Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות בקנה מידה קטן הניתנות לשחזור, על-ידי אכלוס מחדש של פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה מדויקת עם תאי אפיתל מסוג 2, פיברובלסטים ותאי אנדותל.
Abstract
יש צורך במודלים משופרים של ריאה תלת-ממדית (תלת-ממדית) שמשחזרים את המורכבות האדריכלית והתאית של ה-alveolus ex vivo המקורי של הריאה. מודלים אורגנואידיים שפותחו לאחרונה אפשרו את ההרחבה והמחקר של אבות אפיתל הריאה במבחנה, אך פלטפורמות אלה מסתמכות בדרך כלל על מטריצה ו/או סרום שמקורם בגידולי עכברים, ומשלבות שושלות תאיות אחת או שתיים בלבד. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת רקמות ריאה מהונדסות (ELTs) המבוסס על רסלאריזציה מרובת שושלת של פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) שעברו דה-תאיזציה. ELTs מכילים מבנים דמויי נאדיות הכוללים אפיתל נאדי, מזנכים ואנדותל, בתוך מצע מטריצה חוץ-תאית (ECM) הדומה מאוד לזה של הריאה המקומית. כדי ליצור את הרקמות, ריאות החולדה מנופחות באגרוז, נחתכות לפרוסות בעובי 450 מיקרומטר, נחתכות לרצועות ועוברות דה-תאיזציה. פיגומי ה-ECM התאיים שנוצרים כתוצאה מכך נזרעים מחדש עם תאי אנדותל ראשוניים, פיברובלסטים ותאי אפיתל מסוג 2 (AEC2s). AEC2s יכולים להישמר בתרבית ELT למשך 7 ימים לפחות עם מדיום גדילה ללא סרום ומוגדר כימית. לאורך כל תהליך הכנת הרקמות והתרבית, הפרוסות נחתכות למערכת קלטות המאפשרת טיפול וזריעת תאים מתוקננת של מספר ELTs במקביל. ELTs אלה מייצגים פלטפורמת תרבית אורגנוטיפית שאמורה להקל על חקירות של אינטראקציות בין תאים לתאים ולמטריצות תאים בתוך הנאדיות, כמו גם אותות ביוכימיים המווסתים את AEC2s ואת הנישה שלהם.
Introduction
נאדיות הן היחידות התפקודיות של הריאה הדיסטלית, המורכבות מעבודת רשת של מרחבי אוויר מחליפי גזים המרופדים בתאי אפיתל מסוג 1 (AEC1s) ותאים מסוג 2 (AEC2s). בבסיס האפיתל עומדת רשת צפופה של נימים, כמו גם מזנכים תומכים, כולם מחוזקים על ידי פיגום מטריצה חוץ-תאית (ECM) המספק הן חוזק והן גמישות לשקי האוויר העדינים האלה1. הנאדיות הן גם אתר הפגיעה בפתולוגיות ריאה רבות, כולל פיברוזיס ריאתי אידיופטי2, תסמונת מצוקה נשימתית חריפה3 ומחלת קורונה קשה -19 (COVID-19)4. למרות שהעבודה בעשור האחרון חשפה פלסטיות יוצאת דופן באפיתל הריאה, המנגנונים המאפשרים תיקון ריאה דיסטלי במסגרות מסוימות - ומונעים תיקון באחרות - נותרו תחום של חקירה אינטנסיבית5. פיתוח פלטפורמות משופרות במבחנה כדי לדגום את הנאדיות יקל על מחקרים על ביולוגיה של נאדיות, התחדשות וטיפולים.
AEC2s מחדשים את עצמם ומבדילים אותם ל-AEC1s, ולכן נחשבים לתאי הגזע העיקריים של הריאה הדיסטלית 6,7,8. עם זאת, תאים אלה מהווים אתגר מיוחד למחקר במבחנה בהתחשב בקשיים הקשורים לגידול AEC2 ראשוניים ללא אובדן של פנוטיפ9. בתרבית דו-ממדית (2D) קונבנציונלית, AEC2s משטחים ומאמצים תכונות מסוימות של תאים דמויי AEC110. לעומת זאת, אסטרטגיות תרביות תלת-ממדיות, לרוב אורגנואידים, תומכות בשמירה על תכונות מובחנות ב-AEC2sראשוניים 6,11,12 ומאפשרות תרבית ארוכת טווח של תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) שמקורם ב-AEC2s13,14. אורגנואידים שימשו למדל התפתחות ריאות דיסטלית15, זיהום ויראלי11,15, ומחלות גנטיות הקשורות ל-AEC2 13,16,17, מה שמאפשר תובנות חשובות על ביולוגיה והתחדשות של AEC2. עם זאת, מודלים אלה של תרביות כוללים בדרך כלל שושלות תאיות אחת או שתיים בלבד, ומטביעים את התאים במטריצות מסוג ג'ל שאינן מצליחות לשחזר את הארכיטקטורה או את מצע ה-ECM של נאדיות הריאה הטבעית.
ה-ECM הוא מווסת קריטי של פנוטיפ והתנהגות התא באמצעות רמזים מולקולריים, טופולוגיים ומכניים; מהווה מרכיב מרכזי בגומחות ספציפיות לרקמות המווסתות את גורל תאי הגזע; ומשמש כמאגר המווסת את הזמינות של גורמי גדילה המופרשים באופן מקומי 18,19,20,21. לפיכך, גידול תאים ב-ECM מקומי עשוי להגביר את יכולת הניבוי של מערכות in vitro כדי למדל את הביולוגיה של רקמות in vivo. דה-תאיזציה, תהליך המסיר חומר תאי מרקמות באמצעות דטרגנטים, אנזימים או שיטות פיזיות או אחרות, יכול לשמר במידה רבה את פיגומי ה-ECM של איבר מקומי, כאשר הם מבוצעים בקפידה22,23. ניתן לאכלס מחדש פיגומים כאלה בתאים לתרבית ביומימטית תלת-ממדית. עם זאת, בעוד שפיגומים שעברו דה-תאיזציה נמצאים בשימוש נרחב ליישומים של הנדסת רקמות, השימוש בהם לתרבית תאים שגרתית היה מוגבל. מספר מחקרים קודמים דיווחו על דה-תאיזציה ורה-סלולריזציה של פרוסות ריאה או מקטעי רקמת ריאה קטנים. בנוסף למחקרי הוכחת היתכנות 24,25,26, נעשה שימוש בפרוסות ריאה מאוכלסות מחדש כדי לחקור הידבקות של מטריצת פיברובלסט27,28 ולחקור את ההשפעה של מטריצות ריאה חולות על פנוטיפ פיברובלסט27,29. עם טכנולוגיות משופרות הזמינות ליצירת פרוסות רקמות חתוכות באופן מדויק, פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה יכולות להציע פלטפורמה נוחה וקטנה שבאמצעותה ניתן לתרבת תאים, תוך שמירה על תת-מבנים של נאדיות, דרכי הנשימה וכלי הדם. שילוב של סוגי תאים מרובים יאפשר לחקור אינטראקציות בין תאים לתאים בתוך סביבה תלת-ממדית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. עם זאת, יש צורך באסטרטגיות משופרות כדי להקל על הטיפול ברקמות לאורך כל תהליך התרבית, ולהבטיח זריעה מבוקרת וניתנת לשחזור של רקמות עם מספר ידוע של תאים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת רקמות ריאה מהונדסות (ELTs) על ידי ריפוד מחדש של פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) עם תאי אנדותל ראשוניים, AEC2s ופיברובלסטים. בהסתגלות של מערכת רקמת הלב המהונדסת שלנושתוארה בעבר 30 ואסטרטגיות רה-תאיזציה של ריאות שלמות22,31, אנו מתארים פרוצדורות לחיתוך PCLS מריאות חולדות ולקיצוץ הפרוסות לקלטות תרביות רקמה רב-פעמיות המפשטות ומתוקנות מניפולציות במורד הזרם. פרוסות חתוכות עוברות דה-תאיזציה ליצירת פיגומי ECM תאיים, המאוכלסים מחדש באמבטיות זריעה מותאמות אישית. פיגומי פרוסות ריאה משמרים רכיבים וארכיטקטורה קריטיים של ECM, ותומכים בצמיחה של AEC2s בתוך מבנים דמויי נאדיות מרובי שושלת למשך 7 ימים לפחות. ELTs מייצגים מערכת חדשה של תרבית משותפת אלוואולרית בתוך מטריצה תלת-ממדית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית, שאמורה לתמוך בפיתוח אסטרטגיות של הנדסת רקמות ריאה, תוך הקלה על מחקרים ביולוגיים בסיסיים של AEC2s וה-alveolus.
Protocol
כל הליכי הניסוי בבעלי חיים המתוארים במאמר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ייל.
1. יצירת קלטות תרבית רקמה ואמבטיות זריעה
הערה: לאחר יצירתם, קלטות תרבית רקמה ואמבטיות זריעה עשויות לעבור אוטוקלאבים ולעשות בהן שימוש חוזר עבור סבבים חוזרים ונשנים של תרבית ELT.
-
קלטות תרבית רקמה
- השתמש בחותך לייזר כדי לחתוך מסגרות קלטות ותפסים של תרביות רקמה מתוך פוליטטטרפלואורואתילן בעובי 3/32 אינץ ' (PTFE) על פי העיצובים המופיעים בקובץ משלים 1 ובקובץ משלים 2, בהתאמה. השתמש בחותך לייזר כדי לחתוך כרטיסיות קלטות תרבית רקמה מתוך PTFE בעובי 1/16 אינץ 'על פי קובץ משלים 3. חתך מתארים פי 3 באמצעות 80% הספק ומהירות של 15% (עבור חותך לייזר של 30 ואט).
-
אמבטיות זריעה
- השתמש בקבצי CAD של אמבט הזריעה (קובץ משלים 4 וקובץ משלים 5) כדי להדפיס בתלת-ממד את הבסיס והטבעת של תבנית אמבט הזריעה, בהתאמה, באמצעות שרף שקוף.
- השרו את התבניות בתמיסה של 10% פולוקסאמר 407 במים מזוקקים למשך הלילה לפני השימוש כדי לסייע בשחרור PDMS. תנו לאוויר להתייבש, ואז התאימו את הטבעת מעל בסיס התבנית ועטפו בסרט פלסטיק גמיש כדי למנוע דליפה.
- יש להכין לפחות 60 גרם לכל תבנית של פולידימתילסילוקסן (PDMS) על ידי ערבוב אלסטומר PDMS ביחס של 10:1 עם חומר ריפוי, ולשפוך לתבנית המודפסת בתלת-ממד. דגה את ה- PDMS במייבש ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר את בועות האוויר.
- לאפות אמבטיות זריעה ב 60 °C (60 °F) במשך 8 שעות.
2. הכנת פרוסות ריאה חתוכות במדויק מריאות עכברושים
- קציר איברים
- הכינו מערכת זלוף מפוצלת הכוללת גפיים מונעות כבידה ומשאבה, כפי שמתואר באיור 1. חברו צינורית עורק ריאתי (PA) לקצה הצינורית, הכוללת מחבר Y תוחם בגודל 1/16 אינץ' המחובר לצינורית סיליקון LS 14 באורך 1/2 אינץ' ומחבר נעילת נקבה בגודל 3/32 אינץ' (ראו איור 1). אין לחבר שסתום בדיקה לצינורית בשלב זה.
- הקדים את הקווים עם PBS המכילים 100 U/mL הפרין ו-0.01 מ"ג/מ"ל נתרן ניטרופרוסייד (SNP) למניעת קרישה והתרחבות כלי דם, בהתאמה. הגדר מראש את משאבת הזלוף ל- 30 מ"ל לדקה.
הערה: הוסף SNP טרי לתמיסת הפרין ושמור על הגנה מפני אור. - מינון של חולדה מסוג Sprague-Dawley עם זריקה תוך-צפקית (IP) של 400 U/kg הפרין למניעת קרישה, ולאחר מכן הזרקת IP של 400 U/kg הפרין למניעת קרישה, ולאחר מכן הזרקת IP של קטמין (75 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5 מ"ג/ק"ג) להרדמה. אשרו מישור כירורגי של הרדמה באמצעות חוסר תגובה לגירוי רעיל (צביטה בבוהן).
- לקצץ את החזה והבטן של הפרווה באמצעות קוצץ שיער. לאחר מכן יש לרסס עם 70% אתנול ולנגב 3x עם 10% פובידון-יוד.
- תפסו את העור מתחת לגובה הסרעפת עם מלקחיים של שן חולדה. לאחר מכן בצע חתך רוחבי של 1/2 אינץ 'בעור עם מספריים מחודדים עדינים. תפסו את החיתולית הבטנית החשופה עם המלקחיים, בצעו חתך רוחבי של 1/2 אינץ' בחיתולית, ואז הרחיבו את החתך דרך העור והפאשיה לרוחב הבטן העליונה.
- השתמש בקצה המספריים העדינים כדי לבצע חתך קטן (לא יותר מ 1/8 אינץ ') במרכז הסרעפת הקדמית, מה שגורם לריאות לסגת בבית החזה. להאריך את החתך בסרעפת על פני כל רוחב החזה.
- בצע שני חתכים אנכיים דרך מלוא גובה הצלעות לכיוון הצוואר, תוך זהירות שלא לפגוע בריאות. מרחיבים את החתך דרך הצלעות השמאליות כדי לחתוך דרך עצם הבריח ולאורך צד הצוואר עד לגובה הגרון, וחושפים את קנה הנשימה.
- נתחו את קנה הנשימה ללא רקמת החיבור שמסביב ומהוושט. בצע חתך רוחבי על פני החצי הקדמי של קנה הנשימה בין שתי טבעות סחוס, קרוב לגרון. משחילים תפר פוליפרופילן 4-0 מאחורי קנה הנשימה, מתחת לגובה החתך, וקושרים באופן רופף את המחצית הראשונה של קשר המנתח בשני פיתולים.
- הניחו צינורית המורכבת ממקשר Y עם תיל Y בגודל 1/16 אינץ' המחובר לשסתום בדיקה חד-כיווני וצינורית סיליקון LS 14 באורך 1/2 אינץ' עם מחבר נעילת נקבה בגודל 3/32 אינץ' (ראו איור 1) לקנה הנשימה על ידי החדרת איבר אחד של מחבר ה-Y לתוך חתך קנה הנשימה לכיוון הריאות.
- מקם את לולאת התפר הקשורה מראש סביב קנה הנשימה בגובה הצינורית המוחדרת והידק סביב מחבר ה- Y שהוכנס כדי לאבטח את הצינורית במקומה. הוסיפו שתי זריקות חד-פעמיות של התפר כדי להשלים את הקשר.
- מלאו מזרק 10 מ"ל באוויר והתחברו למנעול הלוהט של צינורית קנה הנשימה.
- מהדקים את הווריד הנבוב התחתון קרוב לדיאפרגמה באמצעות המוסטאט מעוקל, ואז מזריקים ללב 150 U heparin (1000 U/mL) דרך החדר הימני (RV).
- פתח חלקית את ה-stopcock של קו הכבידה, כדי לייצר טפטוף איטי אך יציב של PBS/הפרין/SNP מצינורית PA שהוכנה בשלב 2.1.1.
- משחילים את המחט של תפר פוליפרופילן 4-0 מאחורי בסיס ה- PA שבו הוא יוצא מה- RV. השתמש במחצית הראשונה של קשר מנתח כדי לקשור מראש לולאה רופפת של תפר סביב בסיס ה- PA.
- בצעו חתך קטן (לא יותר מ-1/8 אינץ') ב-RV ממש מתחתיו ובניצב ל-PA באמצעות מספריים עדינים, ואז הכניסו איבר אחד של מחבר ה-PA צינורית Y לבסיס הרשות הפלסטינית. אבטחו את התפר סביב ה-PA והמחבר המוחדר והוסיפו זריקת פיתול בודדת כדי להשלים את הקשר של המנתח.
הערה: שימור ה- PA תחת זרימה מונע החדרת בועות אוויר לתוך כלי הדם שיכולים למנוע ניקוי הולם של הריאות. - חברו שסתום חד-כיווני לקצה השני של מחבר ה-PA catheter Y, ואז חתכו את פסגת הלב כדי לאפשר זרימת דם דרך החדר השמאלי.
הערה: כישלון בניתוק הקצה של הלב לפני ההחדרה דרך המשאבה עלול לגרום נזק למחסום הדם-גז, מה שמוביל לדליפת נוזלים למרחבי האוויר. - החלף את קו הזלוף לצד המשאבה באמצעות ה-stopcock המחבר בין שני הקווים, ולאחר מכן הפעל את המשאבה במהירות של 30 מ"ל לדקה. תוך כדי החדרת הריאות דרך הרשות הפלסטינית, אוורור ידני של הריאות באמצעות מזרק קנה הנשימה 10 מ"ל בערך 10-15 נשימות לדקה, כדי להקל על ניקוי הריאות מהדם. מחדירים את הריאות עד שהן הופכות לרוב לבנות, בדרך כלל דורשות 40 מ"ל של PBS/הפרין/SNP או פחות.
הערה: ניקוי לקוי של ריאות הדם עלול לפגוע בדה-תאיזציה במורד הזרם. - חותכים את קנה הנשימה האחורי ממש מעל רמת צינורית קנה הנשימה, ואז מנתחים את הריאות והלב ללא כל רקמת החיבור שנותרה ומוציאים את הריאות ואת גוש הלב.
- מלאו מזרק של 10 מ"ל עם אגרוז נקודת התכה נמוך של 2% בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ללא פנול אדום, מתוכנן מראש ל-42 מעלות צלזיוס.
הערה: הנפח המדויק של האגרוז הנדרש ישתנה בהתאם לגודל הריאות. ריאות גדולות יותר (כלומר, מחולדות הגדולות מ-400 גרם) ידרשו יותר מ-10 מ"ל אגרוז. - לנפח באופן ידני את הריאות המופקות 3x עם 10 מ"ל של אוויר (כלומר, לקיבולת הריאות הכוללת בקירוב) דרך צינורית קנה הנשימה כדי לסייע בגיוס פרנכימה קורסת.
- מיד לנפח את הריאות עם מזרק מוכן של אגרוז על ידי הזרקת האגרוז באופן ידני דרך צינורית קנה הנשימה בקצב של כ 40 מ"ל לדקה, רק עד הקצות הדיסטליים ביותר של אונות הריאה מנופחים. אם אזורים דיסטליים של ריאה נשארים מתמוטטים, להזריק 1-2 מ"ל נוספים של אגרוז.
- קחו את קנה הנשימה על ידי חיבור הכובע הלבן מסטלוק בעל 4 כיוונים למנעול הנקבה של צינורית קנה הנשימה. מניחים את הריאה בצלחת פטרי 150 מ"מ על קרח כדי לאפשר לאגרוזה להתמצק.
הערה: אינפלציה של הריאה זמן קצר לאחר המיצוי היא קריטית כדי להבטיח מילוי אחיד של פרנכימה של הריאה, ולאחר מכן חיתוך רקמות מוצלח. אם הריאה מתנפחת בצורה מאוד לא אחידה, אין להמשיך בחיתוך הריאות מכיוון שאיכות הפרוסה תהיה ירודה.
- חיתוך ריאות
הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את הליך החיתוך המדויק על סמך השימוש במיקרוטום הרטט (ויברטום); דוגמאות נוספות להכנת PCLS עם פרוסות רקמות שונות פורסמו בעבר 32,33,34.- צננו מראש את גוש הקירור המתכתי בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס והמשיכו לקרח כאשר אינכם משתמשים בהם לאורך כל הליך החיתוך.
- השתמש בטיפה קטנה של דבק ציאנואקרילט כדי לחבר להב למחזיק הלהב. חברו בזהירות את מחזיק הלהב לוויברטום באמצעות מפתח ברגים של אלן, כך שהוא פשוט יתיישר עם קצה של צינור דגימה שהוכנס למגש החיץ.
- הכינו צלחות של 6 בארות עם 3 מ"ל לכל HBSS קר כקרח סטרילי היטב ללא פנול אדום כדי לאסוף את הפרוסות.
- באמצעות אזמל, לחתוך חתיכת רקמת ריאה בערך 1-1.5 ס"מ3.
הערה: רקמת ריאות מהחלק התחתון והאמצעי של האונה השמאלית, כמו גם מהאונות האמצעיות והתחתונות הימניות, מניבה בקלות רבה פרוסות רקמה גדולות יותר הממקסמות את שטח הנאדיות. אם קיימים אזורי רקמה לא מנופחים או אזורים של רקמת חיבור, או לקצץ את הרקמה הזו עם מספריים או לכוון כלפי מטה לכיוון הבוכנה; רקמה כזו נוטה לא לחתוך בצורה נקייה. - הניחו טיפה קטנה של דבק ציאנואקרילט על הבוכנה של צינור הדגימה. דאב רקמת ריאה על מגבון נייר כדי להסיר לחות עודפת, ולאחר מכן מניח מיד את רקמת הריאה על גבי הבוכנה באמצעות זוג מלקחיים.
- החליקו את צינור המתכת של צינור הדגימה עד לגובה החלק העליון של הרקמה והחזיקו במקומו, כאשר הבוכנה נסוגה. פיפטה חיממה מראש 2% אגרוז ב-HBSS לחלק העליון של הצינור כדי להקיף לחלוטין את הרקמה.
- מניחים את גוש הקירור הקר כקרח סביב הרקמה למשך כדקה אחת כדי לאפשר לאגרוזה להתמצק.
- הכנס את צינור הדגימה למגש המאגר. מלאו את המגש ב-PBS קר כקרח עד אמצע הדרך במעלה גוש הרקמה. סובב את מתג תיבת המנוע להאצה קדימה (FF) כדי לקדם את בוכנת תיבת המנוע כך שהיא פשוט נוגעת בבסיס צינור הדגימה.
- הגדר את ההגדרות הרצויות לעובי פרוסה, מהירות חיתוך ותדירות תנודה, לדוגמה, עובי 450 מיקרומטר, מהירות 4 ותדירות תנודה 5. בחר מצב רציף ולאחר מכן הפוך את המתג למצב מופעל כדי להתחיל לחתוך.
- כאשר פרוסות טישו נופלות לתוך מגש החיץ, העבירו אותן לצלחות המוכנות של 6 בארות באמצעות לולאה או מרית מתחסנת.
- יש להפסיק את החיתוך כאשר נשאר עובי של כ-2 מ"מ של רקמה בצינור הדגימה, כדי למנוע פגיעה בלהב או חיתוך רקמה המכילה דבק.
- חזור על השלבים לעיל כדי לפרוס רקמת ריאה נוספת, לפי הצורך.
- נטרלו את הפרוסות באופן מיידי להכנת פיגומים, או הקפאו הצמדה ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך עד חודשיים. כדי להקפיא, מעבירים 4-6 פרוסות לצלחת פטרי 35 מ"מ ושואפים בזהירות לכל נוזל עודף מסביב לפרוסות. מניחים את הכלים באמבט של קרח יבש ו-100% אתנול כדי להקפיא, ואז עוטפים בנייר כסף, אוטמים בשקית ניילון ומעבירים ל-80 מעלות צלזיוס.
הערה: אין להניח פרוסות טריות ישירות למקפיא של -80 מעלות צלזיוס מכיוון שקצב ההקפאה האיטי יחסית עלול לגרום להיווצרות גבישי קרח שעלולים לפגוע ברקמה.
3. הכנת פיגומי רקמות ריאה
- הכנת חומרים ופתרונות דה-סלולאריזציה
- הקלדה אוטומטית של מסגרות, קליפים וכרטיסיות.
- הכן פתרונות דה-תאיזציה כמתואר בטבלה 1.
הערה: הוסף בנזונאז נוקלאז למאגר שחומם מראש מיד לפני השימוש ומסנן סטרילי. הכן תמיסות Triton X-100 ונתרן דאוקסיכולט (SDC) תוך 24-48 שעות מהליך הדה-סלאריזציה. הכינו תמיסות אנטיביוטיות/אנטי-מיקוטיות וחיץ בנזונאז עד 30 ד' מראש ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- חיתוך וגזירה של פרוסות ריאה
הערה: בעוד שחיתוך וגזירה עשויים להיעשות באופן לא סטרילי על הספסל, שלבי הדה-סלולאריזציה בסעיף 3.3 וכל הטיפול הבא בפיגומי הרקמה חייבים להתבצע במכסה זרימה למינרי.- מלאו צלחת פטרי 100 מ"מ כשליש מלאה ב-PBS. העברת קלטות (מסגרות המכילות שני קליפים כל אחת) וכרטיסיות לצלחת באמצעות מלקחיים.
- אם משתמשים בפרוסות קפואות, מפשירים מנה אחת בכל פעם על ידי מזיגת PBS בטמפרטורת החדר לתוך התבשיל כדי לכסות את הפרוסות. השאירו את הכלים שנותרו על קרח יבש.
- מעבירים פרוסה מופשרת לצלחת פטרי 150 מ"מ. פתח בעדינות את הפרוסה באמצעות מלקחיים עדינים, במידת הצורך, כך שהיא שוכבת שטוחה, ואז שאף בזהירות עודף PBS מסביב לרקמה.
- השתמשו בסכין גילוח, עם סרגל כמדריך, כדי לחתוך רצועה ברוחב 3 מ"מ מהפרוסה על ידי לחיצה על מלוא אורך הלהב בחוזקה כנגד התבשיל ונדנדתו מעט מצד לצד כשקצה הלהב מוחזק במקומו. לחלופין, השתמש בחותך סיבובי עם 2 להבים מקבילים המופרדים על ידי ספייסר 3 מ"מ מותאם אישית (למשל, עשוי אצטלי [פוליאוקסימתילן]) כדי לחתוך רצועות רקמה. הימנעו מקרעים, חורים, דרכי אוויר או כלי דם גדולים, או רקמת חיבור עבה.
הערה: לחיתוך מוצלח, הרצועה חייבת להיות באורך של 9 מ"מ לפחות. - באמצעות מלקחיים, להעביר את רצועת הרקמה לצלחת פטרי 100 מ"מ מוכנה.
- מקצצים את רצועת הרקמה לתוך הקסטה: מציפים את הרקמה מעל הקלטת, מרכזים את הרקמה כדי להעמיס על החורים בקליפסים משני קצותיו. עם מלקחיים עדינים, מניחים לשונית חלקית לתוך החור בקצה אחד, מיישרים בעדינות את הרקמה, ואז מניחים את הלשונית השנייה. באמצעות מלקחיים בכל יד, לחץ על כל לשונית פנימה לחלוטין כדי לאבטח את הרקמה.
הערה: אם אתם מתקשים לשמור על הרקמה במקומה לפני החיתוך, שאפו לחלק מה-PBS מהצלחת כדי להוריד את רמת הנוזלים. היזהרו לא למתוח את הרקמה בהנחת הקליפ השני, שכן הדבר עלול להוביל לקריעה. - חזור על הליך ההפשרה, החיתוך והגזירה בשלבים 3.2.2-3.2.6 עבור כמה רקמות לפי הצורך.
- דה-סלולריזציה של פרוסות
- לאחר חיתוך כל הפרוסות, העבירו את המנה בקוטר 100 מ"מ המכילה את הקלטות למכסה גלימה למינרי.
- התחל שלב 1 של פרוטוקול הדה-סלולריזציה (ראה טבלה 2): שימוש בהמוסטט מעוקל כדי לתפוס את הצדדים החרוצים של כל קלטת, העברת קלטות לצלחות של 6 בארות (2 רקמות/באר) מלאות ב-3 מ"ל של PBS + יונים + אנטיביוטיקה/אנטימיקוטיקה לכל באר (ראו מתכון לפתרון בטבלה 1).
- מניחים לוחות היטב על שייקר מסלולי ב-30 סל"ד למשך 10 דקות.
- המשך עם שלב 2 של פרוטוקול הדה-סלאריזציה (ראה טבלה 2): שאפו את הנוזל מכל באר, ואז החליפו ב-3 מ"ל/באר PBS + יונים, הניחו את הצלחת על שייקר מסלולי ב-30 סל"ד ודגרו במשך 5 דקות.
- חזור על שלב 3.3.4 עבור כל אחד מהפתרונות ומשכי הזמן המתאימים כמתואר בפרוטוקול הדה-סלולריזציה בטבלה 2.
- לאחר שלב השטיפה האחרון עם PBS + אנטיביוטיקה/אנטימיקוטיקה (שלב 20 בטבלה 2), מעבירים רקמות לצלחות סטריליות של 6 בארות עם PBS טרי + אנטיביוטיקה/אנטימיקוטיקה, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
הערה: לאחר עיקור עם אנטיביוטיקה /אנטימיקוטיקה, ניתן לזרוע פיגומי רקמות ריאה באופן מיידי, או לאחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 30 ד'.
4. רסלולריזציה של פרוסות ותרבית
הערה: איור 2 מראה ציר זמן מוצע לזריעת רקמות ולתרבית, שבו פרוסות נזרעות תחילה עם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות חולדות ותרביות מתורבתות במדיום אנדותל נמוך בסרום; לאחר מכן נזרע עם AEC2s של חולדה ופיברובלסטים של ריאות חולדות עם מדיום גדילה AEC2 ללא סרום (מותאם מ- Jacob et al.13 ו- You et al.35); ראה הערות נוספות על מקורות תאים המשמשים בפרטי מדיה של תוצאות ותרביות בטבלה 3. אסטרטגיה זו מניבה מבנים דמויי alveolar המכילים מונו-שכבות AEC2.
- הכנת פיגומי רקמות לזריעה (יום -4 או -3)
- אם משתמשים בפיגומי רקמות המאוחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, דגירו פיגומים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם PBS טרי + אנטיביוטיקה/אנטימיקוטיקה (10% פניצילין/סטרפטומיצין, 4% אמפוטריצין B, 0.4% גנטמיצין ב-PBS) לפני הזריעה.
- יש לשטוף פיגומים 3x עם PBS סטרילי (5 מ"ל/באר), 5 דקות כל אחד.
- בחנו פיגומים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 5 כדי לבחור רקמות לזריעה.
הערה: הפיגומים הטובים ביותר לזריעה אינם מכילים קרעים או חורים ואינם מכילים דרכי אוויר או כלי דם גדולים. בעוד שפיגומים עם התכונות עשויים להיזרע בהצלחה, דפוסי אכלוס מחדש עשויים להיות שונים מאלו שנצפו באזורים נאדיים.
- זריעת תאי אנדותל (יום -3)
- ספרו את תאי האנדותל באמצעות המוציטומטר והכינו את תרחיף תאי האנדותל בתווך האנדותל (ראו טבלה 3) ב-5 x 106 תאים/מ"ל, עם מספיק תאים כדי לזרוע 500,000 תאי אנדותל לכל פרוסה (למשל, עבור 12 פרוסות, החייאה 6 x 106 תאים במדיום של 1.2 מ"ל).
- מניחים אמבטיות זריעה אוטוקלאביות בכלי פטרי 100 מ"מ. מעבירים פיגומים שטופים במהופך לאמבטיות זריעה: השתמשו בהמוסטאט מעוקל עדין כדי לתפוס קלטת בצדדים החרוצים, השתמשו בהמוסטאט ישר או במלקחיים כדי לתפוס קצה אחד של הקלטת (היזהרו שלא לגעת ברקמה עצמה) והפכו, ואז תפסו שוב את הקלטת עם קצות ההמוטט המעוקל העדין דרך החורים לאורך הצדדים החרוצים, ומניחים היטב באמבט זריעה. חזור על הפעולה עבור קלטות שנותרו.
הערה: כאשר הם ממוקמים כהלכה, הפיגומים יהיו ממורכזים, במהופך, בתחתית כל באר. במידת הצורך, לחץ בעדינות על פינת הקלטת עם קצות המוסטאט כדי לוודא שהקלטת יושבת שטוחה בבאר. ישיבה לא נכונה של הקלטת עלולה להוביל לזריעת רקמות לקויה. זה מקובל אם הבאר מכילה כמות קטנה של PBS. - סובבו את תרחיף התא המוכן בעדינות כדי לערבב, ואז השתמשו בפיפטה ידנית כדי לסובב תאי 100 μL ישירות על גבי כל רקמה בבסיס הבאר, תוך זהירות שלא לפגוע ברקמה עם קצה הפיפטה.
- העברת רקמות שנזרעו לחממת תרביות התאים ב-37 °C/5% CO2.
- לאחר שעתיים, הוסיפו מדיום תרבית מחומם מראש של 900 μL לכל באר באמצעות פיפטה ידנית, ואז חזרו לחממה. אם קלטת הופכת לבלתי נספגת (מרחפת) עם הוספת מדיום, לחץ בעדינות על פינת הקלטת עם קצה הפיפטה כך שהיא תשתרע שטוחה בבאר.
- שינוי בינוני ביום -2. הסר את המדיום על ידי הטיית צלחת הפטרי ופיפטינג ידני עם קצה פיפטה המוצב קלות בפינת הבאר, כדי לא להפריע לקלטת. החלף ב-1 מ"ל של מדיום אנדותל טרי לכל באר.
- AEC2 וזריעת פיברובלסטים ותרבית רקמה (יום 0)
- ספירת AEC2s ופיברובלסטים באמצעות המוציטומטר. הכינו תרחיף של 1:1 תאים של AEC2s ופיברובלסטים במדיום גדילה AEC2 (מדיום בסיס אפיתל + תוספי AEC2; ראו טבלה 3) ב-5 x 106 תאים/מ"ל כוללים, עם מספיק תאים כדי לזרוע 500,000 תאים (250,000 AEC2s ו-250,000 פיברובלסטים) לכל פרוסה (למשל, עבור 12 פרוסות, resuspend 3 x 106 AEC2s + 3 x 106 פיברובלסטים יחד במדיום של 1.2 מ"ל).
- פיפטה את המדיום מכל באר של אמבט הזריעה כמתואר בשלב 4.2.6. סובבו את תרחיף התא המוכן בעדינות כדי לערבב, ואז פיפטה 100 תאי μL ישירות על גבי כל רקמה בבסיס הבאר.
הערה: זה מקובל אם כמות קטנה של מדיום אנדותל נשארת בבאר שלפני זריעת AEC2/ פיברובלסט. - העברת רקמות שנזרעו לחממת תרביות התאים ב-37 °C/5% CO2.
- לאחר 2 שעות, הוסיפו 900 μL קדם-חימום AEC2 צמיחה בינוני לכל באר, ואז חזרו לחממה.
- לאחר 24 שעות של תרבות (יום 1), הכינו צלחת של 12 בארות עם 1 מ"ל של מדיום צמיחה AEC2 שחומם מראש לכל באר לכל קלטת.
- פיפטה 800 μL של מדיום מכל באר של אמבט הזריעה. מוציאים קלטות מאמבטיית הזריעה: אוחזים כל אחת מהן בהמוסטאט מעוקל עדין דרך החורים לאורך הצדדים החרוצים, מעבירים להמוסטאט ישר או מלקחיים כדי לתפוס את הקלטת בקצה אחד והופכים, ואז משתמשים בהמוסטאט המעוקל כדי לתפוס את הקלטת דרך הצדדים החרוצים ולהעביר לצד ימין למעלה, אחד לכל באר, לצלחת המוכנה של 12 בארות.
- שנה את מדיום התרבית בצלחת 12 הבאר כל יומיים עד יום 7 או עבור האורך הרצוי של תרבית: השתמש פיפטה פסטר זכוכית כדי לשאוף את המדיום מכל באר, תוך זהירות לא לגעת ברקמה; פיפטה ב 1 מ"ל טרי AEC2 צמיחה בינונית לכל באר.
הערה: ניתן לנטר את מידת ההדבקה מחדש של הרקמות באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 5 לאורך כל משך התרבית.
5. קצירת רקמות וניתוח דגימות
- כדי לתקן ELTs להיסטולוגיה ולכתמים אימונופלואורסצנטיים, העבירו קלטות תרביות רקמה לפורמלין בעל אגירה ניטרלית של 10% ודגירה למשך 3-4 שעות בטמפרטורת החדר על נדנדה. הסר רקמות מתוך קלטות על ידי שימוש בקצה של מלקחיים מחודדים עדינים כדי לחתוך את הרקמה שבה היא פוגשת את הכרטיסיות. רקמות עיבוד על פי שיטות שגרתיות להטבעת פרפין והיסטולוגיה; אין צורך בטכניקות מיוחדות.
- כדי לעבד ELTs עבור qRT-PCR, לשטוף רקמות קלטות ב- PBS 2x, ולאחר מכן להסיר רקמות ולהצמיד להקפיא או להמשיך עם lysis עבור מיצוי RNA.
הערה: איגום לפחות 2 פרוסות שנזרעו עם 1 x 106 תאים ותרבית במשך 7 ימים אמורים להניב RNA בשפע לניתוח PCR במורד הזרם.
Representative Results
סקירה כללית של התהליך ליצירת ELTs - הכוללת חיתוך ריאה, חיתוך פרוסות ודה-תאיזציה, ופילוג מחדש של פיגומים - מוצגת באיור 3. ה-ELTs שהוצגו כאן עברו תרבית באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים של ריאה של חולדה (ראו טבלת חומרים), AEC2 של חולדה ילודית, ופיברובלסטים של ריאה של חולדה מועשרת בליפופיברובלסט36. AEC2s בודדו זה עתה באמצעות מיון מבוסס חרוזים מגנטיים כפי שתואר קודם לכן37; פרוטוקולי בידוד חלופיים פורטו ונדונו במקום אחר 38,39,40. ניתן להעריך את טוהר ה-AEC2 של חולדה מבודדת באמצעות ציטומטריה של זרימה עבור סמן פני השטח AEC2 ספציפי לחולדה RTII-7041, או באמצעות צביעה של דגימת תאים ציטוצנטריפוגים עבור RTII-70 או חלבון פרו-פעילי שטח C (pSPC). פיברובלסטים של ריאות חולדה בודדו מגורים של חולדות לאחר הלידה 7-9 על פי התאמה של פרוטוקול42 שפורסם ושימשו במעבר 1-2; פרוטוקולי בידוד חלופיים תוארו במקומות אחרים43,44. ניתן להעריך את טוהר הפיברובלסטים המבודדים באמצעות צביעה של תאים בתרבית או ציטוסנטריפוגה עבור וימנטין סמן מזנכימלי, וניתן להעריך העשרת ליפופיברובלסט באמצעות צביעה עבור שמן אדום O45.
כאשר רקמת הריאה מנופחת באופן אחיד באגרוז, וחתיכות רקמה שנבחרו באופן אסטרטגי ומכוונות לחיתוך כדי למקסם את שטח הרקמה הכולל והפארנכימלי, ריאת חולדה אחת עשויה להניב רקמה עבור >100 ELTs נאדיים. רצועות של PCLS מפגינות שלמות מכנית מספקת כדי להיחתך לקלטות רקמות עם מעט (<5%) מקרים של קריעה (איור 3B).
הפרוטוקול לדה-תאיזציה של פרוסות ריאה מבוסס באופן הדוק על פרוטוקול הדה-תאיזציה של הריאה השלמה שלנו שפורסם בעבר, אשר על ידי פרוטאומיקה כמותית הודגם כמי שמשמר רכיבי ECM רבים ברמות שאינן שונות באופן משמעותי מאלו שבריאות מקומיות22. פיגומי פרוסות שעברו דה-תאיזציה משמרים את הארכיטקטורה הטבעית של הנאדיות, כפי שהיא נצפית על ידי צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E) (איור 4A,B) ועל ידי מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (איור 4C). בדרך כלל איננו כוללים פיגומים המכילים דרכי אוויר או כלי דם גדולים (איור 4D) או קרעים, אם כי ניתן לכלול את הראשונים אם הם מעניינים את החוקר. דה-תאיזציה מובילה לירידה של 96% בתכולת הדנ"א של הרקמה כפי שנמדדה על-ידי בדיקה של דנ"א דו-גדילי (ראו טבלת חומרים; 0.50 מיקרוגרם/מ"ג ± 0.073 מיקרוגרם/מ"ג לעומת 0.018 מיקרוגרם/מ"ג ± 0.0035 מיקרוגרם/מ"ג ברקמה מקומית לעומת נטולת תאים, בהתאמה, ממוצע ±-SEM) (איור 5A), ללא דנ"א הנראה לעין על-ידי צביעת המטוקסילין (איור 4B). צביעה היסטולוגית ואימונופלואורסצנטית של פיגומים שעברו דה-תאיזציה חושפת תחזוקה של חלבוני ECM קולגן, אלסטין, קולגן IV ולמינין עם ארכיטקטורה וכמות דומה לזו שבפרוסות ריאה מקומיות (איור 5B-E). שימו לב שגרעיני הרקמות המקומיות מכתימים בכחול/שחור עם כתמי טריכום (לקולגן) ו-EVG (לאלסטין). צביעה אימונופלואורסצנטית בוצעה כפי שתואר קודם לכן, תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות להכתמת רקמות37. הנוגדנים שבהם נעשה שימוש והריכוזים המתאימים להם מפורטים בטבלה 4.
ריקולציה מוצלחת של פיגומים מובילה ל-ELTs תאיים גבוהים לאחר 7 ימים, עם תבנית של אכלוס מחדש דמוית נאדיות הנראית על ידי מיקרוסקופיית אור (איור 6A-C). במקרים מסוימים, עם תאיות גבוהה מאוד, מבנים מסוג אורגנואידים עשויים להיות גלויים (איור 6A,B). ניתן לדמיין זריעת רקמות לא מוצלחת על ידי מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה במהלך תרבית (איור 6C). לאחר גידול פיגומי רקמות עם AEC2s, פיברובלסטים ותאי אנדותל, ELTs מאוכלסים מחדש בצפיפות במבנים דמויי נאדיות המרכיבים את כל שלוש שושלות התאים (איור 6D,E). ביום ה-7 או ה-8, AEC2s שומרים על מורפולוגיה קובידיאלית ומבטאים חלבון פעילי שטח-B (SPB) וחלבון גוף למלרי ABCA3, ללא עדות להבחנה משמעותית ל-AEC1s (איור 6E,F). AEC2s מתרבים מאוד ב-ELTs, כפי שהודגם על-ידי שילוב של 5-אתניל-2'-דאוקסיורידין (EdU) לאחר פולס של שעתיים ב-10 מיקרומטר (איור 6G).
איור 1: סכמטית של מערכת הזלוף לצורך מיצוי ריאה ופינוי. (A) מערכת הזלוף כוללת איבר מונע כבידה, המשמש לתצפית ראשונית של עורק הריאה תחת זרימה; וגפה מונעת משאבה, המשמשת לפינוי הריאות ביעילות לאחר תותח ראשוני. קו המשאבה כולל "משכך דופק" המרכך את הקוצים בלחץ הנגרם על ידי המשאבה. העיצוב של צינוריות קנה הנשימה והעורקים הריאתיים מפורט משמאל. SNP = נתרן ניטרופרוסיד. (B) פרטים על מכלול משכך הדופק. BPT וסיליקון מתייחסים לסוגי צינורות. (C) מיקומים של צינוריות עורקי קנה הנשימה והריאות הממוקמות במהלך מיצוי הריאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ציר זמן של תרבית לרה-סלולריזציה של שלוש שושלתות. ציר זמן מוצע לזריעת ELT תלת-שושלתית ולתרבות, כולל תזמון של זריעה דו-שלבית. מספרי תאים עבור זריעה ואמצעי תרבית עבור כל שלב מסומנים. ראו פרטי מדיה תרבותית בטבלה 3. AEC2 = תא אפיתל מסוג 2. EC = תא אנדותל. FB = פיברובלסט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: סכמטית של הכנת רקמת ריאה מהונדסת. (B) פרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק נחתכות לרצועות סטנדרטיות ברוחב 3 מ"מ, נחתכות לתוך קלטות תרביות-רקמה של פוליטטראפלואורתילן (PTFE), ודטרגנטים שעברו דה-תאיזציה כדי לייצר פיגומי מטריצה חוץ-תאית. (C) פיגומים נזרעים מחדש באמבטיות זריעה מיוחדות המגבילות את אזור הזריעה לאזור הרקמה, ולאחר מכן מתורבתים בצלחת באר סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: מבנה של פיגומי ריאות שעברו דה-תאיזציה. צביעת H&E של פרוסות ריאה מקומיות (A) ודה-תאיות (B) המראה שימור של ארכיטקטורת נאדיות לאחר דה-תאיזציה. (ג,ד) דוגמאות לפיגופי ECM שעברו דה-תאיזציה הנצפים בהגדלה של פי 5 על ידי מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה, הכוללת בעיקר רקמה נאדית (C) או מכילה דרכי אוויר וכלי דם מסתעפים גדולים (ראשי חץ D, שחורים ואדומים). מוטות קנה מידה, 50 מיקרומטר (A,B); 500 מיקרומטר (C,D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הסרת דנ"א ושימור מטריצה בפיגומי ריאות שעברו דה-תאיזציה. (A) כימות דנ"א בפרוסות ריאה מקומיות ודה-תאיות (ממוצע ± SEM, n = 5). מבחן t של וולש, **P < 0.01. Decell = decellularized. (ב,ג) צביעה היסטולוגית של פרוסות ריאה מקומיות ודה-תאיות עבור קולגן (B) ואלסטין (C). ראשי חץ, אלסטין שהשתמר בטבעות כניסה אלוואולריות של רקמה נטולת תאים. (ד,ה) צביעה אימונופלואורסצנטית של פרוסות ריאה מקומיות ודה-תאיות עבור קולגן IV (D) ולמינין (E). מוטות קנה מידה, 50 מיקרומטר. בכל החלוניות, תיבות מנוקדים מתארות את אזור התמונה המוגדל מימין בכל פאנל בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: אכלוס מחדש של התאים של רקמות ריאה מהונדסות. (א-ג) דוגמאות ל-ELTs שעברו רילוקולריזציה מחדש ביום ה-7 של התרבית, כפי שהומחשו במהלך התרבית על ידי מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה. תבנית הרית-התאים משקפת את המבנה הנאדי של הרקמה. באזורים מסוימים של תאיות גבוהה, מבנים דמויי אורגנואידים עשויים להיווצר (ראשי חץ). (A) ו-(B) מייצגים רימולציה מוצלחת של התאים, בעוד ש-(C) מייצג רמה ירודה של רה-תאיזציה לאחר 7 ימים של תרבית. (ד-ז) צביעה של ELTs שעברו רילוקולריזציה ביום 7 או 8 של התרבות. (D) צביעת H&E המציגה ריסוף תאי של הספטה הנאדית. (E) תוויות צביעה אימונופלואורסצנטיות חרוטות על פיברובלסטים proCollagenIα1+ , ABCA3+ AEC2s ותאי אנדותל CD31+ . (F) רקמות מכילות שפע של SPB+ AEC2s אך מעט RTI-40 (פודופלנין)+ AEC1s בתנאים אלה. (G) AEC2s רבים מתרבים ב-ELTs, כפי שנמדד על ידי שילוב EdU. מוטות קנה מידה, 500 מיקרומטר (A-C); 25 מיקרומטר (D-G). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: פתרונות דה-סלולריזציה. פרטי הכנה לפתרונות דה-סלולריזציה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: פרוטוקול דה-סלולריזציה. פרטי פרוטוקול לדה-תאיזציה של פרוסות ריאה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: מדיה תרבותית. פרטי הכנה למדיית צמיחה אנדותל ו-AEC2. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4: נוגדנים המשמשים לשמירה חיסונית. פרטים על נוגדנים וריכוזיהם המשמשים לתכשיר חיסוני. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים 1: תכנון עבור מסגרות קלטות תרביות רקמה לחיתוך לייזר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: עיצוב עבור קליפסים של תרביות רקמה לחיתוך לייזר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: תכנון כרטיסיות קלטות תרבית רקמה לחיתוך לייזר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 4: קובץ CAD לזריעת בסיס עובש אמבטיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 5: קובץ CAD לזריעת טבעת עובש אמבטיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
מאמר זה מתאר את השימוש בפרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה מדויקת כפלטפורמה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות במבחנה, המכילות מבנים דמויי אלוואולר רב-שושלתיים. על ידי שילוב אסטרטגיות שפיתחנו בעבר כדי לאכלס מחדש פיגומי ריאה ECM תאיים בנאמנות גבוהה עבור הנדסת ריאות שלמה22,31, עם המערכת החזקה שלנו לעיבוד מחדש של רקמות לב מהונדסות בקנה מידה קטן30, פרוטוקול זה מאפשר שימוש ב- ECM של ריאה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית כמצע תרבית רקמה, באופן הניתן לחזרה ותפוקה בינונית.
השיטות המוצגות כאן מפרטות את הכנת פיגומי ELT מריאות חולדה, הניתנות להשגה בקלות, ניתן לחלץ אותן בגוש עם גישה ישירה לדרכי אוויר שלמות לצורך אינפלציית אגרוז, והן בגודל גדול יותר מריאת עכבר. עם זאת, כל רקמת ריאה שניתן לנפח עם אגרוז ולהניב פרוסות באורך של לפחות 9 מ"מ עשויה לשמש במערכת זו. ללא קשר למקור הרקמה, אינפלציה אחידה של רקמת הריאה עם אגרוז היא הצעד הקריטי ביותר להבטחת ההצלחה של חיתוך, גזירה וטיפול ברקמות במורד הזרם. רקמת ריאה מנופחת בתת-זווית נוטה שלא להיפרס בצורה נקייה, בעוד שרקמה מנופחת יתר על המידה עלולה להיקרע במהלך החיתוך. לאחר ג'לציה של אגרוז, אזורי רקמות מנופחים כראוי הם מוצקים אך מספקים מעט לתת כאשר לוחצים בעדינות עם מלקחיים. עבור ריאות חולדה שלמות, מצאנו כי ניפוח מראש של הריאות המופקות עם אוויר מספר פעמים, ואחריו אינפלציית אגרוז בהקדם האפשרי לאחר המיצוי, מביא לתוצאות החיתוך הטובות ביותר ולאיכות הטובה ביותר של פיגומי הרקמות המתקבלים. הנפח המתאים של אגרוז צריך להיות מותאם אמפירית; עבור ריאה של חולדה, הנפח הנדרש כדי לנפח את הריאה לקיבולת הריאות הכוללת הוא כ-30 מ"ל/ק"ג מסת בעלי חיים (למשל, 10.5 מ"ל אגרוז לריאות מחולדה של 350 גרם). עבור רקמות ריאה גדולות יותר שנכרתו עם גישה פחות פשוטה לדרכי הנשימה (כגון אלה של תורמים אנושיים), ייתכן שיהיה צורך בפתרון בעיות נוסף כדי לנפח את הרקמה באמצעות ברונכוס32. במהלך חיתוך הריאה שלאחר מכן, הבחירה והכיוון של הרקמה על הבוכנה היא צעד חשוב נוסף 1) להבטיח כי הפרוסות גדולות מספיק כדי ליצור רצועות רקמה שניתן לחתוך לתוך קלטות תרבית רקמה 2) למקסם את שטח הרקמה parenchymal (alveolar), למעט דרכי הנשימה הגדולות או כלי הדם.
חיתוך ה- PCLS לקלטות תרבית רקמה יכול להיות צעד מאתגר בתחילה, אך הקלטות מפשטות מאוד את הטיפול ברקמות במהלך דה-תאיזציה וזריעה. שתי בעיות פוטנציאליות שעלולות להתעורר הן קריעת רקמות (במהלך תהליך החיתוך, או במהלך הדה-תאיזציה), או מיקום רקמות בקליפסים שגורם לזריעה לקויה במורד הזרם (למשל, ללא זריעה, או זריעה רק בקצוות). קריעה עשויה להיות תוצאה של אינפלציית יתר של אגרוז, מתיחת יתר של הרקמה במהלך החדרת לשונית, או השארת מעט מדי תקרה כדי לספק אחיזת רקמה מספקת בעת החדרת הכרטיסיות. שימו לב שפרוסות שנקרעות בקצה קליפ אחד עשויות להיזרק בהצלחה, אולם קשה לדמיין אותן מתחת למיקרוסקופ במהלך התרבית מכיוון שהרקמה אינה שטוחה. זריעת רקמות לקויה (כמו זו שבאיור 6C) היא ככל הנראה תוצאה של העובדה שהפרוסה לא שכבה שטוחה בין שני הקליפים, ובכך יוצרת מגע לקוי עם בסיס אמבט הזריעה היטב כשהיא הפוכה. סיבה אפשרית נוספת היא ישיבה לא נכונה של הקלטת בתחתית אמבט הזריעה היטב. מבחינת גזירה, יש למרוח מעט יותר מתח ברקמה בעת הנחת הקליפ השני כדי לעזור לו לשכב שטוח. לחלק מהפרוסות יש קעורה קלה; במקרים אלה חותכים את הפרוסה עם הצד הקמור למעלה. עם התרגול, אנו בדרך כלל חווים זריעה כושלת עם פחות מ-2% מהפרוסות.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא הדרישה עבור כמה ציוד מיוחד - חותך לייזר ומדפסת 3D - כדי ליצור את החומרים הראשוניים להכנת ELT. עם זאת, לאחר שנוצרות קלטות תרביות הרקמה ואמבטיות הזריעה, אין צורך בחומרים מיוחדים נוספים. שלבי החיתוך והדה-תאיזציה של הריאות בהכנת פיגומי ELT גוזלים זמן רב במידה בינונית; עם זאת, צעדים אלה עשויים להתבצע מראש, או במספרים המספיקים כדי להתכונן לניסויים מרובים בו זמנית. PCLS רבים (>100 אם מייעלים אותם לאזורים פרנכימליים) ניתנים לחתוך מריאה אחת ולהקפיא אותם לשימוש מאוחר יותר. בעוד שמחזור הפשרה יחיד של הקפאה עלול לגרום לנזק אולטרה-סטרוקטורלי קל ל-ECM46, אפילו מחזורי הפשרה מרובים של הקפאה הוכחו כלא גורמים לאובדן משמעותי ב-ECM 23,47. ניתן גם לחתוך PCLS ולטהר אותו לפני ניסוי, לשימוש תוך חודש. (יש לציין כי ניתן לבצע את פרוטוקול הדה-תאיזציה המתואר תוך כ-6 שעות, מה שמייצג יתרון משמעותי על פני שיטות שתוארו קודם לכן הדורשות יום או יותרשל 27,28.) לאחר הכנת הפיגומים, תהליך זריעת התאים הוא פשוט ומהיר, ותרבית ה- ELTs אינה דורשת טכניקות מיוחדות.
אזהרה של שיטת ELT המתוארת היא היעדר זריעה ספציפית לאזור, כלומר מסירה של AEC2s במיוחד לחלל הנאדי, או תאי אנדותל במיוחד למרחב כלי הדם. אף על פי כן, אף על פי שהתאים פשוט נזרעים על גבי פיגומי הרקמה, תבנית ההסתגלות מחדש אינה אקראית, עם מראית עין מסוימת של ארגון דמוי נאדיות, כולל טבעות אפיתל. אנו חושדים כי אינטראקציות בין תאים לתאים, כמו גם הבדלים מקומיים בהרכב ה-ECM ובגאומטריה 20,21,ככל הנראה תורמים לדפוסי הרית-התא שנצפו. כדי לתמוך בהשערה זו, מחקר שפורסם בעבר, שבו פיברובלסטים נזרעו באופן לא ספציפי על פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה, הראה כי הדפוס של ריפוד מחדש של רקמות ופנוטיפים תאיים נלווים השתנו באופן משמעותי לפי אזור רקמה מיקרוסקופית ומקור פיגום ECM (למשל, בריא לעומת חולה)27. פיברובלסטים נצפו גם פולשים לתוך האינטרסטיציום - המיקום שבו הם שוכנים ברקמת ריאה מקומית 1,27. השיטה החלופית העיקרית שאנו יכולים לדמיין כדי לתרבת תאים על פרוסות ריאה באופן ספציפי באמת לאזור, תהיה כרוכה בזריעת ריאות נטולות תאים שלמים דרך דרכי הנשימה31,48 ותאי כלי הדם49,50, ולאחר מכן חיתוך הרקמה התאית מחדש. עם זאת, חלופה זו 1) היא הרבה יותר עלות, זמן ומשאבים עתירי משאבים; 2) הוא תפוקה נמוכה יותר; 3) דורש מספר גדל והולך של בעלי חיים; ו-4) קשורה לסיכון מוגבר לזיהום עקב האתגרים של תרבית ריאות שלמה וחיתוך של הריאה הזורעת לאחר מכן. למרות שאינה מסכמת את כל ההיבטים של ארגון תאי מקומי, פלטפורמת ELT מאפשרת תרבית תאי ריאה על מצע ECM רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, באופן נגיש למעבדות רבות נוספות.
הגמישות של מערכת ELT היא יתרון גדול של פלטפורמה זו, ואמורה לאפשר תרבית רקמת ריאה בקנה מידה קטן עם כל מספר של פיגומי רקמות, תאים או מדיה תרבית מעניינת. השימוש בפיגומים שמקורם ברקמה חולה או ממודלים של פציעה עשוי לאפשר מחקר של אינטראקציות בין תאים לתאים או למטריצות תאים בסביבה של ECM 27,29,51 ששונה ממחלה. עם זאת, שים לב שייתכן שיהיה צורך להתאים את פרוטוקול הדה-תאיזציה כדי להסביר את הבדלי המטריצה בין מינים52. אסטרטגיית הזריעה המתוארת יכולה לשמש לכל סוג תא, וציר הזמן של התרבית מותאם כך שיתאים לצרכי החוקר. כנקודת מוצא, 1 x 106 תאים לכל פיגום אמורים להניב רקמה תאית גבוהה תוך 7 ימים מהתרבית, בעוד ש-1 x 105 תאים בסך הכל גורמים לתאים ירודים. בכל התאמה של ציר הזמן, יש להסיר את קלטות תרביות הרקמה מאמבט הזריעה 24 שעות לאחר זריעת הרקמה האחרונה. כאן, במטרה לדגום חלק מהמורכבות התאית של נאדיות הריאה, אנו מתארים אסטרטגיית רה-תאיזציה תלת-תרבית התומכת בתחזוקה של AEC2 יילודים מובחנים היטב במבנים דמויי נאדיות למשך 7 ימים לפחות. התוצאות שלנו גם מדגימות את ההשתלה המוצלחת של פיברובלסטים ותאי אנדותל בתוך ELTs, תוך שימת דגש על הישימות הרחבה של מצע התרבית והתאמתו למחקרי תרביות משותפות. זריעת תאים בוגרים ב-ELTs עשויה להקל על המידול של מבנים נאדיים שקטים יותר, בעוד שזריעה של תאי AEC2 שמקורם ב-PSC אנושי, כולל אלה עם שינויים גנטיים, עשויה להקל על מחקרים תרגומיים של מחלות אנושיות13,53. באופן כללי, הגישה מלמטה למעלה המאפשרת פלטפורמת ELT מציגה את ההזדמנות לחקור את התרומות של סוגי תאים מסוימים לקריאות מעניינות - כגון התפשטות AEC2 או מצב התמיינות.
לסיכום, פרוטוקול זה מתווה מערכת חזקה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות למחקרי תרבית משותפת של AEC2s, פיברובלסטים ותאי אנדותל בתוך פיגומי פרוסות ריאה ECM תאיים. ELTs מייצגים אסטרטגיית תרבות תלת-ממדית חדשנית עבור AEC2s ראשוניים, שעד כה הסתמכו בדרך כלל על מטריצות פחות פיזיולוגיות מסוג ג'ל כדי לשמור על פנוטיפ מובחן היטב 6,11,12. הפלטפורמה הנוכחית מתבססת על עבודות קודמות בתחום הריאה המחודשת של פרוסות 24,25,25,26,27,28,29, אך מציעה מספר יתרונות: 1) מערכת קלטות תרבית רקמה כדי להקל על טיפול ב-ELT במהלך דה-תאיזציה, זריעה ותרבית; 2) אמבט זריעה מותאם אישית כדי לזרוע במדויק מספר ידוע של תאים על כל פיגום פרוסה; ו-3) אסטרטגיית זריעה מחדש תלת-תרבית המאפשרת ריכון מחדש של רקמת הנאדיות עם תאי אפיתל, מזנכימל ואנדותל. לפיכך, ELTs מייצגים צעד חשוב קדימה לקראת יצירת מודלים ניתנים לשחזור במבחנה הלוכדים את המורכבות התאית והמצעית של הנאדיות המקומית ונישת תאי הגזע AEC2.
Disclosures
L.E.N. הוא מייסד ובעל מניות בחברת Humacyte, Inc, שהיא חברה לרפואה רגנרטיבית. Humacyte מייצרת כלי דם מהונדסים מתאי שריר חלקים אלוגניים לניתוחי כלי דם. לבן זוגה של L.E.N. יש הון עצמי בהומסייט, ול.א.נ. מכהנת בדירקטוריון של הומאצ'יטה. L.E.N. היא ממציאה על פטנטים בעלי רישיון להומסייט ומייצרים תמלוגים עבור L.E.N. L.E.N. קיבלה מתנת מחקר בלתי מוגבלת לתמיכה במחקר במעבדה שלה בייל. הומאצ'יטה לא השפיע על ההתנהלות, התיאור או הפרשנות של הממצאים בדו"ח זה.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות ללורנצו סובאנן וחורחה נונז על עבודתם בפיתוח תכנון קלטת תרביות הרקמה המשמשות בפרוטוקול זה, למעבדת קמינסקי לשימוש בוויברטומה שלהם, למאוריציו צ'יוצ'יולי וג'סיקה נואוס על הסיוע בחיתוך ריאות, לאלי לרוקו על הסיוע בניסויי פיילוט ראשוניים, ולהונג צ'יאן על קריאה מדוקדקת של הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH F30HL143880 (K.L.L.), מענק ההכשרה של תוכנית ההכשרה למדענים רפואיים T32GM136651 (K.L.L.), ו- U01HL145567 (L.E.N.); ועל ידי מתנת מחקר בלתי מוגבלת של Humacyte Inc. (L.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| 8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
| Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
| Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
| Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
| CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
| Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
| Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
| Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
| Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
| Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
| Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
| Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
| KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
| Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
| Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
| Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
| MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
| Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
| NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
| Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
| PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
| Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
| Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
| Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
| Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
| Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
| PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
| PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
| Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
| Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
| Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
| Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
| Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
| Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
| Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
| Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
| Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
| Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
| Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
| Transferrin human | Sigma | T8158 | |
| Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
| Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
| Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
| Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |
References
- Burri, P. H. Morphology and respiratory function of the alveolar unit. International Archives of Allergy and Applied Immunology. 76, Suppl 1 2-12 (1985).
- Barkauskas, C. E., Noble, P. W. Cellular Mechanisms of Tissue Fibrosis. 7. New insights into the cellular mechanisms of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (11), 987-996 (2014).
- Taylor, M. S., et al. A Conserved Distal Lung Regenerative Pathway in Acute Lung Injury. American Journal of Pathology. 188 (5), 1149-1160 (2018).
- Carsana, L., et al. Pulmonary post-mortem findings in a series of COVID-19 cases from northern Italy: a two-centre descriptive study. Lancet Infectious Diseases. 20 (10), 1135-1140 (2020).
- Basil, M. C., et al. The Cellular and Physiological Basis for Lung Repair and Regeneration: Past, Present, and Future. Cell Stem Cell. 26 (4), 482-502 (2020).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Desai, T. J., Brownfield, D. G., Krasnow, M. A. Alveolar progenitor and stem cells in lung development, renewal and cancer. Nature. 507 (7491), 190-194 (2014).
- Evans, M. J., Cabral, L. J., Stephens, R. J., Freeman, G. Renewal of alveolar epithelium in the rat following exposure to NO2. The American Journal of Pathology. 70 (2), 1-24 (1973).
- Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
- Borok, Z., et al. Keratinocyte growth factor modulates alveolar epithelial cell phenotype in vitro: expression of aquaporin 5. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 18 (4), 554-561 (1998).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary Type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
- Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Chen, Y. W., et al. A three-dimensional model of human lung development and disease from pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 19 (5), 542-549 (2017).
- Korogi, Y., et al. In vitro disease modeling of hermansky-pudlak syndrome Type 2 using human induced pluripotent stem cell-derived alveolar organoids. Stem Cell Reports. 12 (3), 431-440 (2019).
- Strikoudis, A., et al. Modeling of fibrotic lung disease using 3D organoids derived from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3709-3723 (2019).
- Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
- Chapman, H. A. Epithelial responses to lung injury: Role of the extracellular matrix. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (3), 89-95 (2012).
- Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Zhou, Y., et al. Extracellular matrix in lung development, homeostasis and disease. Matrix Biology. 73, 77-104 (2018).
- Calle, E. A., et al. Targeted proteomics effectively quantifies differences between native lung and detergent-decellularized lung extracellular matrices. Acta Biomaterialia. 46, 91-100 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: Detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1055 (2013).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Burgstaller, G., et al. Distinct niches within the extracellular matrix dictate fibroblast function in (cell free) 3D lung tissue cultures. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (5), 708-723 (2018).
- Sun, H., et al. Fibroblast engraftment in the decellularized mouse lung occurs via a β1-integrin-dependent, FAK-dependent pathway that is mediated by ERK and opposed by AKT. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (6), 463-475 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Schwan, J., et al. Anisotropic engineered heart tissue made from laser-cut decellularized myocardium. Scientific Reports. 6, 32068 (2016).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Gerckens, M., et al. Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
- Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).
- Neuhaus, V., et al. Assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (135), e57042 (2018).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 283 (6), 1315-1321 (2002).
- Vaccaro, C., Brody, J. S. Ultrastructure of developing alveoli. I. The role of the interstitial fibroblast. The Anatomical Record. 192 (4), 467-479 (1978).
- Calle, E. A., et al. Fate of distal lung epithelium cultured in a decellularized lung extracellular matrix. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1916-1928 (2015).
- Dobbs, L. G., Gonzalez, R., Williams, M. C. An improved method for isolating type II cells in high yield and purity. American Review of Respiratory Disease. 134 (1), 141-145 (1986).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. American Journal of Physiology. 258, 134-147 (1990).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Dobbs, L. G., Pian, M. S., Maglio, M., Dumars, S., Allen, L. Maintenance of the differentiated type II cell phenotype by culture with an apical air surface. The American Journal of Physiology. 273 (2), 347-354 (1997).
- Bruce, M. C., Honaker, C. E. Transcriptional regulation of tropoelastin expression in rat lung fibroblasts: changes with age and hyperoxia. American Journal of Physiology. 274 (6), 940-950 (1998).
- Berk, J. L., Franzblau, C., Goldstein, R. H. Recombinant interleukin-1 beta inhibits elastin formation by a neonatal rat lung fibroblast subtype. Journal of Biological Chemistry. 266 (5), 3192-3197 (1991).
- Schultz, C. J., Torres, E., Londos, C., Torday, J. S. Role of adipocyte differentiation-related protein in surfactant phospholipid synthesis by type II cells. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 283 (2), 288-296 (2002).
- Maksvytis, H. J., et al. In vitro characteristics of the lipid-filled interstitial cell associated with postnatal lung growth: evidence for fibroblast heterogeneity. Journal of Cellular Physiology. 118, 113-123 (1984).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
- Le, A. V., et al. Efficient and Functional Endothelial Repopulation of Whole Lung Organ Scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (9), 2000-2010 (2017).
- Ren, X., et al. Engineering pulmonary vasculature in decellularized rat and human lungs. Nature Biotechnology. 33 (10), 1097-1102 (2015).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Alysandratos, K. D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636 (2021).
