex. diffusionsanalys, omvandling av FRET-effektivitet till krafter i experiment med molekylära kraftsensorer eller övergångsanalys) i den bärbara datorn som drar nytta av vetenskapliga Python-bibliotek.
    OBS: Data kan också exporteras i många filformat som indata till annan analysprogramvara.

Representative Results

En mängd olika låg- och högnivåinformation kan extraheras från smFRET-spår beroende på den vetenskapliga frågan om experimentet. Här presenteras exempel på analyspipelines med analoga och digitala sonder: en peptidbaserad molekylär kraftsensor16 och en DNA-sond med stokastisk växling av dess konformation38. Se figur 5 för dessa sonders konstruktions- och arbetsprincip.

När lokaliserings- och spårningsalgoritmerna har utförts enligt beskrivningen i protokollet erbjuder paketet flera datavisualiseringsverktyg för att optimera de första parametrarna och efterföljande filtersteg: (i) visualisering av enskilda smFRET-händelser, (ii) valfri bildsegmentering för att analysera data i vissa intresseområden, (iii) övervakning av filtersteg via FRET-effektivitet kontra stökiometridiagram (E-S). Visualiseringen av enmolekylsdata presenteras i figur 6.

Slutligen representeras de filtrerade FRET-händelserna av en E-S-plot och ett FRET-effektivitets histogram (figur 4). E-S-tomten är ett användbart verktyg för att optimera de ovan nämnda filtreringsstegen och undersöka slutresultatet. Delvis blekta eller ofullständigt märkta FRET-sensorer kan uteslutas av deras stökiometrivärde. Mobilitetsparametrar kan undersökas genom att rita upp en enskild bana i ett x-y-område (figur 6) eller ett genomsnittligt kvadratiskt förskjutningsdiagram (figur 4). Den första metoden är särskilt användbar för att diskriminera mobil från immobiliserade händelser, medan den senare används för att beräkna diffusionskoefficienten.

Figure 4
Figur 4: Föredömlig produktion. (A) FRET-effektiviteten plottas kontra stökometri (E-S-plot) för en population av den molekylära kraftsensorn (vänster panel) som dekorerar en glasstödd lipidbilayer och spänns av en T-cell. Endast ett befolkningsmoln är synligt. Respektive histogram av FRET-effektivitet exemplifierar skillnaden mellan en kraftsensorpopulation i närvaro och frånvaro av celler (mittpanel). Ingen övergång till lägre FRET-effektivitet hos sensorpopulationen i närvaro av T-celler kan observeras, vilket indikerar liten eller ingen kraftberoende sträckning av sensormodulen. MSD-området för dessa experimentella tillstånd bekräftar att kraftsensorpopulationen under en T-cell rör sig betydligt långsammare än deras obundna motsvarigheter (höger panel). (B) Samma analys utfördes med Holliday junction DNA-sensor som dekorerar en glasstödd flytande lipidbilayer. E-S-tomten visar tydligt två populationer, vilket också framgår av FRET-effektivitets histogrammet. MSD-området indikerar närvaron av en snabbrörlig sensorpopulation. Förkortningar: FRET = Förster resonans energiöverföring; MSD = genomsnittlig kvadratförskjutning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Konstruktion och arbetsprincip för intramolekylära FRET-sonder. (A) Analog peptidsensor för kvantifiering av mekaniska molekylära krafter. Donatorn och acceptor fluoroforer är kovalent fästa på vardera änden av peptid ryggraden. Sensormodulen är platsspecifikt fäst vid en specifik ligand, som i sin tur binder en cell-resident ytreceptor av intresse (här, ett antikroppsfragment som specifikt känner igen betakedjan för T-cellsreceptorn). Vid receptor-ligandbindning utövas kraft, och sensormodulen sträcker sig och rekylerar så småningom efter bindningsklyvning. Denna panel är modifierad från 16. (B) Digital DNA-sensor för kvantifiering av FRET-övergångar. FRET-sensorn består av fyra DNA-strängar som bildar en Holliday-korsning. Donatorn och acceptor fluorophore är kovalent fäst vid två strängar. Holliday-korsningar växlar ofta sin konformation beroende på de omgivande buffertförhållandena. Den stokastiska växlingen av dessa konformationer kan övervakas genom att kvantifiera FRET-effektiviteten hos enskilda sonder. Förkortningar: TCR = T-cellsreceptor; FRET = Förster resonans energiöverföring. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Bild 6: Exempel på lokalisering och spårning av FRET-sonder. A) DE enskilda händelsernas fret-effektivitet och stokiiometri beräknas genom att givaren fluoroforens intensitet vid donatorexcitation (D → D), acceptorfluoforen vid donatorexcitation (D → A) och acceptorfluorfluoren vid acceptor excitation (A → A). Närmaste grannfiltrering förhindrar partiskhet genom överlappande punktspridningsfunktioner för nära emittrar. Bildsegmentering gör det möjligt för användaren att välja vissa smFRET-händelser lokaliserade inom ett intresseområde (t.ex. en cell eller en mikromönster). Som ett exempel på bildsegmentering färgades T-celler med Fura-2 (visas till vänster) och utsattes för adaptiv tröskel för att identifiera cellkanterna (orange prickad linje). Skalstänger = 5 μm. (B) smFRET-banor med hjälp av molekylkraftsensorn. Enskilda banor kan ritas i x-y-planet , vilket visualiserar deras diffusionsbeteende och lokalisering (vänster panel). Dessutom kan varje banas intensitet ritas över tid för att identifiera FRET-övergångar eller blekningssteg (mittpanelen visar den röda banan från den vänstra panelen). Den resulterande FRET-effektiviteten och stökiometrin kan visualiseras på samma sätt (höger panel). C) SMFRET-banor med hjälp av Holliday junction DNA-sensorn. HBSS + 12 mM MgCl2 användes som buffert under mätningarna. Bortsett från det uppenbara acceptor blekningssteget nära sekvensänden av dessa exempel kan frekvensen av FRET-övergångar för varje sensor bestämmas. Holliday-korsningarna växlar sin konformation med hög frekvens, medan den molekylära kraftsensorn inte uppvisar FRET-övergångar. Denna information gör det möjligt att justera de experimentella förhållandena, såsom fördröjningen mellan ramarna, för att öka eller minska antalet observerade övergångar. Förkortningar: FRET = Förster resonans energiöverföring; smFRET = enmolekylig FRET; HBSS = Hanks balanserade saltlösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande information: Lokalisering och spårning av enstaka molekyler (01. Tracking.ipynb). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Den här artikeln beskriver en pipeline för automatiserade inspelningar och kvantitativ analys av smFRET-data som härrör från mobila men ändå ytbundna sondmolekyler. Det kompletterar de två dominerande metoderna för smFRET-experiment, som involverar antingen yto immobiliserade sonder eller sonder som sprider sig i lösning till och från en konfokal excitationsvolym17. Det ger rätt FRET-effektivitet och de molekylära positionerna som en funktion av tiden. Det kan därför användas som indata för specialiserade analysprogram, t.ex. för att kvantifiera övergångskinetik1, FRET histogram39 eller tvådimensionell diffusion22.

Programvaran släpps under en gratis licens med öppen källkod som godkänts av Open Source Initiative som ger användaren evig rätt till gratis användning, modifiering och omfördelning. Github valdes som en utvecklings- och distributionsplattform för att göra det så enkelt som möjligt att få programvaran och delta i utvecklingsprocessen genom att rapportera buggar eller bidra med code40. Skriven i Python är programvaran inte beroende av proprietära komponenter. Valet av Jupyter-bärbara datorer som användargränssnitt underlättar inspektionen av data vid varje analyssteg och gör det möjligt att skräddarsy och utöka rörledningen specifikt för det experimentella systemet. Sdt-python-biblioteket32 fungerar som grund och implementerar funktionalitet för att utvärdera fluorescensmikroskopidata, såsom enmolekylslokalisering, diffusionsanalys, fluorescensintensitetsanalys, färgkanalregistrering, colocalization-analys och ROI-hantering.

I princip kan enpartikelspårning utföras i ett-, två- eller tredimensionella system. Här var enmolekylanalyspipelinen skräddarsydd för studien av 2D-mobila system. Detta val speglar tillgängligheten av enkla system, till exempel planastödda lipidbilayers (SLB), för att presentera mobila fluorescerande sonder. Sådana lipidbilayersystem består vanligtvis av två eller flera fosfolipider, där bulkfraktionen bestämmer de viktigaste fysikalisk-kemiska parametrarna för SLB (såsom fas och viskositet), och den mindre fraktionen tillhandahåller fästpunkter för biomolekyler. Dessa fästplatser kan vara biotinylerade fosfolipider för avidin- eller streptavidinbaserade proteinplattformar eller nickel-NTA konjugerade fosfolipider för proteinplattformar med histidintaggar41. Valet av lämplig plattform för att koppla proteiner till SLB beror på den vetenskapliga frågan. Läsare kan hänvisa till litteraturen16,38,42 för exempel på framgångsrikt använda strategier. Tätheten av sonder i provet bör vara tillräckligt låg för att undvika överlappande punktspridningsfunktioner. vanligtvis rekommenderas mindre än 0,1 molekyler per μm2. Se avsnittet representativa resultat (särskilt figur 6) för ett exempel som visar en lämplig sondtäthet. Analysmetoden är också tillämplig på enstaka fluorescerande märkta proteinmolekyler som sprids i plasmamembranet i levande celler.

En kritisk aspekt av smFRET-experiment är produktionen och karakteriseringen av FRET-sonderna själva. När du väljer fluoroforer för ett FRET-par bör deras Förster-radie matcha de förväntade interfärgavstånden43. Färgämnen som är resistenta mot fotobleaching föredras eftersom de ger långa tidsspår. För förhöjda blekningshastigheter kan dock en fluoroforart användas för att känna igen multiemitterhändelser som härrör från colocalized molekyler via stegvis fotobleaching analys; se steg 8.1.4 i protokollavsnittet. Fluoroforpar bör vara plats-specifikt och kovalent fästas på molekyler av intresse, bilda intra- eller intermolekylära FRET-par.

Att kombinera smFRET med andra lättillgängliga tekniker kan öka dess rumsliga upplösning utöver diffraktionsgränsen (via STED44). SmFRET-spårningsalgoritmen som presenteras här breddar metodens tillämplighet på nya experimentella inställningar och modellsystem. Detta inbegriper studier av i) kinetiska förändringar i stökiometrin hos mobila biomolekyler, ii) dynamisk associering av mobila biomolekyler, iii) frekvensen av enzymatiska reaktioner hos fritt diffusa reaktanter och iv) kinetiken för konformationella förändringar av mobila biomolekyler. De två första exemplen kräver modellsystem som visar intermolecular FRET, dvs. givare och acceptor konjugeras till separata biomolekylära enheter av intresse. De senare exemplen kan använda biosensorer som bär givare och acceptor inom samma molekylära enhet (intramolekylär FRET).

Intramolekylära FRET-baserade sensorer kan ge insikt i inneboende konformationella förändringar av biomolekyler1,2,3,4, konformationella förändringar orsakade av endogen eller extern kraftbelastning (molekylär kraftsensorer16) eller jonkoncentrationer i nanomiljön som kalcium45 och pH46 . Beroende på modellsystemet och den föredragna förankringsplattformen kan sådana smFRET-händelser antingen spåras i 2D eller 3D: (i) plana spårning av smFRET-händelser kan användas för kvantifiering av receptor-ligand interaktionstider inom ett plasmamembran, associering av membranförankrade signalförstärkningskaskader och stoichiometriförändringar av ytreceptorer; ii) Volymspårning av smFRET-händelser kan användas för alla intra- eller intermolekylära FRET-sonder i levande celler eller in vitro-rekonstituerade system.

SmFRET spårningsmetoden utvecklades främst med intramolekylära FRET-sonder i åtanke. Dessa sonder har ett fast och välkänt antal fluorescerande etiketter, ett faktum som utnyttjades för att avvisa data från agglomererade och felaktigt syntetiserade (t.ex. ofullständigt märkta) molekyler, liksom från sonder där en av fluoroforerna har fotobleachats. Men genom att justera filtreringsstegen kan metoden också tillämpas på intermolekylära FRET-sonder. Till exempel, i stället för att bara acceptera molekyler med en enda donator och en enda acceptor fluorofor, skulle man kunna undersöka de rumsliga banorna för donator- och acceptorfärgämnen och välja till exempel för samspridande donator-acceptorbanor.

Eftersom 3D-DAOSTORM-algoritmen har stöd för att bestämma en signals position längs den optiska axeln via astigmatismen på grund av en cylindrisk lins i emissionsstrålebanan, kan 3D-experiment enkelt integreras i analyspipelinen. I detta fall skulle acceptorsignalen vid acceptor excitation tjäna till att bestämma stökiometrin och axiell position. Analysprogramvaran kan också användas för att utvärdera data från experiment med immobiliserade sonder genom att använda sin stora grad av automatiserings- och filtreringsscheman. Faktum är att smFRET effektivitets datamängder från Holliday korsningar immobiliserade på gel-fas bilayers38 analyserades med hjälp av en tidig version av programvaran.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av den österrikiska vetenskapsfondens (FWF) projekt P30214-N36, P32307-B och av Wiens vetenskaps- och teknikfond (WWTF) LS13-030.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS) Avanti Polar Lipids 790404P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids 850457P
α Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective Zeiss 000000-1084-514
Axio Observer microscope body Zeiss
Bandpass filter Chroma Technology Corp ET570/60m donor emission filter
Bandpass filter Chroma Technology Corp ET675/50m acceptor emission filter
conda-forge conda-forge community community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda
Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5 MENZEL
Dichroic mirror Semrock Inc FF640-FDi01-25×36 separation of donor and acceptor emission
Dichroic mirror (quad band) Semrock Inc Di01-R405/488/532/635-25×36 separation of excitation and emission light
DPBS Sigma-Aldrich D8537
FCS Sigma-Aldrich F7524 for imaging buffer
fret-analysis Schütz group at TU Wien Python package for smFRET data analysis; version 3
Fura-2 AM Thermo Fisher Scientific 11524766
HBSS Sigma-Aldrich H8264 for imaging buffer
iBeam Smart 405-S 405 nm laser Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 EMCCD camera Andor Technology Ltd
Lab-Tek chambers (8 wells) Thermo Fisher Scientific 177402PK for sample preparation and imaging
Millenia Prime 532 nm laser Spectra Physics
miniconda Anaconda Inc. Python 3 distribution. Min. version: 3.7
Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression) Addgene 20860 & 20859
OBIS 640 nm laser Coherent Inc 1185055
Optosplit II Cairn Research
Ovalbumin Sigma-Aldrich A5253 for imaging buffer
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-002
sdt-python Schütz group at TU Wien Python library for data analysis; version 17
TetraSpek bead size kit Thermo Fisher Scientific T14792 Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration
USC500TH Ultrasound bath VWR for SUV formation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKinney, S. A., Déclais, A. -C., Lilley, D. M. J., Ha, T. Structural dynamics of individual holliday junctions. Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).
  2. Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).
  3. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).
  4. Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), 235 (2018).
  5. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).
  6. Wu, P. G., Brand, L. Resonance energy transfer: Methods and applications. Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).
  7. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-molecular förster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  8. Malkusch, N., Dörfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex. Methods. 120, 115-124 (2017).
  9. Lee, J. -B., et al. Single-molecule views of MutS on mismatched DNA. DNA repair. 20, 82-93 (2014).
  10. Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).
  11. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  12. Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).
  13. Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
  14. Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. How kinesin waits between steps. Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).
  15. Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).
  16. Göhring, J., et al. Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements. Nature Communications. 12 (1), 2502 (2021).
  17. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669 (2018).
  18. Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  19. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  20. McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).
  21. Lee, N. K., et al. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).
  22. Asher, W. B., et al. Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells. Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).
  23. Joo, C., Ha, T. Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), Cold Spring Harbor. 1223-1237 (2012).
  24. Joo, C., Ha, T. Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET. Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).
  25. Joo, C., Ha, T. Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET. Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).
  26. Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , https://github.com/soft-matter/pims (2020).
  27. Anaconda Inc. Miniconda. , https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html (2021).
  28. conda-forge community. The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).
  29. JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , https://jupyterlab.readthedocs.io/en/stable/user/notebook.html (2021).
  30. Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy. Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).
  31. Gao, Y., Kilfoil, M. L. Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions. Optics Express. 17 (6), 4685 (2009).
  32. Schrangl, L. sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , Zenodo. (2021).
  33. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  34. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).
  35. Bradski, G. The OpenCV library. Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).
  36. Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0. Zenodo. , 4682814 (2021).
  37. Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. Optimal detection of changepoints with a linear computational cost. Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).
  38. Schrangl, L., Göhring, J., Schütz, G. J. Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories. The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328 (2018).
  39. Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis. ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).
  40. Schrangl, L. Single-molecule FRET analysis software (3.0). Zenodo. , (2021).
  41. Nye, J. A., Groves, J. T. Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers. Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).
  42. Platzer, R., et al. Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy. Nature Communications. 11 (1), 4993 (2020).
  43. Johnson, I., Spence, M. The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , Life Technologies Corporation. (2010).
  44. Szalai, A. M., et al. Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET. Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).
  45. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  46. Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process. New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).

Tags

Bioengineering nummer 177
Automatiserad tvådimensionell Spatiotemporal analys av mobila enmolekyliga FRET-sonder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schrangl, L., Göhring, J.,… More

Schrangl, L., Göhring, J., Kellner, F., Huppa, J. B., Schütz, G. J. Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes. J. Vis. Exp. (177), e63124, doi:10.3791/63124 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter