Summary
細菌は、生理活性のある生体分子を運ぶナノメートルサイズの細胞外小胞(EV)を分泌します。EVの研究は、それらの生合成、微生物-微生物および宿主-微生物の相互作用および疾患における役割、ならびにそれらの潜在的な治療用途を理解することに焦点を当てています。EV研究の標準化を促進するために、さまざまな細菌からEVをスケーラブルに分離するためのワークフローが提示されます。
Abstract
多様な細菌種は、脂質、タンパク質、核酸、糖鎖、および親細胞に由来する他の分子からなる細胞外小胞(EV)を~20~300nm分泌します。EVは、種内および種間のコミュニケーションベクトルとして機能すると同時に、感染とコロニー形成の文脈における細菌と宿主生物の間の相互作用にも貢献します。健康と病気におけるEVに起因する多数の機能を考えると、 in vitro および in vivo 研究のためにEVを分離することへの関心が高まっています。物理的特性、すなわちサイズに基づいてEVを分離することで、多様な細菌培養物からの小胞の分離が容易になるという仮説が立てられました。
単離ワークフローは、細菌培養物からEVを単離するための遠心分離、ろ過、限外ろ過、およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で構成されています。ポンプ駆動のタンジェンシャルフローろ過(TFF)ステップが組み込まれ、スケーラビリティが向上し、数リットルの開始細胞培養から材料を分離できるようになりました。大腸 菌 をモデル系として、EV関連ナノルシフェラーゼおよび非EV関連mCherryをレポータータンパク質として発現させた。ナノルシフェラーゼは、そのN末端をサイトリシンAと融合させることによってEVを標的としました。関連するサイトライシンA-nanoLucを有する20〜100 nm EVを含む初期のクロマトグラフィー画分は、遊離タンパク質を含む後の画分とは異なっていました。EV関連ナノルシフェラーゼの存在は、免疫金標識および透過型電子顕微鏡によって確認された。このEV分離ワークフローは、他のヒト腸関連グラム陰性菌種およびグラム陽性菌種に適用できます。結論として、遠心分離、ろ過、限外ろ過/ TFF、およびSECを組み合わせることで、多様な細菌種からEVをスケーラブルに分離できます。標準化された分離ワークフローを採用することで、種を超えた微生物EVの比較研究が容易になります。
Introduction
細胞外小胞(EV)は、脂質、タンパク質、糖鎖、核酸で構成されるナノメートルサイズのリポソーム様構造であり、原核細胞と真核細胞の両方から分泌されます1。グラム陰性菌2からのEVの放出を視覚化する初期の研究以来、細菌のEVに起因する生物学的機能の数(直径20〜300 nm)は過去数十年で絶えず増加しています。それらの機能には、抗生物質耐性の転移3、バイオフィルム形成4、クオラムセンシング5、および毒素送達6が含まれます。また、細菌性EVを治療薬として使用すること、特にワクチン学7 とがん治療8への関心も高まっています。
EV研究への関心が高まっているにもかかわらず、隔離方法に関する技術的な課題がまだあります。具体的には、再現性があり、スケーラブルで、多様なEV産生生物に適合する分離法が求められています。EVの分離と研究方法を計画および報告するための統一された一連の原則を作成するために、国際細胞外小胞学会はMISEVポジションペーパー9を発行および更新します。さらに、EV-TRACKコンソーシアムは、透明性を高めるために、公開された原稿で使用されているEV分離の詳細な方法論を報告するためのオープンプラットフォームを提供します10。
このプロトコルでは、哺乳類細胞培養物からのEVの単離に使用された以前の方法論が、細菌細胞培養物からのEVの単離を可能にするために適応されました11,12。私たちは、スケーラブルなさまざまな微生物からEVを分離し、EVの純度と収量のバランスをとる方法を採用することを目指しました(MISEVポジションペーパー9で説明されています)。遠心分離とろ過によって細菌の細胞や破片を除去した後、培養液は遠心装置限外ろ過(最大~100 mLの容量の場合)またはポンプ駆動のTFF(大容量の場合)のいずれかによって濃縮されます。その後、EVは、小型EVの精製に最適化されたカラムを使用してSECによって分離されます。
図1:細菌EV分離ワークフローの概略図。 略語:EV =細胞外小胞;TFF =タンジェンシャルフローろ過;SEC = サイズ排除クロマトグラフィー;MWCO =分子量カットオフ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Escherichia coliのマウス共生株(すなわち、大腸菌MP113)をモデル生物として使用し、以前に報告されているように、細胞ライシンAへの融合によってEV関連ナノルシフェラーゼを発現するように改変した14。ここで使用される方法は、少なくとも最大数リットルの細菌培養を処理し、EV関連タンパク質と非EV関連タンパク質を効果的に分離することができる。最後に、この方法は、他のグラム陽性菌種およびグラム陰性菌種にも使用することができる。報告された実験のすべての関連データは、EV-TRACKナレッジベース(EV-TRACK ID:EV210211)10に提出されました。
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Protocol
注:細菌と組換えDNAを含むすべての作業が、各株のバイオセーフティハザードレベルに適したバイオセーフティ封じ込めのベストプラクティスに従っていることを確認してください。作業は、地域、国内、および国際的なバイオセーフティ規制に従って行う必要があります。
1. 菌株と培養条件
注:この研究で使用された細菌株は、大腸菌MP113、アッカーマンシア・ムシノフィラ、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、およびビフィドバクテリウム・デンチウムでした。
- 大腸菌の場合、滅菌ループを使用して単一コロニーを250〜1,000 mLのLuria-Bertani(LB)ブロスに接種し、振とうインキュベーター内で300 rpmおよび37°Cで48時間インキュベートしてから培養を処理します。p114-mCherry-Clyluc(補足方法および補足図S1)を保持する組換え大腸菌MP1株の場合、クロラムフェニコールをLB寒天培地およびブロスに最終濃度17 μg/mLで添加します。
- A.ムシノフィラ、B.セタイオタオミクロン、B.ブレーブ、およびB.デンチウムの場合、脳心臓注入(BHI)寒天プレートにストリークし、ビニール嫌気チャンバー内で嫌気的にインキュベートします。単一コロニーを100 mLの予め還元したBHIブロスに接種し、嫌気的に48時間インキュベートします。
2. EVアイソレーション
- 遠心分離とろ過による細菌培養培地の清澄化
- ステップ1で接種した菌体培養物を、注ぎ込んで250 mLまたは500 mLのポリプロピレン製遠心分離機ボトルに移します。大容量の固定角度ローターでボトルを4°C、5,000 × g で15分間遠心分離します。上清を慎重に注いで洗浄した遠心分離機ボトルに移し、再び10,000 × g で15分間遠心分離します。
注意: バイオセーフティー適切な洗浄と除染の後、ボトルを再利用してください。- 2回目の遠心分離後に細菌細胞の大きなペレットが存在する場合は、清潔なボトルで遠心分離を繰り返して細胞をさらに除去します。
- 上清を注いで適切なサイズの0.22 μmポリエーテルスルホン真空駆動フィルター装置に移します。ろ過装置を真空壁供給に接続してろ過します。ろ過速度が大幅に低下した場合は、ろ過されていない材料を新しいデバイスに移動するだけです。ろ過した培地を4°Cで一晩保存し、必要に応じて翌日もプロトコルを継続します。
注:上記の遠心分離では、通常、各デバイスを介して、示された量の~2倍の細胞培養を処理できます。例えば、1台の500 mLフィルター装置で、~1,000 mLの遠心分離前の培養物をろ過できます。通常、これらのデバイスは再利用されません。このステップでシリンジフィルターを使用することは、テストされたモデルで大きな損失が認められたため、最適化なしでは推奨されません。これは潜在的な停止点です。 - この時点で、ろ過した上清のアリコートを適切な寒天プレートに広げて生細胞が完全に除去されていることを確認し、細菌株に最適な条件でインキュベーションした後にコロニーがないことを確認します。細菌が検出された場合は、追加の遠心分離および/またはろ過を実行して、上記の手順をさらに最適化します。
- ステップ1で接種した菌体培養物を、注ぎ込んで250 mLまたは500 mLのポリプロピレン製遠心分離機ボトルに移します。大容量の固定角度ローターでボトルを4°C、5,000 × g で15分間遠心分離します。上清を慎重に注いで洗浄した遠心分離機ボトルに移し、再び10,000 × g で15分間遠心分離します。
- ろ過媒体の濃度
- 100 mL >容量で作業する場合は、手順 2.2.2 に進みます。 ~100 mLの容量で作業する場合は、血清学的ピペットを使用して、ろ過した培養液90 mLをそれぞれの容量100 kDa分子量カットオフ(MWCO)遠心限外ろ過装置のリザーバーにロードします。常に一致する限外ろ過装置とバランスを取り、上部のリザーバー内の培地の体積が<0.5 mLに濃縮されるまで、4°Cおよび2,000 × g のスイングバケットローターで15〜30分間隔で遠心分離します。
- 残りのろ過された培養培地をリザーバーに補充します。「補充」する場合は、デバイスの下部にあるフロースルーを取り外し、デバイスのバランスを取り直します。
注:これらのデバイスを使用して濃縮できるろ過された培養液の最大容量は、推奨容量の<2倍であることが観察されました。 - リザーバー内の濃縮培地の粘度が目に見えて上昇した場合(暗くて粘性のある物質)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、遠心分離によって再濃縮して、MWCOの100 kDa未満の非EVタンパク質を希釈します。
注: これは潜在的な停止点です。 - 濃縮培地を低タンパク質結合チューブに移し、4°Cで一晩保存し、必要に応じて翌日もプロトコールを継続します。
- 残りのろ過された培養培地をリザーバーに補充します。「補充」する場合は、デバイスの下部にあるフロースルーを取り外し、デバイスのバランスを取り直します。
- 100 mL>容量を扱う場合は、処理する容量に合わせて適切なサイズのTFFデバイス(100 kDa MWCO)を選択してください。
注:100mLから>1,000mLを処理するためのろ過装置は市販されています。現地での入手可能性、コスト、ポンプおよびチューブ/接続との互換性によって、どの特定のモデルが最も役立つかが決まります。フィルターを洗浄する前に、 材料表 に示されているデバイスで最大2 Lの培地を処理しました(洗浄プロトコルについては、以下のステップ2.3を参照してください)。- 補足図S16に示すように、#8低結合/低浸出チューブ、1/8インチのホースバーブからルアーアダプター、TFFデバイス、および蠕動ポンプを使用してろ過回路を組み立てます。
注意: バイオセーフティキャビネット内でTFFを実行して、EVの準備を環境細菌で汚染するリスクを最小限に抑えます。 - 室温で、ろ過および調整された培地を約200 mL /分(最小100 mL /分)で循環し始めます。200 mLのPBSをメス容器にポンプで送り、目的の流量に対応する適切なRPMを決定します。ろ過された馴化培地を循環させる場合、限外ろ過膜を通過する分子<100 kDaを別の容器に廃棄物として収集します。
注:以下の例は、2 Lの培養の開始量を想定しています。 - その容量が~100-200mLに減少するまで、馴化培地を循環させ続けます。必要に応じて小型船に移動します。PBSで2倍に希釈し、ポンプで循環を続け、75〜100 mLまで濃縮します。PBSで2倍に希釈し、最終容量25 mLまで循環させ続けます。PBSで2倍に希釈し、<10mLまで循環を続けます。
- フィードチューブをサンプルリザーバーから持ち上げ、ポンプを続けてフィルターをパージし、最大量のサンプルを回収します。
注: これは潜在的な停止点です。 - 濃縮したサンプルをコニカルチューブに移し、必要に応じて4°Cで一晩保存します。または、プロトコルを続行します。
- 濃縮サンプルを容量15 mLの100 kDa MWCO遠心限外ろ過装置に移します。上部リザーバー内の培地の体積が<2 mLに濃縮されるまで、4°Cおよび2,000 × g のスイングバケットローターで15〜30分間隔で遠心分離します。
注: これは潜在的な停止点です。 - 濃縮培地を低タンパク質結合チューブに移し、4°Cで一晩保存し、必要に応じて翌日プロトコールを継続します。
- 補足図S16に示すように、#8低結合/低浸出チューブ、1/8インチのホースバーブからルアーアダプター、TFFデバイス、および蠕動ポンプを使用してろ過回路を組み立てます。
- 100 mL >容量で作業する場合は、手順 2.2.2 に進みます。 ~100 mLの容量で作業する場合は、血清学的ピペットを使用して、ろ過した培養液90 mLをそれぞれの容量100 kDa分子量カットオフ(MWCO)遠心限外ろ過装置のリザーバーにロードします。常に一致する限外ろ過装置とバランスを取り、上部のリザーバー内の培地の体積が<0.5 mLに濃縮されるまで、4°Cおよび2,000 × g のスイングバケットローターで15〜30分間隔で遠心分離します。
- TFF デバイスのクリーニング (オプション)
注意: TFFデバイスがプロセス中に「詰まり」始めると、ろ過速度が低下します(ファウリング)。必要に応じて、フィルター装置を洗浄して、同じ精製ランで追加のサンプルのろ過を容易にすることができます。理論的には可能ですが、相互汚染を避けるために、洗浄されたTFFフィルターは別の精製実行には使用されていません。- 清掃するには、TFFデバイスからすべてのチューブとキャップを取り外し、残っている液体をすべて排出します。
- 蠕動ポンプとチューブを使用して、TFFデバイスの内側と外側の両方のコンパートメントを( つまり、材料の表にリストされているモデルの平行ポートと垂直ポートを介して)、~100 mLの蒸留水でフラッディングします。すべてのチューブ/キャップを取り外し、TFFデバイスを排水します。
- 外側(垂直、ろ液)ポートにキャップをし、250 mLの20%エタノールを蒸留水に>200 mL / minで内側のコンパートメントから10分間循環させます。排水し、蒸留水で溢れさせ、上記のように再び排水します。
- 250 mLの0.5 Nの新鮮なNaOH溶液を内部コンパートメントに30分間循環させ、再度排水します。
- 補足図S2のように、すべてのチューブとキャップを入口、出口、およびろ液ポートに再接続し、1 mL / cm 2のNaOH>1 mL / cm2の体積がフィルター膜を透過し、ろ液/廃棄物として収集されるまで、0.5 N NaOH溶液を再度循環させます。
- 上記のようにTFFデバイスを蒸留水ですすいでください。TFFデバイスをすぐに使用するか、~100 mLの20%エタノールをデバイスにフラッディングし、4°Cで一晩保存します。
注意: エタノールで保管する場合は、必ず排水し、水ですすぎ、排水し、> mL/ cm 2 のフィルター表面積の容量がフィルター膜を透過し、ろ液/廃棄物として収集されるまで、デバイスを通して250 mLのPBSを循環させ、サンプル処理の前に残留エタノールを除去してください。
- サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
注:SECは、EVの純度を高め、非小胞タンパク質を除去するために使用されます。- <100 mL の出発物質から EV を単離するには小さな SEC カラム(10 mL 床容量)、>100 mL の出発物質から EV を単離するには大きなカラム(47 mL のベッド容量)を使用します。
注: 次の例では、大きい列のボリュームがリストされ、小さい列のボリュームが括弧内に一覧表示されます。 - SECカラムとPBSを数時間かけて室温に戻します。標準のラボスタンドとホルダーを使用して、SECカラムを垂直位置に安定させます。あるいは、市販のクロマトグラフィーカラムスタンドを使用してください。
- SECカラムに接続する前に、5 mLのPBSをフリットを通って廃棄物容器に流して、サンプルリザーバーを水和します。SECカラムのインレットキャップを外し、サンプルリザーバーに2 mLのPBSを加え、PBSがフリットから滴り落ちるので、リザーバーをカラムに慎重に接続します(小さなSECカラムには適用されません)。
メモ: この前の手順により、気泡が SEC 列の上部に閉じ込められるのを防ぎます。空気が閉じ込められている場合は、リザーバーを取り外し、カラムをタップして気泡を取り除き、接続手順を繰り返します。小さいカラムの場合は、SECカラムの上部のキャップを外し、サンプルホッパーを取り付けるだけです。 - 47 mL(10 mL)のPBSをサンプルリザーバーに加え、SECカラムの下部のキャップを外します。ロードされたすべてのサンプルバッファーを平衡化のためにカラムに流します。フロースルーを破棄します。
- 最大2 mL(0.5 mL)のサンプルをサンプルリザーバーにロードし、フロースルーを破棄して、サンプルがカラムに完全に入るようにします。
- すぐにPBSをサンプルリザーバーまたはホッパーに14.25 mLからサンプル容量を引いた容量(小カラムの場合は3 mLからサンプル容量を引いたもの)で追加します。溶液がカラムを流れるのを待ち、カラムのボイド体積に等しいこの量を廃棄します。
注:通常の2 mLサンプルの場合、サンプルリザーバーまたはホッパーに追加するPBSの量は12.25 mLになります。 - 2 mL 低結合マイクロチューブを SEC カラムのすぐ下に配置します。すぐに2 mL(0.5 mL)のPBSをサンプルリザーバーに加え、カラムに入れます。この最初の2 mL(0.5 mL)のフロースルーを フラクション1としてラベル付けします。サンプルリザーバーに一度に2 mL(0.5 mL)を追加し続け、後続の各フラクションを収集します。
注:ほとんどの細菌性EVは最初の5つの画分で溶出します。最適化中に、最初の12個のフラクションが収集されました。 - フラクションは、短期保存(日)の場合は4°C、長期保存の場合は-80°Cで保存します。
- 再利用可能なSECカラムの洗浄と保管
注:このプロトコルで説明されているSECカラムは、製造元に応じて最大5回再利用できます。SECカラムの流速が<5回の使用後に減少した場合、メーカーは、SECの前に凝集物を除去するために、濃縮サンプルを10,000 x gで10分間遠心分離することを推奨しています。次に、この遠心分離の上清をSECカラムにロードしてEVを分離します。- 使用するたびにSECカラムを洗浄して保管するには、0.5 M NaOHを2 mL(0.5 mL)加え、カラムに完全に浸します。100 mL(20 mL)の20%エタノールをカラムに通し、次の使用まで4°Cで保存します。次の使用の前に、上記のようにエタノールを室温に平衡化し、さらに150 mL(30 mL)のPBSをカラムに通してPBSバッファーと交換します。
- SECカラムを洗浄し、使用するたびにすぐに再利用するには、2 mL(0.5 mL)の0.5 M NaOHを加え、カラムに完全に浸します。約150 mL(30 mL)のPBSバッファーを実行して、NaOHを洗い流します。溶出液のpHがPBS(~7)に等しい場合、新しいサンプルをロードすることができます。
- <100 mL の出発物質から EV を単離するには小さな SEC カラム(10 mL 床容量)、>100 mL の出発物質から EV を単離するには大きなカラム(47 mL のベッド容量)を使用します。
3. EV準備の品質管理
- 無菌試験
注:これらのEVは細菌培養物に由来するため、下流で使用する前に無菌性を確保することが重要です。- アッセイに使用する画分を100 μL(20 μL)取得し、ソース細菌の増殖に使用する培地3 mLを接種します。それぞれの最適条件下で少なくとも3日間培養し、濁度を観察します。あるいは、生産細菌を増殖させ、コロニー形成を探すために使用される培地を含む寒天プレートに画分サンプルを適用します。
注意: 細菌汚染が検出された場合、実験にEV製剤を使用することはお勧めしません。代わりに、(a)コンディショニングされた細菌細胞培養培地の十分な遠心分離/ろ過を行い、(b)清潔なボトル、チューブ、フィルター、クロマトグラフィーカラムを使用し、(c)適切な無菌技術を採用することにより、細菌汚染のリスクを最小限に抑えるように注意しながら、分離を繰り返します。
- アッセイに使用する画分を100 μL(20 μL)取得し、ソース細菌の増殖に使用する培地3 mLを接種します。それぞれの最適条件下で少なくとも3日間培養し、濁度を観察します。あるいは、生産細菌を増殖させ、コロニー形成を探すために使用される培地を含む寒天プレートに画分サンプルを適用します。
- タンパク質定量
注:高感度の蛍光ベースのタンパク質定量キットを使用しました( 材料の表を参照)。このキットは、485/590nmの励起/発光波長で対応する独自の蛍光計で動作します。- すべての試薬、標準物質、およびサンプルを室温に戻します。
- アッセイするサンプルおよび標準物質ごとに1 μLの試薬を199 μLのバッファーに加えることにより、タンパク質試薬とバッファーのマスターミックスを調製します。薄肉の0.5 mL PCRチューブを使用して、10 μLのスタンダード + 190 μLのマスターミックスを各標準チューブに加えます。
注:アッセイの範囲内にあるように、各サンプルチューブに添加される各画分の量は、精製の予想されるタンパク質収率に依存します。典型的には、各画分5μL+マスターミックス195μLを使用した。サンプル+マスターミックスの最終容量は200μLでなければなりません。 - アッセイチューブをボルテックスし、暗所で室温で少なくとも15分間インキュベートします。
- 適切な独自の蛍光計( 材料の表を参照)で標準を測定するには、矢印ボタンを使用して タンパク質アッセイ オプションを選択し、 GO ボタンを押して確認します。画面の指示に従って、各標準チューブを挿入し、 GOを押します。
- 実験用サンプルチューブを挿入します。 GO を押して読み取ります。表示された結果(アッセイバッファー/サンプル混合物中の実際のタンパク質濃度)に注意してください。サンプル中のタンパク質濃度を取得するには、矢印キーを使用してサンプル 濃度の計算 オプションを選択し、 GOを押して、矢印キーを使用して、特定のサンプルのアッセイバッファーに追加する サンプル量 を選択します。 GO を押して、サンプルタンパク質濃度を記録します。分析するサンプルごとにこの手順を繰り返します。
- 粒子計数とサイズ分布
注:マイクロフルイディクス抵抗パルスセンシング(MRPS)を使用して、EVの濃度とサイズ分布を定量化しました。- 0.02 μmシリンジフィルターでろ過した1%Tween-20を添加したPBSでサンプルを約0.1 μg/mLのタンパク質濃度に希釈します。
注:希釈の目標は、EV含有画分で1010 粒子/ mLの範囲で予想される粒子濃度に到達することです。最適な希釈は経験的に決定する必要があるかもしれません。後のフラクション(フラクション6以降)にはEVがほとんど期待されていません。したがって、粒子濃度は、低希釈で分析しても<10 10 粒子/ mLになる可能性があります。 - 各サンプル3 μLをマイクロピペットで使い捨てマイクロフルイディクスカートリッジに入れ、カートリッジをMRPS装置に挿入し、青色に照らされたリムの金属ボタンを押します。
- 取得ソフトウェアの [Go!] をクリックし、サンプルが装置によって分析されるのを待ちます。1,000〜10,000の粒子イベントを取得して、分析の技術的な統計誤差を最小限に抑えます。この時点で、[ 実行の停止 と 終了 ] をクリックして、サンプルの取得を完了します。
注:生データファイルとともに、機器はサンプル中の粒子濃度をリストした要約スプレッドシートを出力します。サンプル希釈に応じてこの値を修正してください。 - 分析ソフトウェアを使用して、生データをロードし、サイズ分布のカスタマイズされたグラフを生成します。
- 0.02 μmシリンジフィルターでろ過した1%Tween-20を添加したPBSでサンプルを約0.1 μg/mLのタンパク質濃度に希釈します。
4. EVストレージ
- 個々の画分またはプールされた画分を、低タンパク質結合チューブ内の個々の画分サイズの25〜50%(使用するカラムのサイズによって異なります)に分注し、凍結融解サイクルを回避するために-80°Cで保存します。
注:異なるアプリケーションでは、各実験で使用される予想される量に応じて、より小さなまたはより大きなアリコートが必要になる場合があります。これは経験的に決定する必要があります。EV非含有画分は、研究目的に該当しない場合は廃棄することができます。
5. 透過型電子顕微鏡
- ネガティブ染色
- 5 μLのEVサンプルを炭素被覆銅400メッシュグリッドに加え、室温で10分間インキュベートします。試料側を5滴の5 mM Tris緩衝液(pH 7.1)で洗浄し、次に5滴の蒸留水で洗浄します。
- 標本側を5滴の2%酢酸ウラニルで染色します。ろ紙で余分な汚れを拭き取り、グリッドを数時間または一晩完全に乾かします。80 kVで操作した電子顕微鏡で試料を可視化します。
- イムノゴールドラベリング
- 10 μLのEV懸濁液をホルムバー/カーボン400メッシュグリッドに塗布し、室温で1時間インキュベートします。PBSでグリッドを3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを10分間塗布してサンプルを固定します。グリッドをPBSで5回洗浄します。
- 0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSを3回洗浄してグリッドをブロックします。次に、10 μLの一次抗体を室温で40分間塗布します(ここでは、1 μg/mLのnluc抗体)。0.1%BSAを含むPBSで再度3回洗浄します。
- 10 μLの二次金標識抗体をグリッドに加え、室温で40分間インキュベートします。グリッドをPBSで3回洗浄します。
注:ここでは、ブロッキングバッファーで1:10に希釈した後、10 nmの金ナノ粒子を結合させたヤギ抗マウス抗体を使用しました。金標識によってEVの可視化が不明瞭になる場合は、代わりに、より小さな金ナノ粒子(5 nmなど)の二次抗体を使用できます。 - グリッドを10 μLの2.5%グルタルアルデヒドで室温で10分間ポストフィックスします。PBSで3回洗ってください。2%酢酸ウラニル(10 μL)で15分間陰性染色を行います。サンプルを10 μLの0.5%酢酸ウラニルおよび0.13%メチルセルロース溶液に10分間埋め込みます。
- 電子顕微鏡でイメージングする前に、サンプルグリッドを室温で一晩乾燥させます。
- 顕微鏡取得ソフトウェアで、画像の最適な品質(たとえば、この特定のセットアップでは0.80851秒)を取得するために経験的に露出を決定し、 この値を露光時間 オプションボックスに入力して調整します。 80 kV オプションを選択し、[ 取り込みを開始] をクリックして画像をキャプチャします。
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Representative Results
どのSECクロマトグラフィー画分がEV用に濃縮されているかを評価するために、SECカラムにTFFによって1,000倍濃縮された2 mLの 大腸菌 MP1馴化培養液をロードし、順次画分を収集しました。MRPSを使用すると、フラクション1〜6に最も多くのEVが含まれていることがわかりました(図2A)。その後の画分にはEVがほとんど含まれておらず、EVフリーのタンパク質の代わりに含まれていました(図2B)。EVは主に直径<100nmでした(図2C)。TEMは、特にフラクション2〜6でEV濃縮とサイズを確認しました(図2D)。
この方法がEVを非EV関連タンパク質から分離できることをさらに確実にするために、細胞ライシンA-ナノルシフェラーゼ融合タンパク質および遊離(非融合)mCherryを発現する 大腸菌 MP1の組換え株が生成された(図 3Aに図式化)。サイトライシンA融合タンパク質は、 大腸菌 EVと会合することが以前に示されました14。mCherry蛍光をモニターするために、各クロマトグラフィー画分から100 μLのアリコートを96ウェルプレートのウェルに移しました。それらの蛍光は、吸収波長および発光波長としてそれぞれ580nmおよび620nmを用いてマイクロプレートリーダーで測定された。
同様に、発光測定のために、各画分の20μLアリコートを等量のルシフェラーゼアッセイ溶液と384ウェルプレート中で混合し、15分間インキュベートし、可視光発光を測定した。EV濃縮画分(画分2〜7)は、後の画分に匹敵する高いナノルシフェラーゼ活性を有するが、非EV関連mCherryからの蛍光シグナルは非常に低いことが観察された(図3B)。同量の陰性対照EV(ナノルシフェラーゼ発現を欠く一致した細菌株から単離された)からのバックグラウンドシグナルは、EV画分で>1,000倍低かった。ポジティブコントロール(ナノルシフェラーゼ発現細菌細胞ペレット)からのシグナルは、EV画分(図示せず)からのシグナルよりも約1,000倍高かった。後者は、分析された細胞またはEVをそれぞれ生成する細胞培養材料の初期量に対して正規化された。ナノルシフェラーゼのEV会合は、イムノゴールド標識(図3C)によって画分2〜5で確認され、単離された小さな~20 nmのEV内の標識を観察しました。
最後に、このプロトコルの他の細菌種への適用性を評価するために、BHI培養培地で調製したA. ムシノフィラ、B.テタイオタオミクロン、 B.ブレーブ、および B.デンチウム の多様な嫌気性細菌の~100 mL培養物からEVを単離しました。対照として、EVを新鮮なBHI培養培地から単離した。EVの収量は種によって異なりますが、初期のクロマトグラフィー画分1〜4がEVに富んでいることが再び観察されました(図4A)。複雑なBHI培地には、これらの調製物における総EV収率の<25%ではあるが、EVサイズの粒子も含まれていた(図4A、黒いバー)。これらの細菌のEVは、主に<100 nmのサイズであることもわかりました(図4B)。
図2:初期のクロマトグラフィー画分における代表的な 大腸菌 MP1 EV溶出。 (a)連続2mLクロマトグラフィー画分におけるMRPSによる粒子数。SECインプットは、2mLに濃縮された2Lの細菌培養上清であった。実線は平均を表します。網掛け領域はSEMを示す。 (B)各画分中のタンパク質濃度。(C)MRPSで測定したフラクション3EVのサイズ分布。実線は平均を表します。影付きの領域は95%CIを表します。この装置は、50 nm<粒子を定量できないことに注意してください。(D)連続した、プールされたクロマトグラフィー画分および新鮮な培養液(コントロール)の透過型電子顕微鏡写真。すべての画像は同じスケール(100 nm)で撮影されました。広視野TEM画像を 補足図S3に示す。略語:EV =細胞外小胞;MRPS = マイクロフルイディクス抵抗パルスセンシング;SEC = サイズ排除クロマトグラフィー;SEM = 平均の標準誤差CI = 信頼区間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:SECによるEVフリータンパク質からの 大腸菌 MP1EVの分離。 (A)細胞質に組換えmCherry(赤)を発現する 大腸菌 MP1とペリプラズム輸送細胞リシンA-ナノルシフェラーゼ融合タンパク質(黄色のダイヤモンド)の模式図。(B)ナノルシフェラーゼ生物発光活性およびmCherry蛍光を、順次溶出クロマトグラフィー画分においてモニターした。縦の点線は、 図2の分析に基づくEV濃縮画分の限界を表しています。(c)EV画分(F2-5)を抗ナノルシフェラーゼ抗体で染色した後に免疫金標識した。シアンの矢印は、小型EVと共局在する金結合二次抗体を示しています。野生型 大腸菌 MP1由来の対照EVは、無視できるほどの非特異的染色であった。両方の画像は同じスケール(100 nm)で撮影されました。広視野TEM画像を 補足図S4に示す。略語:EV =細胞外小胞;SEC = サイズ排除クロマトグラフィー;F =分数;TEM = 透過型電子顕微鏡;ClyA-nLuc = 細胞ライシンA-ナノルシフェラーゼ融合タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:多様な細菌種からのEVの分離。 示された種を嫌気条件下でBHI培地中で48時間培養した。EVは限外ろ過+秒によって単離された(A)MRPSによって測定された最初の4つのSEC画分におけるEV濃度。SEM±平均。 黒いバーは、新鮮なBHI培地(コントロール)のバッチで検出された粒子を表します。(B)フラクション2のEVの寸法分布。略語:EV =細胞外小胞;MRPS = マイクロフルイディクス抵抗パルスセンシング;SEC = サイズ排除クロマトグラフィー;BHI =脳の心臓注入。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:p114-mCherry-Clylucプラスミド。 (A)p114-mCherry-Clylucプラスミドのマップ。(B)J23114-mCherry-clyA-nluc領域の配列。バイオレット、J23114プロモーター;ピンク、 mCherry 遺伝子;灰色、 clyA 遺伝子;緑、リンカー配列;オレンジ、 nLuc 遺伝子。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:タンジェンシャルフローフィルトレーション(TFF)セットアップ回路図。 図に示すように、バーブホース付きのチューブをTFFデバイスに接続しました。フィードフローチューブは、ろ過され、調整された培地容器に沈められて始まり、蠕動ポンプを通って続き、TFFデバイスの入口ポートに接続します。リターンフローは、TFFデバイスの出口ポートから始まり、ろ過され、調整された培養培地の表面上で終わります。オプションで、背圧クランプ(スクリューナット+ボルトまたは単純なペーパークランプなど)を使用して、ろ過速度を上げることができます。ポンプが調整された媒体を循環させると、TFF装置内に発生した圧力により、限外ろ過が行われ、ろ液/廃棄物フローチューブを介して成分<100 kDaが除去され、廃棄のために別の容器(マゼンタ)に収集できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:広視野透過型電子顕微鏡写真。 連続した、プールされたクロマトグラフィー画分および新鮮な培養培地(コントロール)のTEM画像を 図2Dに示す。画像は、 大腸菌 MP1細胞外小胞が初期のクロマトグラフィー画分で溶出することを示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S4: 図3Cの広視野TEM画像。 EV画分(F2-5)を抗ナノルシフェラーゼ抗体で染色した後、免疫金標識した。シアンの矢印は、小型EVと共局在する金結合二次抗体を示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足方法:p114-mCherryClylucを保有する組換え大腸菌MP1株用。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
上記のプロトコルでは、スケーラブルで、さまざまなグラム陰性/陽性および好気性/嫌気性細菌からEVを確実に分離する方法が説明されています。手順全体を通していくつかの潜在的な停止点がありますが、馴化細菌培養培地からEVを分離するのに48時間以上かかることは避けることをお勧めします。
まず、細菌を培養して馴化細菌培養培地を生成することからなる。培養時間を少なくとも48時間に増やし、最適な増殖培地を使用すると、EV収量を最大化するのに役立つことがわかりました。各細菌種は、これら2つのパラメータに関して最適化する必要がある可能性があります。細菌培養の量は、目的の用途に十分なEVを確実に分離するためにも重要です。インビ トロ 試験では、EVは通常、最低100 mLから単離されますが、 インビボ 試験では、EVは通常、>1 Lの培地から単離されます。ここでも、各細菌株のEV生産特性とダウンストリームアッセイに必要なEV量によって、最小開始培養量が決まります。
コンディショニングされた培地が利用可能になったら、細胞や大きな非EVデブリを除去する必要があります。遠心分離はこのプロセスの重要なステップであることがわかりました。上記のプロトコルに記載されているように、2つの増加 g力遠心分離が実施されました。時折、第2のスピンのペレットがコンパクトではないことが指摘された場合、追加の10,000× g の遠心分離が行われる。続いて、この上清の無菌濾過を0.22μmのフィルターを通して行う。不十分な遠心分離は、このろ過ステップの目詰まりとパフォーマンスの低下につながります。ろ過速度が大幅に低下した後も上清をろ過し続けると、フィルターの誤動作や親細菌によるEV製剤の汚染につながる可能性があることが指摘されました。フィルターの持続的な目詰まりに対する解決策は、上清を再遠心分離および/または再ろ過して、無菌性を確保することです。記載されている遠心分離および真空駆動ろ過ステップは、合計4 Lまでの細菌培養についてテストされました。EVアイソレーションのさらなるスケールアップには、変更が必要になる場合があります。たとえば、これらのステップは両方とも、孔径を0.22μmまで縮小する互換性のあるフィルターデバイスを使用したシーケンシャルポンプ駆動ろ過に置き換えることができます。ただし、これはまだテストされていません。
現在のプロトコルでは、細菌培養の開始量に応じて、2つのバリエーションが説明されています。容量<100 mLの場合は、遠心限外ろ過装置を使用して培地を濃縮します。MWCOはこれらのステップで重要です。哺乳類のEVの場合、以前は>300 kDaのMWCOが使用されていました11,12。しかし、これはおそらくサイズ分布が小さいために、細菌からのEV収率が非常に低かった。したがって、100 kDaのMWCOを使用することをお勧めします。より小さなMWCOも使用できますが、遠心分離時間が長くなり、分子量の小さな汚染物質の除去が少なくなり、サンプルの粘度が上昇します。また、100 kDa MWCOでさまざまなサイズの限外ろ過装置を用意することで、プロトコル全体でさまざまな開始量のサンプルを濃縮するのに役立ちます。
または、サンプルサイズが100 mL>大幅にある場合は、ポンプ駆動のTFFを使用してサンプルを濃縮します。ここでも、100 kDa MWCOを使用することが重要です。この方法では、大量の培地を半自動で処理することができます。出発培養量に適したサイズのTFFデバイスを入手することが重要です。使用されるデバイスは、メーカーによって最大200mLの材料を処理する定格です。約2Lまで処理することが可能であった。ただし、大容量を処理しようとするとろ過速度が大幅に低下し、追加の処理の前にプロセスを停止してデバイスを洗浄する必要がありました。したがって、各細菌培養の特性および出発物質の量によって、TFFデバイスの必要なサイズが決まります。さらに、達成可能なポンプ速度はTFFのもう一つの重要なパラメータです。~100 mL/minの低速では、ろ過を容易にするために、補足 図S2に示すようにクランプを使用してTFFデバイスの背圧を上げる必要があり、フィルターのファウリング率が増加しました。チューブは、適切な除染とオートクレーブ処理の後、最大2回再利用されました。
サンプルが濃縮されたら、SECカラムにロードしてEVを分離できます。小型EV絶縁用に最適化された商用カラムを使用しました。少量の出発サンプルにはローディング容量が0.5 mLのカラムを使用し、2 Lまでの大きな出発サンプルにはローディング容量が2 mLのカラムを使用します。開始培養>2 Lの処理には、より大きなカラムが必要になる可能性があります。EV最適化カラムのメーカーは現在、>100 mLの濃縮材料を受け入れることができるSECカラムを提供しています。
絶縁されたEVの特性評価にはさまざまな方法が使用されており、そのほとんどは広く利用可能です。正規化は、他の定量方法(MRPSなどの技術による粒子定量)では<50 nmの非常に小さなEVを検出できないことの影響を受けないため、ほとんどのアッセイのタンパク質濃度に基づいていました。MRPSやその他のナノ粒子定量技術は、異なる画分間のEVの相対定量に引き続き有用です。
MRPS定量の重要な側面の1つは、希釈レベルです。適切に希釈すると、機器は50 nm<粒子を定量化できないため、検出されるEVの頻度はほとんどの場合検出限界まで増加し続けるはずです。希釈が不十分な場合、機器のノイズが高くなり、ピーク>65 nmのアーチファクトベル型の曲線が生成されます(推奨されるC-300マイクロフルイディクスカートリッジを使用する場合)。サイズ頻度分布データ解析中に、適切な希釈にもかかわらず、50 nm(機器の検出の絶対限界)と60 nmの間の人工的なピークが依然として観察されることがあります。これは、MRPSによる正確な検出の限界を下回り、再び機器のノイズにつながる非常に小さな細菌EVがかなりの数存在することによる可能性があります( TEMの図2Dで視覚化されています)。この場合、観察された「ピーク」よりも小さいデータポイントを除外し、これが特定のサンプルの 定量の事実上 の下限になります。
このプロトコルに記載されているように、溶出クロマトグラフィー画分中のEV存在量、総タンパク質濃度、および非EVタンパク質の存在量の定量は、ユーザーがダウンストリームアッセイに使用する画分を決定するのに役立ちます。たとえば、プールされたフラクション7〜8で小型EVが検出されました(図2D)。しかし、それらの存在量は直前の画分よりも低く、総タンパク質濃度(図2B)は高かった。これは、画分7〜8がより多くの非EV関連タンパク質を含んでいることを示唆している可能性があり、したがって、特定のダウンストリームアプリケーションには望ましくない可能性があります。
要約すると、市販の材料に依存する汎用性の高いEV絶縁プロトコルについて説明します。広く使用されている超遠心分離ベースの方法と比較したこの方法論の重要性は、さまざまなユーザーが簡単に再現でき、非常にスケーラブルなステップを含むことです。これは、 in vivo 研究に十分な材料の生成を促進するために特に重要です。100 mLから2 Lの培養物からEVを単離するために使用されました。利用可能なTFFデバイスの広い範囲を考えると、このプロトコルは、いくつかの変更を加えることで、より大規模な精製に適応できる可能性があります。記載されている分離プロトコルは、主にEVの物理的特性、つまりそのサイズに基づいており、この研究で説明されているものを超える細菌種に適用できる可能性があります。
説明されているプロトコルの1つの制限は、代表的な結果に見られるように、小型EV、特に<100nmの絶縁に有利であることです。以前の報告では、より大きな細菌EVの存在も説明されています15,16。より大きな細菌のEVを単離するには、例えば、より大きなEV用に最適化されたSECカラムを使用して、上記のプロトコルを変更する必要がある場合があります。このようなSECカラムも市販されている。さらに、他のプロトコルは、より高いEV純度を達成できる可能性があります(たとえば、密度勾配超遠心分離または免疫分離)。しかしながら、これらの方法は、本研究で説明した方法のスループットおよびスケーラビリティを欠いている。将来、追加の精製ステップでこのプロトコルを変更すると、調製物の収率と純度がさらに向上する可能性があり、これは実験的および治療的用途にとって重要になる可能性があります。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
上記の研究は、NIH TL1 TR002549-03トレーニング助成金によってサポートされました。粒子サイズ分析装置へのアクセスを容易にしてくれたジョンC.ティルトン博士とザカリートロイヤー博士(ケースウエスタンリザーブ大学)に感謝します。Lew Brown(スペクトラダイン)は、粒度分布データの分析に関する技術支援を提供します。コーネル大学のデビッド・パットナム博士は、pClyA-GFPプラスミド14を提供しました。ペンシルベニア大学のマーク・グーリアン博士は、 大腸菌 MP113を提供してくれました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | 3430 | it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron microscopy sciences | 15700 | |
| 250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter | Beckman Coulter | 392077 | Allows Vivacell to fit in rotor |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 XPI centrifuge | Beckman Coulter | No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| Brain Heart infusion (BHI) broth | Himedia | M2101 | After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains. |
| C-300 microfluidics cartridge | Spectradyne | ||
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | ICN19032105 | |
| Electron microscope | FEI company | Tecnai G2 SpiritBT | |
| Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Dr. Mark Goulian (gift) | commensal bacteria derived from mouse gut | |
| Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter | ThermoFisher | 010-0151-05 | used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture |
| Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor | ThermoFisher | F12-6x500-LEX | fits 6 x 500 mL bottles |
| Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper | Electron microscopy sciences | FCF-400-CU | |
| Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) | Electron microscopy sciences | 16100 | |
| Hematin | ChemCruz | 207729B | Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as 1.2 mg/mL |
| Infinite M Nano+ Microplate reader | Tecan | This equibment was used to measure the mCherry fluorescence | |
| In-Fusion HD Cloning Plus | Takara | 638909 | For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors |
| JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Lauria Bertani (LB) broth, Miller | Difco | 244620 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | J.T. Baker | 2071-05 | It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer - special | HV-30800-08 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer - special | HV-30800-24 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm | Masterflex | HV-07555-00 | |
| Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor | Masterflex | EW-07514-10 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft | Cole Palmer | EW-06435-16 | low-binding/low-leaching tubing |
| Menadione (Vitamin K3) | MP | 102259 | Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL |
| MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK | Repligen | D04-E100-05-N | TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant |
| Nano-Glo Luciferase Assay System | Promega | N1110 | This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein |
| NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 | R&D Systems | MAB10026 | |
| nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument | Spectradyne | ||
| nCS1 Viewer | Spectradyne | Analysis software for particle size distribution | |
| OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482 | DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking |
| Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes | Eppendorf | 30108450 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0492 | DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning |
| qEV original, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 0.5 mL | |
| qEV rack | Izon | for use with the qEV-original SEC columns | |
| qEV-2, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 2 mL | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher | Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238) | |
| Qubit protein assay kit | ThermoFisher | Q33211 | Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C. |
| Sorvall Lynx 4000 centrifuge | ThermoFisher | 75006580 | |
| SpectraMax i3x Microplate reader | Molecular Devices | This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence | |
| Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) | MilliporeSigma | S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE |
One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size. |
| Uranyl acetate | Electron microscopy sciences | 22400 | |
| Vinyl anaerobic chamber | Coy Lab | ||
| Vivacell 100, 100,000 MWCO PES | Sartorius | VC1042 | |
| Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) | MilliporeSigma | WHA68093002 | to filter MRPS diluent |
References
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