Summary
Detaljerede mikrokirurgiske teknikker er demonstreret for at etablere en langsigtet jugular vene kanylering rotte model for sekventiel blodopsamling i samme dyr. Fysiologiske og hæmatologiske parametre er blevet overvåget i rottens genopretningsfase. Denne model er blevet anvendt til at studere farmakokinetik af oralt administreret polyphenol uden at fremkalde dyrestress.
Abstract
Blodprøveudtagning hos små forsøgsdyr er nødvendig for optimering af farmaceutisk bly, men kan forårsage stor skade og stress for forsøgsdyr, hvilket potentielt kan påvirke resultaterne. Den jugulære venekanylering (JVC) hos rotter er en meget udbredt model til gentagen blodopsamling, men kræver tilstrækkelig træning af kirurgiske færdigheder og dyrepleje. Denne artikel beskriver de mikrokirurgiske procedurer for etablering og vedligeholdelse af en permanent JVC-rottemodel med særligt fokus på placering og forsegling af jugularkanylen. Betydningen af at overvåge fysiologiske (f.eks. Kropsvægt, mad og vandindtag) og hæmatologiske parametre blev fremhævet med resultater præsenteret i 6 dage efter operationen under rottens genopretning. Lægemiddel-plasmakoncentration-tidsprofilen for oralt administreret naturlig phenoleellaginsyre blev bestemt i JVC-rottemodellen.
Introduction
Gentagen erhvervelse af blodprøver fra små forsøgsdyr, såsom gnavere, marsvin og kaniner, er et vigtigt aspekt for farmaceutisk blyoptimering og også for at reducere antallet af dyr, der anvendes i forskning 1,2. Pipelinen til udvikling af nye diagnostiske værktøjer og lægemiddelformuleringer (f.eks. vaccine) kræver adgang til forskellige mængder blod for at evaluere deres robusthed og ydeevne in vivo, såsom farmakokinetik (PK), toksicitet og følsomhed 3,4,5.
Laboratoriemetoden til indsamling af blodprøver er bredt klassificeret i to typer, kirurgisk og ikke-kirurgisk6. Den ikke-kirurgiske tilgang er relativt let at forstå for forskeren, som omfatter almindelige teknikker, såsom hjertepunktering, orbital sinuspunktering og blødning af saphenous og halevenen. Flere blodprøveudtagninger er mulige ved nogle ikke-kirurgiske metoder, men prøvevolumenet er lille og kan forårsage fysisk sår og psykisk stress for dyrene1. På den anden side er den kirurgiske tilgang et yndet alternativ til gentagen venipunktur, og det indebærer placering af en midlertidig eller permanent kanyle i blodkarrene hos dyr 7,8,9. Det store blodvolumen kunne gentagne gange trækkes tilbage gennem kanylen hos bevidste rotter, samtidig med at man undgik stress og smerte på grund af håndteringsteknikken, tilbageholdenhed og anæstesi 7,8,10,11. Kanyleimplantationen kræver dog en erfaren forsker med tilstrækkelig uddannelse for at kunne opsamle blodet med succes.
Blodopsamling gennem jugular vene kanylering (JVC) hos rotter er den mest anvendte metode til at studere stoffet PK 6,10,12,13. Alligevel kræver etableringen af JVC-rottemodellen omhyggelig praksis med mikrokirurgiske færdigheder og viden om postkirurgisk pleje og vedligeholdelse. Især efter operationen kræver rotten administration af smertestillende midler og tilstrækkelig restitutionstid til at nå stabil fysiologisk tilstand til yderligere forsøg 13,14,15. Selvom kropsvægtforøgelsen (dvs. >10 g) er en gyldig og almindeligt anvendt indikator for rottens genopretning, er det ikke ualmindeligt, at rotterne har uventet død postoperativt på grund af dehydrering, infektion og betændelse, hvilket kunne være subtilt at bemærke ved den tidlige begyndelse14,15. Derudover er kateterobstruktion i JVC-modellen fortsat et problem under blodopsamlingen.
Den nuværende protokol har i detaljer demonstreret de mikrokirurgiske procedurer for JVC i en bedøvet rotte med særligt fokus på identifikation, isolering og kanylering af jugular venen. Betydningen af fysiologisk og hæmatologisk overvågning af rotterne i genopretningsfasen fremhæves. Endelig blev serielle blodprøver indsamlet gennem det venøse kateter for at studere PK af den oralt administrerede naturlige phenolellaginsyre med dårlig biotilgængelighed (dvs. lav systemisk koncentration) for at verificere JVC-rottemodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedurer, der er beskrevet nedenfor, blev udført som en del af en protokol godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Northwestern Polytechnical University (nr. 202101117).
1. Præoperativ forberedelse (dagen før operationen)
BEMÆRK: Nødvendige opløsninger: normal saltvand (0,9% w/v natriumchlorid), hepariniseret saltvand (1% w/v heparinnatrium), kateterlåsopløsning, ikke-steroidt antiinflammatorisk lægemiddel (NSAID), såsom meloxicamopløsning (2 mg/ml).
- Forberedelse af opløsning
- Aliquot 200 μL færdigpakket kateterlåsopløsning i et 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Kateterlåsopløsning består af hepariniseret saltvand (0,4% v/v heparinnatrium) blandet med glycerol (v/v,1:1). - Bland 1 g heparinnatrium i 100 ml af det normale saltvand for at forberede 1% hepariniseret saltvand.
- Meloxicam opløses i normalt saltvand for at fremstille en koncentrationsopløsning på 2 mg/ml til postoperativ smertelindring.
BEMÆRK: Tilberedt hepariniseret saltvand og meloxicamopløsning filtreres gennem et 0,22 μm filter. Alle opløsningerne steriliseres og opbevares ved 4 °C til fremtidig brug.
- Aliquot 200 μL færdigpakket kateterlåsopløsning i et 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerør.
- Kirurgiske instrumenter og materialer
- Pak alle rene kirurgiske værktøjer i en pose og tape det med et stykke autoklaversteriliseringstape. Se figur 1A for de specifikke kirurgiske instrumenter, der anvendes.
- Autoklave den kirurgiske pose ved 121 °C i 30 minutter til næste dags brug.
- Tilberedning af dyr
- Før operationen skal du huse alle Sprague-Dawley-rotter (SD) hanrotter i standard Animal Room med kontrolleret temperatur ved 22 ± 1 °C. Foder dem med standard laboratorie mad og vand ad libitum i mindst 7 dage.
BEMÆRK: Både han- og hunrotter kan bruges til JVC-modellen, og deres typiske alder og kropsvægt varierer fra henholdsvis 9-14 uger og 294 ± 57 g. - Bedøve rotten med 3% -3,5% isofluran blandet med ilt i et præ-anæstesikammer. Bestem, om rotten bliver bevidstløs ved manglende reaktion på fodklemme.
- Tag forsigtigt rotten ud, læg rottens næse i et bedøvelsesnæsestykke, der leverer 2% -2,5% isofluran.
- I ventral og dorsal position skal du fjerne pelsen grundigt omkring højre skulder og bageste områder af halsen med hårfjerningscreme og en kæledyrsbarbermaskine. Returner rotten til buret for kirurgi, der skal udføres den næste dag.
- Før operationen skal du huse alle Sprague-Dawley-rotter (SD) hanrotter i standard Animal Room med kontrolleret temperatur ved 22 ± 1 °C. Foder dem med standard laboratorie mad og vand ad libitum i mindst 7 dage.
2. Før operationen på dagen
- Forbered den aseptiske arbejdsstation
- Spray 75% medicinsk alkohol for at desinficere operationsområdet, og læg derefter varmepuden dækket af en ren pude. Indstil LED-lampen med en kold lyskilde ved siden af arbejdsstationen.
- Forvarm de nødvendige opløsninger (trin 1.1) til stuetemperatur.
- Fyld 0,6 ml hepariniseret saltvand og 0,15 ml kateterlåsopløsning i henholdsvis to sterile 1,0 ml stumpspidsede sprøjter. Træk 2,5 ml af det normale saltvand ud ved hjælp af en steril 5,0 ml sprøjte.
- Blødgør bomuldskuglerne i 75% medicinsk alkohol. Klem overskydende ethanol ud før brug.
- Vej og registrer rottens kropsvægt.
3. Under operationen
- Kirurgisk forberedelse
- Brug den kirurgiske frakke, sterile handsker og ansigtsmaske. Åbn derefter den steriliserede kirurgiske pose, lad alle kirurgiske værktøjer være i 75% medicinsk alkohol, og tør dem inden brug.
- Jugular vene isolering
BEMÆRK: Den estimerede driftstid for denne del er 10 min.- Anetisere den operationsklare og barberede rotte med 3%-3,5% isofluran blandet med ilt i et induktionskammer og afgøre, om rotten bliver bevidstløs ved manglende reaktion på fodklemme.
- Placer rottens næse i næsestykket, der leveres med 2% -2,5% isofluran for at opretholde anæstesien.
- Subkutant injicere (s.q.) meloxicam-opløsning i en dosis på 2 mg/kg.
BEMÆRK: Sørg for at vælge smertestillende midler, der ikke interagerer med lægemiddelforbindelsen af interesse i farmakokinetikundersøgelsen. - Brug tape til at begrænse rottens underarme i deres ventrale position til hver side af den kirurgiske platform.
- Skrub forsigtigt det kirurgiske område ved at skifte mellem bomuldskugler gennemblødt i 75% medicinsk alkohol og jodbaseret skrubbe i alt tre gange.
- Løft forsigtigt huden nær kravebenet på højre side af halsens midterlinje med tang og lav et snit mod brystet omkring 1,5-2,0 cm i længden med et par kirurgiske saks.
- Blunt dissekerer det tynde vævsdæksel med irissaks for at udsætte den underliggende jugular vene. Den proksimale cephaliske ende af den ydre jugular vene består af to grene, som kan identificeres visuelt.
BEMÆRK: Afhængigt af rottens alder og køn varierer det bløde væv (f.eks. Spytkirtler, lymfeknuder og fedtvæv), der dækker halsvenen. Sammenlignet med de unge rotter er de gamle rotter federe (f.eks. BW > 300 g) og har derfor brug for mere vævsadskillelse, før halsvenen er synlig. - Løft den jugulære vene sammen med dens bindevæv membranøse væv for at visualisere lymfekirtlen fastgjort til jugular venen. Adskil forsigtigt venen langs den vaskulære retning fra omgivende muskler, fedt og andet væv.
- Skub tangen under halsvenen uden at beskadige sikkerhedsblodkarrene og passere to stykker 6-0 sutur under venen for at markere de to ender af blodkarret individuelt.
- Træk et stykke af suturen så langt som muligt mod rottehovedet og ligate venen kranielt med 2-3 knob ved hjælp af tang.
- Placer den anden ligatur på den kaudale ende af venen med 1 løs knude.
- Jugular vene kanylering
BEMÆRK: Den estimerede driftstid for denne del er 15 min.- Åbn emballagen, der indeholder 11 cm polyurethankateter (PU) (I.D. 0,6 mm x O.D. 0,9 mm, figur 1B), og fastgør kateteret til den forberedte stumpspidssprøjte fyldt med det hepariniserede saltvand.
- Skub langsomt det hepariniserede saltvand ind i kateteret for at undgå luftbobler.
- Skub den ikke-spidse flade side af tangen under halsvenen for at komme ud på den anden side. Lav et lille v-formet snit på venen nær kraniebåndet med et par castroviejo mikrosaks og åbn forsigtigt snittet med spidsen af albuebeholderdilatatorens tang.
BEMÆRK: Skyl snittet med forvarmet normalt saltvand (37 °C), hvis en lille mængde blod fosser ud. - Skær den skrå åbning af forenden af det jugulære venekateter ud. Spænd den skrå ende af røret med tang og skub det ind i jugular venen.
BEMÆRK: Dette trin kan have brug for en anden person for at lette kateterets glidning. - Mens du fremmer kateteret, skal du langsomt trække albuens mikrokirurgiske tang tilbage og klemme den ydre overflade af beholderen med tang.
BEMÆRK: Hvis det rigtige blodkar vælges, og spidsen af kateteret med succes glider ind i blodkarret, bør hele kateterindsættelsesprocessen ikke føle nogen strømningsmodstand. - Stop med at indsætte kateteret, når du rammer det første blå mærke på PU-røret (figur 1B), som er ca. 3,0 cm langt.
- Fastgør det indsatte kateter til venen med både kaudale og rostrale ligaturer ved hjælp af tang.
- Træk en 6-0 sutur gennem det udsatte væv på højre side af snittet ved hjælp af en suturnål (1/2 buet skæring, 12 mm) og bind ligaturen med en hæmostat.
- Bøj kateteret ved det andet blå mærke (figur 1B) for at binde med den samme ligatur (i trin 3.3.8) og for at undgå at okkludere PU-slangen.
- Klip al den ekstra suturtråd, og luk kateteret ved at udskifte den stumpe tippede sprøjte med en 22 G rustfri stålprop.
- Kateter udvendig
BEMÆRK: Den estimerede driftstid for denne del er 10 min.- Placer rotten i dorsal position og rengør forsigtigt området mellem skulderbladene med bomuldskuglen gennemblødt i 75% medicinsk alkohol.
- Lav et meget lille snit i midten af ryghalsen med kirurgisk saks. Gennem det dorsale snit skal du guide og forsigtigt skubbe trocharen under huden mod det ventrale snit på højre side af nakken.
- Sæt det venøse kateter i trocharen, og træk derefter ud og før det venøse kateter mod det dorsale snit.
- Fastgør det eksteriøriserede kateter i muskellaget på samme måde som suturen (se proceduren i trin 3.3.8 og 3.3.9).
- Luk hudlaget af ventrale og dorsale snit med 6-0 nylonsutur og suturnål (3/8 buet skæring, 17 mm). Swab alle kirurgiske snit med iodphor.
BEMÆRK: Sårklemmerne er en alternativ metode til at lukke hudsnittet. - Fjern kateterstikket ved at klemme kateteret med fingerspidserne. Placer en ny stump tippet sprøjte og træk langsomt sprøjten tilbage for at teste blodgennemstrømningen.
BEMÆRK: Da rotten er i liggende stilling, kan man muligvis ikke få taget blodprøver. Blodprøver kunne opnås ved at skifte til en sidekropsposition. - Hold kateteret igen med fingerspidserne, og injicer 0,2 ml hepariniseret saltvand og 0,1 ml låseopløsning i kateteret ved hjælp af den stumpe tippede sprøjte.
- Hold kateteret med fingerspidserne, og udskift sprøjten med et stik i rustfrit stål. Fjern kateteret, og skub stikket lidt ind for at sikre kateterets tæthed.
4. Øjeblikkelig postkirurgisk pleje
- Gendan rotten i dorsal decubitus-position ved at bure den individuelt med frisk majskolbestrøelse. Sørg ofte for en temperaturreguleret varmepude for at opretholde kernekropstemperaturen.
BEMÆRK: For dyrevelfærd er efterladelse af mad og vand på sengetøjet en effektiv måde at lindre smerten forårsaget af nakkebevægelser, når man spiser og drikker. - Registrer operationens sluttidspunkt, og overvåg rotten med 2 timers mellemrum i mindst 4 timer. Giv yderligere analgesi til genopretning, hvis rotten viser tegn på smerte eller nød.
5. Fysiologisk og hæmatologisk overvågning i genopretningsfasen
- Overvåg kropsvægten og føde- og vandindtaget dagligt, og registrer dataene.
- For at samle et lille volumen frisk blod til hæmatologisk test, skal du placere rotten i en fastholdelse. Åbn stikket, og sæt sprøjten i det venøse PU-kateter for at sikre, at kateteret ikke er blokeret.
BEMÆRK: Blodopsamlingen blev udført på samme tid dagligt i 6 på hinanden følgende dage. - Kassér det oprindeligt tilbagetrukne blod, som indeholder en blanding af blod, hepariniseret saltvand og kateterlåsopløsning.
- Brug en ny sprøjte til at opsamle 150 μL frisk blodprøve og overføre blodprøven til 0,5 ml røret indeholdende K2EDTA (1,8 mg / ml blod) spraytørret på rørvæggen.
BEMÆRK: Hvis kateteret er blokeret, kan 0,2 ml hepariniseret saltvand injiceres i kateteret for at skylle kateteret et par minutter før den næste blodopsamlingstid. - Injicer sterilt saltvand i samme volumen for at kompensere for det tilbagetrukne blod. 150 μL forvarmet normalt saltvand (37 °C) injiceres, og der tilføres 0,2 ml sterilt hepariniseret normalt saltvand gennem kateteret.
- 100 μL af låseopløsningen injiceres i kateteret for at sikre kateterets forsegling og sterilitet inden næste prøveopsamling.
- Analyser blodprøverne inden for 2 timer efter indsamling ved hjælp af en automatiseret blodcelletæller.
6. Gentagen blodprøveudtagning til farmakokinetiske undersøgelser af oralt administreret lægemiddel
BEMÆRK: Rotter med vægtøgning >10 g og stabilt hæmatologisk niveau foreslås indskrevet til fremtidig undersøgelse. Efter den nuværende protokol krævede JVC-rotterne 4 til 6 dage at komme sig.
- Efter 4-6 dages operation, hurtig rotten i 12 timer med fri adgang til vand.
BEMÆRK: Afhængigt af forsøgsmålet er det valgfrit at faste dyret. - Oralt gavage den fastende rotte med naturlig phenol bioaktiv ellaginsyre i en dosis på 6 mg/kg med en lige gavage nål16.
- Saml 200 μL blodprøver i de hepariniserede rør via jugular venekanylen på forudbestemte tidspunkter over 24 timer post-oral administration. Blodopsamlingsprocessen følger proceduren i trin 5.5.
BEMÆRK: Kateteret behøver ikke lukkes med låseopløsningen, før blodopsamlingen er afsluttet. - Blodprøven centrifugeres straks ved 3000 x g ved 4 °C i 10 min.
- Den ekstraherede plasmaprøve analyseres ved hjælp af væskekromatografi-massespektroskopi17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol har grundigt demonstreret, hvordan man etablerer en langsigtet JVC-model ved hjælp af mikrokirurgiske færdigheder til seriel blodindsamling. Figur 1A viser de væsentlige kirurgiske instrumenter og materialer, der anvendes til at udføre operationen. Specifikationen af PU-kateter med tre blå mærker er også illustreret, hvilket er nyttigt for at guide forskeren til at placere venekanylen i trin 3.3., hvordan man bruger mærkerne på PU-kateteret til at styre kanyleringen (figur 1B). Det er også vigtigt at være opmærksom på den tidsplan, der kræves for at etablere JVC-rottemodellen (figur 1C). Selvom driftstiden for JVC er ca. 35 min, hvis forskeren er dygtig, tager det 10-14 dage (tilpasnings- og genopretningsfasen) for JVC-rottemodellen at være klar til brug sammenlignet med den ikke-kirurgiske tilgang, såsom haleskæring eller orbital sinuspunktering, som kan bruges straks med korrekt træning.
De fysiologiske og hæmatologiske tilstande over 6 dage postoperativt blev også undersøgt (figur 2). Rottens kropsvægtforøgelse, føde- og vandindtag og komplette blodcelletal var variable i genopretningsfasen (figur 2A, B). Det blev konstateret, at flertallet af rotter under den nuværende undersøgelsestilstand genopretter sig inden for 4-6 dage efter operationen, som det fremgår af genoprettede niveauer af nogle nøglefunktioner, såsom kropsvægtforøgelse >10 g, regelmæssigt diætindtag og udvalgte blodkomponenter relateret til infektion, dehydrering og betændelse, herunder antal hvide blodlegemer, antal røde blodlegemer, hæmoglobin og blodpladetal (figur 2C-F). Det er værd at bemærke, at mængden af vandindtag hos rotter var relativt stor på den første dag efter operationen, hvilket indikerer dehydrering.
Farmakokinetik af den naturlige polyphenol, ellaginsyre blev undersøgt i den etablerede JVC-rottemodel (figur 3). Ellaginsyren er karakteriseret ved dårlig lægemiddelbiotilgængelighed. Når det indgives i en lav dosis (f.eks. 6 mg/kg), kræves der et stort volumen blodprøve for at detektere koncentrationen i plasmaet. Figur 3 viser lav plasmakoncentration af ellaginsyre i ng/ml over 24 timer og dens varierede absorption af mave-tarmkanalen (GIT) på grund af dens ringe opløselighed og permeabilitet.
Figur 1: Oversigt over de vigtigste kirurgiske instrumenter og forsyninger, der anvendes til JVC rottemodel etablering. (A) Øverst: a-d er normal saltvand, jodfor, plastvarer, sprayflaske med henholdsvis 75% medicinsk alkohol; Midt: e-o er 5,0 ml sprøjte, 1,0 ml sprøjte, stump tippet sprøjte, steril kanyle, kirurgisk saks, irissaks, halvbuet tang, kardilatator afbalanceret tang, castroviejo mikrosaks, rustfrit stål trochar, kæledyr barbermaskine, henholdsvis; nederst: p-w er vatpinde, 6-0 steril ikke-absorberbar nylonsuturtråd, bomuldskugler, to typer suturnål, rustfrit stålprop, buet hæmostat, klæbebånd, bedøvelsesnæsestykke, henholdsvis. B) Specifikation af det PU-kateter, der anvendes til kanylering af halsvenen hos rotter. Kateteret er 11 mm i total længde med O.D 0,6 mm x I.D 0,9 mm. Kateteret har tre blå mærker, der skal fungere som ankerpunkt under kanyleringen; C) Foreslået tidsplan for etablering af JVC-rottemodel. I denne undersøgelse blev rottens kropsvægt samt føde- og vandindtag registreret dagligt i genopretningsfasen, og blodprøver blev indsamlet en gang dagligt til rutinemæssig hæmatologisk overvågning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fysiologisk og hæmatologisk overvågning af rotter over 6 dage postoperativt. (A) Ændring i kropsvægt; B) ændringen i vand- og fødeindtagelse (C-F) Antal hvide blodlegemer, antal røde blodlegemer, hæmoglobin og blodpladetal, henholdsvis. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM med n = 6. De numeriske værdier i blåt repræsenterer middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Plasmaellaginsyrekoncentrationsprofiler for rotter over 24 timer efter oral gavage. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM med n = 3. Værdierne for PK-parametre opnås ved hjælp af tilføjelsesprogrammet PKSolver i et regnearksprogram (f.eks. Microsoft Excel)19. Cmax: topkoncentration, Tmax: tid til at nå Cmax; AUCinf: areal under plasmakoncentrations-tidskurven fra tid nul til uendelig. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mastering af teknikken til fartøjskulering kræver betydelig praksis og læring af lektionen fra hver operation. Christakis et al. ved hjælp af kumulativ sum (CUSUM) analyse, fandt ud af, at en forsker skal praktisere 200 rotter over en periode på et år, før han er klar til PK evaluering af lægemiddelkandidater20. Alligevel kan den driftstid, der kræves til vene kanyleringen, reduceres betydeligt med antallet af rotter, der udføres13,20. Ved hjælp af vores protokol steg succesraten for effektivt at kanyle halsvenen og indsamle blodprøven fra ca. 50% til over 80% (det samlede antal udførte rotter var 15), og den indledende driftstid blev reduceret til 35 minutter fra 2 timer.
Demonstrationen af at etablere en JVC-rottemodel involverer flere kritiske trin. For det første er snitområdet omkring halsen vigtigt for i første omgang at lokalisere jugular venen. Hvis den højre JVC udføres, vælges snitområdet generelt på oversiden af kravebenet langs højre side af halsens midterlinje (se pkt. 3.2 jugular veneisolering). For det andet afhænger JVC af forberedelsen af et rent segment af venen. Ved stump dissektion af blødt væv er jugular venen synlig og identificeret ved disse to træk: 1) to grene i den proksimale ende og 2) en lymfeknude fastgjort til den. For det tredje, mens du glider kateteret ind i jugular venen (se pkt. 3.3 jugular vene kanylering), trimning af kateterets forende og støtte blodkarret med stabil ekstern kraft kunne i høj grad forbedre succesraten for kanylering. Desuden skal der tilvejebringes ordentlig analgesi og varme til at trøste rotten, da stress og smerte kan forårsage ændringer i dyrets adfærd, der kan påvirke deres postoperative genopretning. Endelig kan varigheden af anæstesi, varmetab og komplikationen forårsage uventet rottedød; Det er derfor vigtigt at overvåge rotterne nøje under og efter operationen i mindst 3 dage. Evaluering af flere sundhedsindikatorer, såsom kropsvægtforøgelse, kost og drikkestatus og hæmatologiske komponenter hos rotter i genopretningsperioden, kan give oplysninger, der kan sammenlignes med referenceværdier af interesse for raske SD-rotter i databasen 21,22,23,24 . Hvis rotter oplever dehydrering, kan sterile isotoniske væsker på 3% -5% af kropsvægten injiceres subkutant i slutningen af operationen for at kompensere for væsketabet. De fleste rotter tager deres kropsvægt på (f.eks. >10 g) på dag 3 efter operationen og bør derfor være klar til brug. For undersøgelser, der involverer evaluering af blodbiomarkører (f.eks. Leukocyt, cytokiner), anbefales det dog at tilmelde rotterne inden dag 4-6 efter operationen for at sikre de normale hæmatologiske indekser for rotter.
På trods af dets anvendelighed i PK-undersøgelsen, afhængigt af katetermaterialerne, er ikke alle lægemiddelkandidater egnede til den enkelte kanylering. Gaud et al. fandt, at høje log P-forbindelser var bundet til PE-katetermaterialet, hvilket resulterede i ændret PK25. Derudover anvendes smertestillende midler (f.eks. Meloxicam) ofte for at reducere smerten hos rotte efter operationen. I betragtning af at eliminationshalveringenstiden for meloxicam er omkring 19-23 timer 26,27, er enkeltdosis meloxicam (2 mg /kg), der injiceres s.q., næsten ryddet ud af kroppen efter 24 timer. Alligevel kan potentielle lægemiddelinteraktioner forekomme ved brug af meloxicam. For eksempel kan meloxicam konkurrere med andre lægemidler til Cytochrom P450 metabolisme28,29. Således bør den valgte dosis og type smertestillende midler screenes afhængigt af det lægemiddel, der er valgt til den farmakokinetiske undersøgelse. Hvis lægemidlet af interesse interagerer med meloxicam, kan andre smertestillende midler (f.eks. Buprenorphin) anvendes.
Afslutningsvis har denne protokol grundigt demonstreret, hvordan man etablerer en langsigtet JVC-rottemodel til blodopsamling i laboratorieindstillingen og undersøger rotternes fysiologiske status i den postkirurgiske genopretningsfase. De fremhævede vitale kirurgiske trin og erfaringer kan være nyttige for forskeren til effektivt at opnå anvendelsen af kanyleringsmodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af National Natural Science Foundation of China (nr. 82003692) til R.X. Zhang; Top akademisk stipendium ved Northwestern Polytechnical University til R. Miao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant | Xinkang | N/A | collecting blood samples for hematology test |
| 0.5*20 mm 1.0-mL syringe | KLMEDICAL | N/A | washing or replacing the fluid with saline |
| 0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe | HD | N/A | Subcutaneous injection |
| 1.0-mL Blunt tipped syringe (22G) | skillsmodel | S4-PKT22G | Inject the saline and collect blood samples through catheter |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | blood collection |
| 1/2 circle cutting 5*12 mm suture needle | skillsmodel | S4-FHZ | Thread the muscle layer to fix the catheter |
| 3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle | skillsmodel | S5-FHZ | Suture the incision of rat cortex |
| 6-0 sterile non-absorbable silk suture thread | JUNSHENG | N/A | ligature |
| 75% medical alcohol | HONGSONG | N/A | Disinfection |
| Adhensive tape | LIUTAI | N/A | positioning the rat |
| Autoclave sterilization tape | Biosharp | BS-QT-028 | Mark sterilized items |
| Automated blood cell counter | Sysmex | XN-550 | Hematology test |
| Castroviejo micro scissors | skillsmodel | WA1010 | Cut the opening in the blood vessel |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002402 | Plasma preparation |
| Clean cushion | Qingjie | N/A | Prepare the operation area |
| Cotton balls | HC | N/A | Wound disinfection and sterilization |
| Cotton swabs | BEITAGOGO | N/A | Disinfection |
| Curved hemostat | skillsmodel | N/A | ligature |
| DN50 Stainless-steel rat restrainer | skillsmodel | S4-RGDQ1 | Restrict the movement of rats for easy operation |
| Ellagic acid | Aladdin | E102710-25g | natural phenol for oral administration |
| Half-curved forceps | skillsmodel | 53072 | Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture |
| Heating pad | Warm mate | N/A | preventing heat loss of animal |
| Heparin sodium | Solarbio | H8060 | anticoagulant |
| Iodophor | Xidebao | N/A | Clean the wound |
| Iris scissors | skillsmodel | 54002 | Bluent separation the muscle layer |
| Isoflurane | RWD | R510-22-16 | anaesthesia |
| LED lamp | EMPERORFEEL | N/A | sugery |
| Liquid chromatography-mass spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | VQF01-20001/ TSQ02-10002 | detection of drug concentration in plasma |
| Meloxicam | Hongqiang | N/A | Analgesic |
| Normal saline | KL | N/A | Prepara the solution and protect blood vessels from drying out |
| Pet razor | Codos | 3180 | Shaving the fur |
| Phosphate-buffered saline | ZHHC | PW012 | Preparation of Ellagic acid solution |
| PU catheter | skillsmodel | RJVC-PU | Jugular vein cannulation |
| Small animal operation anesthesia console | RWD | 68620 | Operation workstation |
| Spray bottle | Other | N/A | aseptic workstation |
| Stainless steel plug (22G) | skillsmodel | S4-PKD22G | Plug the catheter to ensure its sealing |
| Stainless steel trochar | skillsmodel | S$-PKDGZ | Guide the catheter exteriorization |
| Sterile lock solution | skillsmodel | SK-FB | lock the catheter to ensure its sterility |
| Straight feeding needle | skillsmodel | N/A | Oral gavage |
| Surgical pouch | BKMAM | N/A | container for sterilization of surgical instruments |
| Surgical scissors | skillsmodel | J21070 | Cut incision on rat skin |
| Vessel dilator balanced forceps | skillsmodel | WA3020 | Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in |
| ZS-MV Small animal anesthesia machine | ZSLab | 1057003 | inducing and maintaining anaesthesia |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Sadler, A. M., Bailey, S. J. Validation of a refined technique for taking repeated blood samples from juvenile and adult mice. Laboratory Animals. 47 (4), 316-319 (2013).
- Zhang, R. X., et al. Coordinating biointeraction and bioreaction of a nanocarrier material and an anticancer drug to overcome membrane rigidity and target mitochondria in multidrug-resistant cancer cells. Advanced Functional Materials. 27 (39), 12 (2017).
- Zhang, R. X., et al. Polymer-lipid hybrid nanoparticles synchronize pharmacokinetics of co-encapsulated doxorubicin-mitomycin C and enable their spatiotemporal co-delivery and local bioavailability in breast tumor. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
- Zhang, R. X., et al. Sample extraction and simultaneous chromatographic quantitation of doxorubicin and mitomycin C following drug combination delivery in nanoparticles to tumor-bearing mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e11 (2017).
- Bakar, S. K., Niazi, S. Simple reliable method for chronic cannulation of the jugular vein for pharmacokinetic studies in rats. Journal of Pharmaceutical Sciences. 72 (9), 1027-1029 (1983).
- Harms, P. G., Ojeda, S. R. A rapid and simple procedure for chronic cannulation of the rat jugular vein. Journal of Applied Physiology. 36 (3), 391-392 (1974).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Research Protocols. 10 (2), 84-94 (2002).
- Weeks, J. R., Davis, J. D. Chronic intravenous cannulas for rats. Journal of Applied Physiology. 19 (3), 540-541 (1964).
- Goldkuhl, R., et al. Plasma concentrations of corticosterone and buprenorphine in rats subjected to jugular vein catheterization. Laboratory Animals. 44 (4), 337-343 (2010).
- Steffens, A. B. A method for frequent sampling of blood and continuous infusion of fluids in the rat without disturbing the animal. Physiology & Behavior. 4 (5), 833-836 (1969).
- Terao, N., Shen, D. D. Alterations in serum protein binding and pharmacokinetics of l-propranolol in the rat elicited by the presence of an indwelling venous catheter. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 227 (2), 369-375 (1983).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e51881 (2015).
- Karim, N., Ali, S. Jugular vein cannulation in rats - A mini review. Canadian Journal of Pure and Applied Sciences. 3, 929-935 (2009).
- Ling, S., Jamali, F. Effect of cannulation surgery and restraint stress on the plasma corticosterone concentration in the rat: application of an improved corticosterone HPLC assay. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 6 (2), (2003).
- Lei, F., et al. Pharmacokinetic study of ellagic acid in rat after oral administration of pomegranate leaf extract. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 796 (1), 189-194 (2003).
- Yan, L. L., et al. Method development and validation for pharmacokinetic and tissue distributions of ellagic acid using Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS). Molecules. 19 (11), 18923-18935 (2014).
- Long, J. F., et al. Bioavailability and bioactivity of free ellagic acid compared to pomegranate juice. Food & Function. 10 (10), 6582-6588 (2019).
- Zhang, Y., et al. PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 99 (3), 306-314 (2010).
- Christakis, I., et al. Learning curve of vessel cannulation in rats using cumulative sum analysis. Journal of Surgical Research. 193 (1), 69-76 (2015).
- Nm, S., Oduola, A. Haematological profile shows that Inbred Sprague Dawley rats have exceptional promise for use in biomedical and pharmacological studies. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. 4 (37), 33-37 (2014).
- Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Human & Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).
- He, Q. L., et al. Sex-specific reference intervals of hematologic and biochemical analytes in Sprague-Dawley rats using the nonparametric rank percentile method. PLoS One. 12 (12), 18 (2017).
- EPA. Recommendations for and Documentation of Biological Values for Use in Risk Assessment. U.S. Environmental Protection Agency. , EPA/600/6-87/008 (NTIS PB88179874) (1988).
- Gaud, N., et al. Single jugular vein cannulated rats may not be suitable for intravenous pharmacokinetic screening of high logP compounds. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 272-278 (2017).
- Turck, D., et al.
- Aghazadeh-Habashi, A., Jamali, F. Pharmacokinetics of meloxicam administered as regular and fast dissolving formulations to the rat: Influence of gastrointestinal dysfunction on the relative bioavailability of two formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 70 (3), 889-894 (2008).
- Ludwig, E., et al. Activation of human cytochrome P-450 3A4-catalyzed meloxicam 5 '-methylhydroxylation by quinidine and hydroquinidine in vitro. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 290 (1), 1-8 (1999).
- Zhang, R. X., et al. Nanoparticulate drug delivery strategies to address intestinal cytochrome P450 CYP3A4 metabolism towards personalized medicine. Pharmaceutics. 13 (8), (2021).
