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Bioengineering

Fermentations contrôlées par la lumière pour la production de produits chimiques microbiens et de protéines

Published: March 22, 2022 doi: 10.3791/63269
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3,4
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University
* These authors contributed equally

Summary

Le contrôle optogénétique du métabolisme microbien offre un contrôle dynamique flexible des processus de fermentation. Le protocole montre ici comment mettre en place des fermentations régulées par la lumière bleue pour la production de produits chimiques et de protéines à différentes échelles volumétriques.

Abstract

Les usines de cellules microbiennes offrent une alternative durable pour la production de produits chimiques et de protéines recombinantes à partir de matières premières renouvelables. Cependant, surcharger un micro-organisme avec des modifications génétiques peut réduire la condition physique et la productivité de l’hôte. Ce problème peut être surmonté en utilisant un contrôle dynamique: expression inductible des enzymes et des voies, généralement à l’aide d’additifs chimiques ou nutritifs, pour équilibrer la croissance et la production cellulaires. L’optogénétique offre une méthode non invasive, hautement accordable et réversible de régulation dynamique de l’expression des gènes. Ici, nous décrivons comment mettre en place des fermentations contrôlées par la lumière d’Escherichia coli et de Saccharomyces cerevisiae pour la production de produits chimiques ou de protéines recombinantes. Nous discutons de la façon d’appliquer la lumière à des moments et des dosages sélectionnés pour découpler la croissance et la production microbiennes afin d’améliorer le contrôle de la fermentation et la productivité, ainsi que des principales considérations d’optimisation pour de meilleurs résultats. De plus, nous décrivons comment mettre en œuvre des contrôles de lumière pour des expériences de bioréacteur à l’échelle du laboratoire. Ces protocoles facilitent l’adoption de contrôles optogénétiques dans les micro-organismes modifiés pour améliorer les performances de fermentation.

Introduction

L’optogénétique, le contrôle des processus biologiques avec des protéines sensibles à la lumière, offre une nouvelle stratégie pour contrôler dynamiquement les fermentations microbiennes pour la production chimique et protéique1,2. Le fardeau des voies métaboliques modifiées et la toxicité de certains intermédiaires et produits nuisent souvent à la croissance cellulaire3. De tels stress peuvent entraîner une mauvaise accumulation de biomasse et une productivité réduite3. Ce défi peut être relevé en divisant temporellement les fermentations en une phase de croissance et de production, qui consacrent des ressources métaboliques à l’accumulation de biomasse ou à la synthèse de produits respectivement4. Nous avons récemment montré que la transition de la croissance à la production dans cette fermentation en deux phases peut être induite par des changements dans les conditions d’éclairage5,6,7. La haute accordabilité, la réversibilité et l’orthogonalité des apports lumineux8 offrent des avantages uniques aux fermentations contrôlées par la lumière qui sont difficiles ou impossibles à reproduire avec des inducteurs chimiques utilisés dans le contrôle dynamique des fermentations biphasées conventionnelles4,9,10,11.

La protéine EL222 sensible à la lumière bleue dérivée d’Erythrobacter litoralis a été utilisée pour développer plusieurs circuits optogénétiques pour l’ingénierie métabolique chez Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 contient un domaine de capteur lumière-oxygène-tension (LOV) qui subit un décalage conformationnel lors de l’activation de la lumière bleue (465 nm), ce qui lui permet de se lier à sa séquence d’ADN apparenté (C120)13. La fusion d’EL222 au domaine d’activation viral VP16 (VP16-EL222) donne un facteur de transcription sensible à la lumière bleue qui peut activer de manière réversible l’expression génique chez S. cerevisiae7 et d’autres organismes14 à partir du promoteur synthétique PC120. Plusieurs circuits basés sur EL222 ont été développés et utilisés pour la production chimique chez S. cerevisiae, tels que le système OptoEXP de base activé par la lumière7, dans lequel le gène d’intérêt est directement exprimé à partir de PC120 (Figure 1A). Cependant, les préoccupations de pénétration de la lumière aux densités cellulaires élevées généralement rencontrées dans la phase de production des fermentations nous ont motivés à développer des circuits inversés induits dans l’obscurité, tels que les circuits OptoINVRT et OptoQ-INVRT (Figure 1B)5,7,13. Ces systèmes exploitent les régulons de galactose (GAL) ou d’acide quinique (Q) de S. cerevisiae et N. crassa, respectivement, contrôlant leurs répresseurs correspondants (GAL80 et QS) avec VP16-EL222, pour réprimer l’expression des gènes dans la lumière et l’induire fortement dans l’obscurité. La combinaison des circuits OptoEXP et OptoINVRT permet un contrôle bidirectionnel de l’expression des gènes, permettant des fermentations en deux phases dans lesquelles la phase de croissance est induite par la lumière bleue et la phase de production par l’obscurité (Figure 2A)5,7.

L’utilisation de la lumière au lieu de l’obscurité pour induire l’expression des gènes pendant la phase de production élargirait considérablement les capacités des contrôles optogénétiques, mais nécessiterait également de surmonter les limites de pénétration de la lumière des densités cellulaires élevées généralement rencontrées dans cette phase de fermentation. À cette fin, nous avons développé des circuits, connus sous le nom d’OptoAMP et OptoQ-AMP, qui amplifient la réponse transcriptionnelle à la stimulation par la lumière bleue. Ces circuits utilisent des mutants de type sauvage ou hypersensibles de VP16-EL222 pour contrôler la production des activateurs transcriptionnels Gal4p ou QF2 des régulons GAL ou Q, respectivement, obtenant une sensibilité accrue et une expression génique plus forte avec la lumière12,13 (Figure 1C). Les circuits OptoAMP peuvent obtenir une induction lumineuse complète et homogène dans des bioréacteurs de 5 L à une densité optique (mesurée à 600 nm; OD600) valeurs d’au moins 40 avec seulement ~ 0,35% d’éclairage (dose de lumière de 5% sur seulement ~ 7% de la surface en vrac). Cela démontre un degré de sensibilité plus élevé par rapport à OptoEXP, qui nécessite un éclairage proche de 100 %12. La capacité d’induire efficacement l’expression des gènes avec de la lumière à des densités cellulaires élevées ouvre de nouvelles possibilités de contrôle dynamique des fermentations. Cela inclut l’exploitation de fermentations dans plus de deux phases temporelles, telles que les fermentations triphasées, dans lesquelles les phases de croissance, d’induction et de production sont établies avec des calendriers d’éclairage uniques pour optimiser la production chimique (Figure 2B)12.

Figure 1
Figure 1 : Circuits optogénétiques pour le contrôle dynamique de S. cerevisiae. Les circuits OptoEXP, OptoINVRT et OptoAMP sont basés sur le système sensible à la lumière VP16-EL222. (A) Dans le circuit OptoEXP, l’exposition à la lumière bleue provoque un changement conformationnel et une dimérisation de VP16-EL222, ce qui expose un domaine de liaison à l’ADN et permet la transcription à partir de PC120. La figure a été modifiée à partir de Zhao et al.7. (B) Les circuits OptoINVRT exploitent les régulons GAL (illustrés) ou Q pour induire une expression dans l’obscurité. Dans les circuits à base de GAL, VP16-EL222 et GAL4 sont exprimés de manière constitutive, tandis que le PC120 entraîne l’expression du répresseur GAL80 (dans les circuits à base de Q, GAL4 et GAL80 sont remplacés par QF2 et QS, respectivement, et un promoteur synthétique contenant DU QUAS est utilisé à la place d’un promoteur GAL). À la lumière, Gal80p empêche l’activation du gène d’intérêt de PGAL1. Dans l’obscurité, GAL80 n’est pas exprimé et se dégrade rapidement en le fusionnant en un domaine degron constitutif (petit domaine brun), ce qui permet l’activation de PGAL1 par Gal4p. La figure a été modifiée à partir de Zhao et al.5. (C) Les circuits OptoAMP utilisent également VP16-EL222 pour contrôler les régulons GAL (illustrés) ou Q. Dans ces circuits, le répresseur GAL80 (ou QS) est exprimé de manière constitutive et fusionné à un degron photosensible (petit domaine bleu) assurant une répression stricte dans l’obscurité. PC120 et un mutant hypersensible VP16-EL222 contrôlent l’expression de GAL4 (ou QF2) avec la lumière, ce qui active fortement PGAL1 (ou un promoteur contenant QUAS) dans la lumière. Les circuits dérivés de GAL peuvent utiliser des formes techniques de PGAL1, telles que PGAL1-M ou PGAL1-S, qui ont une activité accrue, ainsi que des promoteurs de type sauvage contrôlés par le régulateur GAL (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). La figure a été modifiée à partir de Zhao et al.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Fermentations biphasées et triphasées dans le temps. (A) Les fermentations biphasées opérées avec des circuits inversés se composent d’une phase de croissance entraînée par la lumière et d’une phase de production sombre. Dans la phase de croissance, la biomasse s’accumule à mesure que la voie de production reste réprimée. Lorsqu’elles atteignent l’OD600 souhaitée, les cellules sont déplacées vers l’obscurité pour s’ajuster métaboliquement avant d’être remises en suspension dans des milieux frais pour la phase de production. (B) Dans un processus en trois phases, les phases de croissance, d’incubation et de production sont définies par des horaires lumineux uniques, qui peuvent consister en une période de croissance sombre, une incubation pulsée et une phase de production entièrement éclairée. Figure créée avec Biorender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Des circuits optogénétiques ont également été développés pour le contrôle dynamique de la production chimique et protéique chez E. coli. Les circuits OptoLAC contrôlent le répresseur LacI bactérien à l’aide du circuit pDawn sensible à la lumière, basé sur le système à deux composants YF1/FixJ6 (Figure 3). Semblables à OptoINVRT5, les circuits OptoLAC sont conçus pour réprimer l’expression des gènes dans la lumière et l’induire dans l’obscurité. Les niveaux d’expression utilisant les circuits OptoLAC peuvent égaler ou dépasser ceux atteints avec l’induction standard de l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), maintenant ainsi la force de l’induction chimique tout en offrant une accordabilité et une réversibilité améliorées6. Par conséquent, les circuits OptoLAC permettent un contrôle optogénétique efficace pour l’ingénierie métabolique chez E. coli.

Figure 3
Figure 3 : Circuits OptoLAC pour le contrôle dynamique d’E. coli. Les circuits OptoLAC adaptent le système pDawn et l’opéron lac pour réaliser l’activation dans l’obscurité et la répression dans la lumière. Dans l’obscurité, YF1 phosphoryle FixJ, qui active ensuite le promoteur PFixK2 pour exprimer le répresseur cI. Le répresseur cI empêche l’expression du répresseur lacI à partir du promoteur PR, ce qui permet la transcription du gène d’intérêt à partir d’un promoteur contenant du lacO. Inversement, la lumière bleue réduit l’activité de la kinase nette YF1, inversant la phosphorylation fixJ et donc l’expression cI, ce qui déprime l’expression de lacI et empêche l’expression du promoteur contenant du lacO. La figure a été modifiée à partir de Lalwani et al.6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nous décrivons ici les protocoles de base pour les fermentations contrôlées par la lumière de S. cerevisiae et E. coli pour la production chimique ou protéique. Pour les levures et les bactéries, nous nous concentrons d’abord sur les fermentations avec une phase de croissance entraînée par la lumière et une phase de production induite par l’obscurité rendue possible par les circuits OptoINVRT et OptoLAC. Par la suite, nous décrivons un protocole pour une fermentation triphasée (croissance, induction, production) contrôlée par la lumière rendue possible par les circuits OptoAMP. En outre, nous décrivons comment étendre les fermentations contrôlées optogénétiquement des microplaques aux bioréacteurs à l’échelle du laboratoire. Avec ce protocole, nous visons à fournir un guide complet et facilement reproductible pour effectuer des fermentations contrôlées par la lumière pour la production de produits chimiques ou de protéines.

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Protocol

1. Production chimique contrôlée par la lumière à l’aide du circuit S. cerevisiae OptoINVRT7

  1. Construction de la souche
    1. Obtenir une souche avec l’auxotrophie his3 , car ce marqueur est nécessaire pour la plupart des plasmides OptoINVRT existants5. Si vous cherchez une régulation optogénétique d’un gène natif de S. cerevisiae, construisez une souche dans laquelle toute copie endogène du gène est supprimée.
    2. Linéariser le plasmide contenant le circuit OptoINVRT7, tel que EZ-L4395, et l’intégrer dans le his3-locus de la souche auxotrophe en utilisant des méthodes de transformation lithium-acétate standard15. Si vous utilisez le plasmide EZ-L439, qui contient les composants pour réprimer PGAL1 à la lumière et l’activer dans l’obscurité, linéariser au site de restriction PmeI.
    3. Après la transformation, centrifuger les cellules à 150 x g pendant 1 min et remettre doucement en suspension dans 200 μL de milieu complet synthétique (SC-His) frais d’histidine.
    4. Plaquer tout le volume cellulaire sur des plaques de gélose SC-His et incuber à 30 °C pendant 2-3 jours jusqu’à l’apparition de colonies.
    5. Préparez des cellules compétentes à partir de cette souche à l’aide de protocoles de transformation de l’acétate de lithium standard et transformez-les avec un plasmide contenant le ou les gènes à contrôler optogénétiquement en aval du promoteur PGAL1-M ou PGAL1-S5.
      REMARQUE: L’utilisation d’un plasmide qui s’intègre à δ sites (YARCdelta5) et sélectionne avec Zeocin permet une intégration multicopique stable7,16,17,18.
    6. Après transformation, centrifuger la culture à 150 x g pendant 1 min et remettre doucement en suspension dans 200 μL de milieu frais de chute SC.
      REMARQUE: Le promoteur PGAL1-M est une version synthétique du promoteur PGAL1 avec les sites de répression Mig1p supprimés, tandis que PGAL1-S est une version technique de PGAL1-M, qui a des sites de liaison d’activateurs Gal4p supplémentaires. Le promoteur PGAL1 régulier peut être utilisé pour contrôler l’expression; cependant, la force d’expression sera inférieure à celle de ces promoteurs techniques.
    7. Plaquer tout le volume cellulaire sur une plaque de gélose peptone dextrose (YPD) extrait de levure si elle s’intègre dans des sites δ, ou sur une plaque de décrochage SC si elle se transforme avec un plasmide contenant un marqueur de sélection. Incuber à 30 °C pendant 16 h sous une lumière bleue constante pour maintenir le gène contrôlé optogénétiquement réprimé.
      REMARQUE : Pour certaines souches, les colonies peuvent croître plus rapidement lorsqu’elles sont incubées dans des impulsions de lumière bleue (p. ex., 1 s marche/79 s éteint, 5 s marche/75 s éteint, 10 s marche/70 s éteint, etc.) plutôt que dans un éclairage constant, qui doit être déterminé expérimentalement pour chaque souche, si nécessaire.
    8. Utilisez n’importe quelle source de lumière de 465 nm et placez un panneau LED ~ 40 cm au-dessus de la plaque de sorte que l’intensité lumineuse soit d’environ 80-110 μmol / m2 / s. Mesurez l’intensité à l’aide d’un compteur quantique (voir Tableau des matériaux).
    9. Si vous intégrez des sites δ, créez une réplique de la plaque sur des plaques YPD contenant une plage de concentrations de Zeocin comprise entre 400 μg / mL et 1 200 μg / mL pour sélectionner une variété de numéros de copie d’intégration5,7,12,16,17,18. Incuber les plaques de réplique à 30 °C sous une lumière bleue constante ou pulsée pendant 2-3 jours jusqu’à l’apparition des colonies.
  2. Sélection préliminaire des meilleures colonies
    1. Sélectionnez huit colonies dans chaque plaque et utilisez-les pour inoculer 1 mL de milieu SC-His complété par 2% de glucose dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits. Croître dans des plaques de 24 puits sous les cellules pendant la nuit (16-20 h) à 30 °C avec des secousses à 200 tr/min (diamètre orbital de 19 mm) sous un éclairage constant de lumière bleue.
    2. Le lendemain matin, diluer chaque culture dans 1 mL d’un milieu SC-His frais avec 2 % de glucose à des valeurs OD600 allant de 0,01 à 0,3 et croître dans des plaques de 24 puits sous une lumière constante ou pulsée à 30 °C avec des secousses à 200 tr/min jusqu’à ce qu’elles atteignent des densités cellulaires comprises entre 2 et 9 valeurs OD600 (Figure 4A). Le temps nécessaire pour cette phase de croissance dépendra de la souche.
    3. Incuber les plaques dans l’obscurité pendant 4 h à 30 °C avec une secousse à 200 tr/min en éteignant le panneau lumineux et en enveloppant les plaques dans du papier d’aluminium.
      REMARQUE: Cette étape permet aux cellules de passer métaboliquement à la phase de production avant la remise en suspension dans le milieu de production.
    4. Pour commencer la phase de production, centrifugez les cultures dans la plaque de 24 puits à 234 x g pendant 5 min et remettez en suspension les cellules dans 1 mL de milieu de chute SC frais avec 2% de glucose. Scellez les plaques pour éviter l’évaporation du produit souhaité en utilisant du ruban d’étanchéité stérile à microplaques.
    5. Fermenter les plaques scellées à l’obscurité pendant 48 h à 30 °C en agitant à 200 tr/min. Assurez-vous que les plaques sont enveloppées dans du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière.
      REMARQUE: L’emballage des plaques dans du papier d’aluminium ne limite pas la disponibilité de l’oxygène ou du gaz dans les fermentations; cependant, le ruban d’étanchéité stérile limite le transfert de gaz. De petits trous peuvent être percés dans le ruban adhésif pour introduire de l’oxygène, si nécessaire.
  3. Récolte et analyse
    1. Pour récolter les fermentations, centrifuger les plaques pendant 5 min à 234 x g et transférer 800 μL du surnageant dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
    2. Selon le produit chimique d’intérêt, analysez en utilisant la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) ou une autre méthode analytique utilisant la technique de préparation de l’échantillon la mieux adaptée à l’instrument utilisé.

2. Production de protéines contrôlée par la lumière à l’aide du système OptoLAC d’E. coli

  1. Construction de la souche
    1. Co-transformez l’électrocompétent BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 avec un plasmide contenant le circuit OptoLAC1B ou OptoLAC2B6 et un plasmide qui exprime la protéine recombinante d’intérêt du promoteur PT719.
    2. Après transformation, récupérer les cellules pendant 1 h dans 1 mL de bouillon super optimal avec répression catabolisante (SOC ; 2 % de tryptone, 0,5 % d’extrait de levure, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM de MgSO4, 20 mM de glucose) à 37 °C avec rotation ou agitation.
      REMARQUE : Le plasmide contenant la protéine d’intérêt doit être compatible avec le plasmide OptoLAC (c.-à-d. différent marqueur de résistance et origine de la réplication) et ne doit pas contenir de copie de lacI.
    3. Centrifuger les cellules à 4845 x g pendant 3 min et concentrer la pastille dans 200 μL de bouillon de lysogénie (LB). Plaquez les cellules concentrées entières sur une plaque de gélose LB avec des antibiotiques appropriés et poussez à 37 ° C pendant la nuit sous une lumière bleue constante pour maintenir l’expression des protéines réprimée.
  2. Dépistage initial pour vérifier l’expression
    1. Prenez trois colonies individuelles et utilisez-les pour inoculer 1 mL de milieu LB avec des antibiotiques appropriés dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits. Croître pendant la nuit (16-20 h) à 37 °C avec des secousses à 200 tr/min sous un éclairage constant de lumière bleue (Figure 4A).
    2. Le lendemain, utilisez 1,5 μL de culture pour mesurer l’OD600 dans un spectrophotomètre avec une mesure en microvolume. Diluer les cultures en 1 mL de LB frais dans des plaques de 24 puits à des valeurs OD600 allant de 0,01 à 0,1.
    3. Cultivez les cultures à 37 °C avec 200 tr/min en secouant sous la lumière bleue pendant 2-3 h. À partir de la deuxième heure, prenez des mesures OD600 toutes les 15 minutes pour vous assurer que les cultures ne dépassent pas la plage OD600 de 0,1 à 1,5.
    4. Une fois que les cultures sont à l’OD600 souhaité, éteignez le panneau lumineux et enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium pour lancer la phase de production. Gardez la plaque dans l’obscurité pendant 8 h (37 °C), 20 h (30 °C) ou 48 h (18 °C), avec une secousse à 200 tr/min.
    5. Mesurez et enregistrez la valeur OD600 finale de chaque culture.
  3. Récolte et analyse
    1. Transférer 800 μL de chaque culture dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger pendant 5 min à 17 000 x g.
    2. Remettre en suspension la pastille de la cellule dans 200 μL de tampon de remise en suspension (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM).
      REMARQUE: La concentration de NaCl peut être ajustée en fonction de la protéine recombinante analysée.
    3. Ajouter 50 μL de tampon d’échantillon de dodécylsulfate de sodium (SDS) 6x (Tris 375 mM, pH 6,8, FDS 9 %, glycérol 50 %, bleu de bromophénol 0,03 %, TNT 9 %). Incuber à 100 °C pendant 10 min en agitant à 700 tr/min dans un thermomixeur.
    4. Chargez ~3-20 μL de la culture dans un gel SDS-PAGE à 12%. En utilisant la mesure finale de l’OD600 comme guide, chargez approximativement la même quantité de protéines pour chaque échantillon (équivalent à 10 μL de l’échantillon correspondant à une valeur finale de l’OD600 de 1). Utilisez une alimentation pour exécuter l’électrophorèse à 100 V jusqu’à ce que le gel soit complètement résolu.
    5. Tachez le gel avec la solution de G-250 bleu brillant coomassie en chauffant pendant 30 à 40 s dans un four à micro-ondes, puis en incubant sur un rotateur de plate-forme pendant au moins 15 minutes.
    6. Rincez à l’eau désionisée deux fois et détachez-vous sur un rotateur de plate-forme pendant au moins 30 minutes (ou toute la nuit), en ajoutant deux lingettes nettoyantes attachées dans un nœud pour aider à absorber la tache. Faire bouillir le gel dans une quantité suffisante d’eau dans le four à micro-ondes pendant 15 minutes pour accélérer le processus de conservation.

3. Fermentation triphasée à l’aide du système OptoAMP de S. cerevisiae

  1. Construction de la souche
    1. Obtenir une souche avec un marqueur auxotrophique his3 , car ce marqueur est nécessaire pour utiliser les plasmides OptoAMP existants5. Si vous cherchez une régulation optogénétique d’un gène originaire de S. cerevisiae, construisez une souche dans laquelle la copie endogène de ce gène est supprimée.
    2. Linéariser un plasmide contenant le circuit OptoAMP4, tel que EZ-L58012, et l’intégrer dans le locus his3 de la souche auxotrophique en utilisant des méthodes standard de transformation lithium-acétate15. Si vous utilisez EZ-L580, linéariser le plasmide au site de restriction PmeI.
    3. Après la transformation, centrifuger les cellules à 150 x g pendant 1 min et remettre doucement en suspension dans 200 μL de milieu FRAIS SC-His.
    4. Plaquer tout le volume cellulaire sur un milieu sélectif (SC-His-agar) et incuber à 30 °C pendant 2-3 jours jusqu’à l’apparition de colonies.
    5. Préparez des cellules compétentes à partir de cette souche et transformez-les avec un plasmide contenant le(s) gène(s) à contrôler optogénétiquement en aval du promoteur PGAL1-S12.
      REMARQUE: L’utilisation d’un plasmide qui s’intègre à δ sites et sélectionne avec Zeocin permet une intégration et une sélection multicopiques stables.
    6. Après transformation, centrifuger la culture à 150 x g pendant 1 min et remettre doucement en suspension dans 200 μL de milieu frais de chute SC.
      REMARQUE: Le promoteur PGAL1-S est une version synthétique du promoteur PGAL1 dans laquelle les sites de répression Mig1p sont supprimés et des sites de liaison d’activateurs Gal4p supplémentaires sont ajoutés. Le promoteur PGAL1 régulier peut être utilisé; cependant, la force d’expression sera inférieure à celle de ce promoteur conçu.
    7. Plaquer tout le volume de la cellule sur une plaque de gélose YPD ou SC-dropout et incuber à 30 °C pendant 16 h dans l’obscurité (enveloppé dans du papier d’aluminium). L’incubation dans l’obscurité maintient le gène contrôlé optogénétiquement réprimé, ce qui permet aux cellules de diriger leurs ressources métaboliques vers la croissance cellulaire plutôt que vers la production chimique.
    8. En cas d’intégration dans δ-sites, répliquer la plaque sur des plaques YPD contenant une gamme de concentrations de Zeocin à sélectionner pour une variété de numéros de copie d’intégration. Incuber les plaques à 30 °C dans l’obscurité (enveloppées dans du papier d’aluminium) pendant 2-3 jours jusqu’à l’apparition de colonies.
  2. Sélection préliminaire des meilleures colonies
    1. Sélectionnez huit colonies dans chaque plaque et utilisez-les pour inoculer 1 mL de milieu SC-His avec 2% de glucose dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits. Cultivez les cellules pendant la nuit (16-20 h) dans l’obscurité à 30 °C avec des secousses à 200 tr/min.
    2. Le lendemain matin, diluer chaque culture dans 1 mL de milieu FRAIS SC-His avec 2% de glucose à 0,1 OD600 et pousser dans l’obscurité à 30 °C avec une agitation de 200 tr/min jusqu’à ce qu’ils atteignent un OD600 de 3. Enveloppez les plaques dans du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière. Le temps nécessaire pour cette phase de croissance dépendra de la souche.
    3. Pour démarrer la phase d’induction, incuber les plaques sous une lumière pulsée (par exemple, 5 s marche/95 s éteint) pendant 12 h à 30 °C avec une secousse de 200 tr/min. Utilisez n’importe quelle source lumineuse de 465 nm et placez un panneau LED au-dessus de la plaque de manière à ce que l’intensité lumineuse soit d’environ 80-110 μmol/m2/s pour des résultats optimaux (Figure 4A).
      REMARQUE: La durée optimale de l’impulsion lumineuse pour cette incubation variera en fonction du produit chimique produit. Il est recommandé de filtrer une gamme d’horaires de lumière allant de 0,1% (par exemple, 1 s sur 999 s off) à 100% (pleine lumière).
    4. Pour commencer la phase de production, centrifugez les cultures à 234 x g pendant 5 min et remettez-les en suspension dans un milieu SC-His frais avec 2% de glucose. Scellez les plaques pour éviter l’évaporation du produit souhaité à l’aide d’un ruban d’étanchéité stérile à microplaques.
    5. Fermenter les plaques scellées à la lumière pendant 48 h à 30 °C en agitant à 200 tr/min. Optimisez le programme d’éclairage pendant cette étape, car certains produits chimiques bénéficient d’une phase de production pulsée plutôt que d’une pleine lumière.
  3. Récolte et analyse
    1. Récolter les fermentations en centrifugant les plaques pendant 5 min à 234 x g et en transférant 800 μL du surnageant dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
    2. Selon le produit chimique d’intérêt, analysez à l’aide de la CLHP, de la GC-MS ou d’une autre méthode analytique utilisant la technique de préparation de l’échantillon la mieux adaptée à l’instrument utilisé.

4. Production chimique (mévalonate) à partir d’E. coli dans un bioréacteur contrôlé par la lumière

  1. Inoculation initiale et configuration du bioréacteur
    1. Inoculer une colonie d’une souche d’E. coli conçue avec une production chimique contrôlée par la lumière en 5 mL de sels minimaux M9 (3,37 mM Na2HPO4, 2,2 mM KH2PO4, 0,855 mM NaCl, 0,935 mM NH4Cl) complétés par 0,2 % p/v d’acides casaminés, 5 % p/v de glucose et mélange de métaux traces20 (0,0084 g/L EDTA, 0,0025 g/L coCl2, 0,015 g/L MnCl2, 0,0015 g/L CuCl2, 0,003 g/L H3BO3, 0,0025 g/L Na2MoO4, 0,008 g/L ZnCl2, 0,06 g/L de citrate Fe (III), 0,0045 g/L de thiamine, 1,3 g/L MgSO4) dans un tube conique de 50 mL.
    2. Cultivez la culture pendant la nuit à 30 °C avec des secousses à 200 tr/min sous un éclairage de lumière bleue.
    3. Installez la plaque de tête du réservoir du bioréacteur, en vous assurant que les orifices suivants sont installés: insert pour sonde thermique; sonde d’oxygène dissous (OD); sparger de gaz - se connecter à la source d’air à travers un filtre de 0,2 μm; roue; condenseur de gaz - se connecter à un filtre de 0,2 μm; ligne de refroidissement (x2); lignes d’alimentation (x2) - une pour l’ajout de milieu, une pour le contrôle du pH; ligne d’échantillonnage - s’assurer qu’elle atteint le fond du navire; port vide; Sonde de pH - calibrer la sonde avec des étalons de pH = 4 et pH = 7 avant l’installation, soit autoclaver avec le reste du récipient, soit stériliser avec de l’éthanol à 95% et insérer aseptiquement avant la configuration.
    4. Remplissez le récipient avec 1 L d’eau filtrée, fixez la plaque de tête et serrez-la en vous assurant que le joint torique s’adapte et se scelle parfaitement.
    5. Couvrez toutes les ouvertures dans le réacteur avec du papier d’aluminium.
    6. Préparez trois bandes de tubes: une pour enlever l’eau, une pour insérer l’aliment et une pour contrôler le pH. Couvrez les extrémités avec du papier d’aluminium et enveloppez tous les tubes dans du papier d’aluminium.
      REMARQUE: NH4OH, qui est utilisé pour l’ajustement du pH, ne s’écoule pas correctement dans les tubes en silicone, ce qui peut entraîner des débits inexacts et une sur-basification de la culture. Pour éviter ce problème, utilisez des tubes de pompe biocompatibles (BPT) pour l’alimentation NH4OH.
    7. Autoclavez le bioréacteur et le tube, en utilisant un cycle liquide de 30 minutes.
    8. Retirez les matériaux de l’autoclave. Une fois suffisamment froid pour être manipulé, connectez la roue, les sondes de pH et d’OD, la source d’air, l’entrée et la sortie du condenseur, ainsi que l’entrée et la sortie de refroidissement à la station de contrôle.
    9. Insérez la sonde thermique et couvrez le récipient avec une gaine chauffante. Fixez la veste vers le haut du récipient pour éviter de bloquer la culture de l’exposition à la lumière.
    10. Connectez l’un des tubes stériles à la conduite d’échantillonnage et fixez-le à travers la pompe d’échantillonnage. Placez l’autre extrémité de manière à ce qu’elle s’écoule dans un récipient vide pouvant contenir au moins 1 L. Drainez l’eau à l’intérieur du récipient.
    11. Connectez un autre tube stérile à l’une des conduites d’alimentation et fixez-le à travers l’une des pompes d’alimentation. Connectez l’autre extrémité du tube à une bouteille de support M9. Introduisez le média dans le réacteur.
    12. Connectez un autre tube stérile à l’une des conduites d’alimentation et fixez-le à travers l’une des pompes d’alimentation. Connectez l’autre extrémité du tube à la bouteille contenant 28% -30% nh4OH.
      ATTENTION : Le NH4OH est corrosif. Travaillez dans une hotte pendant le transfert dans un biberon et assurez-vous que le biberon est placé dans un confinement secondaire.
    13. Placez trois panneaux lumineux dans une formation triangulaire à environ 20 cm du réacteur, en vérifiant que les intensités lumineuses à la surface de la cuve atteignent environ 80 à 110 μmol/m2/s de chaque côté (figure 4B).
    14. Le lendemain, allumez le système de bioréacteur et le refroidisseur. Réglez le point de consigne de la température du réacteur à 37 °C, le point de consigne du pH à 7,0 et l’agitation à 200 tr/min. La veste chauffante doit s’allumer.
    15. Étalonnez la sonde DO en attendant d’abord que la température et les mesures DO deviennent constantes (ce sera le point de consigne à 100%). Ensuite, déconnectez la sonde du système (ce sera le point de consigne de 0%). Répétez l’opération jusqu’à ce que la mesure DO se stabilise à 100 % lorsque la sonde est connectée, puis réglez le point de consigne DO sur 20 %.
  2. Production chimique contrôlée par la lumière
    1. Inoculer le bioréacteur à une OD600 initiale de 0,001-0,1. Allumez les panneaux lumineux pour lancer la croissance.
    2. Après 3 h, commencez à prélever des échantillons de la ligne d’échantillonnage pour prendre des mesures OD600 afin d’éviter de dépasser la densité cellulaire optimale d’induction (ρs). Une fois que le ρs optimal est atteint (la valeur optimale pour la production de mévalonate est de 0,17), éteignez les panneaux lumineux, recouvrez le réacteur de papier d’aluminium et enveloppez l’installation dans un tissu noir pour lancer la phase de production sombre.
    3. Ajouter 50 μL d’antimousse, 8 h après le passage à l’obscurité. Dévissez l’orifice vide et pipetez l’antimousse directement dans le réacteur.
    4. Utilisez le port d’échantillonnage pour prélever périodiquement des échantillons pour l’analyse HPLC ou GC.
  3. Démontage et analyse
    1. Une fois l’expérience terminée, éteignez le système. Dévissez soigneusement les sondes d’OD et de pH et lavez-les à l’eau et au savon. Dévissez la plaque de tête et lavez-la avec de l’eau et du savon à l’aide d’une brosse.
    2. Transférer la culture dans un récipient vide et ajouter de l’eau de Javel à une concentration finale de 10 % v/v. Placer dans une hotte et jeter après 30 min.
    3. Lavez la cuve du réacteur avec de l’eau et du savon à l’aide d’une brosse.
    4. Préparer les échantillons pour l’analyse en fonction du produit d’intérêt. Pour la production de mévalonate, mélanger 560 μL de culture avec 140 μL de 0,5 M HCl et vortex à grande vitesse pendant 1 min. Cela convertit le mévalonate en (±)-mévalonolactone.
      ATTENTION : HCl est un danger pour la santé. Manipulez avec un EPI approprié et assurez-vous que les tubes d’échantillon sont correctement bouchés avant le vortex.
    5. Centrifuger à 17 000 x g pendant 45 min à 4 °C. Transférer 250 μL du surnageant dans un flacon HPLC.
    6. Pour le mévalonate, analysez les échantillons à l’aide d’une colonne d’échange d’ions d’acides organiques. Quantifier la production à l’aide d’un détecteur à indice de réfraction (RID), en comparant les zones de crête à une norme de (±)-mévalonolactone.

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Representative Results

La régulation optogénétique du métabolisme microbien a été mise en œuvre avec succès pour produire une variété de produits, y compris des biocarburants, des produits chimiques en vrac, des protéines et des produits naturels5,6,7,12,13. La plupart de ces processus sont conçus pour que la croissance cellulaire se produise dans la lumière (lorsque la faible densité cellulaire pose des défis minimes avec la pénétration de la lumière), et pour que la production soit induite par l’obscurité une fois que les cellules sont cultivées. Divers produits chimiques ont été produits à partir de levure à l’aide de cette approche, notamment l’acide lactique, un précurseur de polymère précieux et additif alimentaire, ainsi que l’isobutanol, un biocarburant de nouvelle génération. Pour les deux produits chimiques, un défi commun découle de la forte volonté de S. cerevisiae de métaboliser le glucose vers la production d’éthanol plutôt que vers le produit d’intérêt et de l’incapacité de supprimer la voie de fermentation de l’éthanol sans causer de grave défaut de croissance7. Une combinaison de circuits OptoEXP activés par la lumière et OptoINVRT réprimés par la lumière a été utilisée pour activer sélectivement avec la lumière le gène de la pyruvate décarboxylase (PDC1) nécessaire à la fermentation de l’éthanol et induire la voie du produit souhaité dans l’obscurité5 (Figure 5A, B). En utilisant cette stratégie avec une densité cellulaire d’induction optimisée (ρs), des titres élevés des deux produits chimiques souhaités peuvent être atteints (Figure 5C, D), soulignant la valeur du contrôle bidirectionnel offert par l’optogénétique.

Alors que la plupart des processus optogénétiques à base de levure se sont concentrés sur une phase de croissance axée sur la lumière et une phase de production induite par l’obscurité, le développement récent de circuits OptoAMP très sensibles et puissants a également ouvert des opportunités pour les fermentations pilotées par la lumière12. Ces fermentations entraînées par la lumière sont similaires aux processus décrits précédemment; cependant, les horaires d’éclairage sont inversés de sorte que la production se produit dans la lumière. De plus, ces circuits permettent la mise en œuvre de processus triphasés, ce qui ajoute plus de flexibilité et de contrôle à la production par rapport à l’approche biphasée standard. Compte tenu de la sensibilité et de la force de ces circuits, ces processus triphasés sont généralement optimisés en examinant différents horaires d’éclairage dans chaque phase. Les impulsions lumineuses optimales dépendent de la souche et du produit d’intérêt. De tels circuits ont été appliqués avec succès à la production de naringénine, un produit naturel ayant des applications thérapeutiques, en plus de l’acide lactique et de l’isobutanol12 (Figure 6). La production accrue des trois produits chimiques démontre la valeur de la régulation optogénétique dans une gamme de complexités de voies ainsi que le nouveau potentiel offert par les fermentations triphasées.

Au-delà de ces démonstrations dans la levure, l’optogénétique a également été appliquée pour améliorer la production de protéines et de produits chimiques dans le cheval de bataille bactérien E. coli. Les fermentations avec cet hôte ont suivi un cadre de production induit par la lumière et l’obscurité à l’aide de la suite de circuits OptoLAC6. Lorsqu’elle est utilisée pour produire une protéine fluorescente jaune (YFP) ou un facteur de transcription FdeR, la production contrôlée par la lumière est comparable ou supérieure aux niveaux atteints avec l’induction IPTG standard, mais avec une accordabilité plus facile pour les niveaux intermédiaires de production (Figure 7A). En outre, des circuits OptoLAC ont été appliqués pour produire du mévalonate, un important précurseur terpénoïde, tant au niveau des microplaques que des bioréacteurs (Figure 7B,C). Ces résultats sélectionnés donnent un aperçu général de la force, de la polyvalence et de l’accordabilité de la régulation optogénétique pour la production de produits chimiques et de protéines microbiens.

Figure 4
Figure 4: Installation expérimentale pour les plaques d’éclairage et les bioréacteurs. (A) Les plaques de 24 puits peuvent être éclairées pendant le secousse en plaçant un panneau lumineux LED bleu à environ 40 cm au-dessus du secoueur. L’intensité lumineuse doit être mesurée à l’aide d’un compteur quantique pour s’assurer qu’elle se situe entre ~80 et 110 μmol/m2/s. (B) Pour éclairer un bioréacteur, placez trois panneaux lumineux dans une formation triangulaire autour du bioréacteur. Comme pour les plaques de 24 puits, l’intensité lumineuse doit être mesurée et ajustée pour atteindre ~ 80-110 μmol / m2 / s de tous les côtés. Figure créée avec Biorender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Production de produits chimiques de S. cerevisiae réprimée par la lumière. Pour améliorer la production d’acide lactique (A) ou d’isobutanol (B), une combinaison de circuits inductibles à la lumière et à l’obscurité a été utilisée pour activer sélectivement des voies spécifiques. Dans les deux scénarios, la voie de production essentielle d’éthanol est induite dans la lumière en contrôlant l’expression de PDC1 avec OptoEXP, tandis que les voies de production sont activées dans l’obscurité à l’aide d’un circuit OptoINVRT. (C) La production d’acide lactique a été testée à une plage de valeurs ρs avec deux circuits de la suite OptoINVRT. La version OptoINVRT7 a le mieux fonctionné, avec une valeur ρs optimale de 7,0. (D) La version OptoINVRT7 a également maximisé la production d’isobutanol par rapport à l’autre circuit, avec un ρs optimal de 8,75. **p < 0,01, ***p < 0,001. Les statistiques sont dérivées à l’aide d’un test t bilatéral. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes et les barres d’erreur représentent les écarts-types de quatre répétitions. La figure a été modifiée à partir de Zhao et al.5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Production de produits chimiques activés par la lumière dans les fermentations triphasées de S. cerevisiae. Les fermentations utilisant les circuits OptoAMP peuvent fonctionner avec trois phases dynamiques: croissance (i), induction (ii) et production (iii), chacune définie par différents cycles de légèreté. (A) La biosynthèse de l’acide lactique est induite à la lumière bleue par contrôle optogénétique de l’expression de la LDH. (B) La production d’acide lactique peut être optimisée en utilisant un programme de lumière pulsée (1 s marche/79 s éteint) dans la phase de croissance et un éclairage complet dans les phases d’induction et de production. (C) La production d’isobutanol est induite par le contrôle optogénétique de l’expression de l’ILV2. (D) La production d’isobutanol est optimisée à l’aide d’une phase de croissance pulsée (1 s marche/79 s off), d’une phase d’induction entièrement éclairée et d’une phase de production pulsée (2 s on/118 s off). (E) Contrôle de la voie biosynthétique plus complexe de la naringénine, induite par le contrôle optogénétique de l’expression des gènes TAL et PAL. (F) La biosynthèse de la naringénine est mieux optimisée en utilisant une croissance pulsée (1 s on/79 s off), une induction entièrement éclairée et une phase de production sombre. *p < 0,05, **p < 0,01, n.s. = aucune signification. Les statistiques sont dérivées à l’aide d’un test t bilatéral. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes et les barres d’erreur représentent les écarts-types de quatre répétitions indépendantes. La figure a été modifiée à partir de Zhao et al.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Production optogénétique de protéines et de produits chimiques recombinants chez E. coli. Le système OptoLAC a été utilisé pour produire à la fois des protéines et des produits chimiques à des titres comparables ou supérieurs à ceux atteints en utilisant l’induction chimique avec IPTG. (A) L’expression optogénétique de FdeR est à la fois forte et accordable en utilisant une variété de cycles légers, tels que résolus et quantifiés avec le transfert western. (B) Une souche conçue pour la production de mévalonate dépasse les titres obtenus à l’aide de l’induction IPTG à l’échelle de 24 puits à la valeur ρs optimale. (C) La production optogénétique de mévalonate dans un bioréacteur de 2 L démontre l’évolutivité de la production au-delà des microplaques. *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Les statistiques sont dérivées à l’aide d’un test t bilatéral. Toutes les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes et les barres d’erreur représentent les écarts-types d’échantillons biologiquement indépendants. Les données pour (A) et (C) représentent trois réplications, tandis que pour (B), le nombre de réplications de gauche à droite = 4, 4, 6, 3, 4, 4, 4, 4. La figure a été modifiée à partir de Lalwani et al.6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le contrôle dynamique est appliqué depuis longtemps pour améliorer les rendements pour l’ingénierie métabolique et la production de protéines recombinantes4. Les changements dans l’expression enzymatique sont le plus souvent mis en œuvre à l’aide d’inducteurs chimiques tels que IPTG21, galactose22 et tétracycline23, mais ont également été médiés en utilisant des conditions de processus telles que la température et le pH. Le contrôle optogénétique de l’expression des gènes élimine le besoin de modifier les paramètres de fermentation ou la composition du milieu, ce qui en fait une alternative facilement applicable aux stratégies d’induction traditionnelles. La facilité avec laquelle la lumière peut être allumée ou éteinte offre également de nouvelles capacités telles que le réglage rapide et réversible du dosage des gènes. De plus, bien que ces protocoles se concentrent sur les systèmes sensibles à la lumière bleue, l’existence d’outils optogénétiques qui inversent les réponses lumineuses existantes24 ou répondent à d’autres longueurs d’onde de la lumière25,26,27,28,29 offre un potentiel passionnant pour contrôler orthogonalement plusieurs voies pour un niveau de contrôle sans précédent. De tels avantages font de la lumière une nouvelle solution polyvalente pour un contrôle flexible des fermentations microbiennes.

Au-delà de la sélection des meilleures colonies, comme indiqué dans les protocoles, d’autres paramètres tels que la densité cellulaire à laquelle les cultures passent de la croissance à la production (ρs), la durée des périodes de production et d’incubation et les cycles d’utilisation légère devraient également être optimisés. Les meilleures valeurs de ces paramètres dépendent du produit et de la souche et doivent donc être réoptimisées pour toute nouvelle application. Par exemple, les voies impliquant des produits finaux toxiques peuvent bénéficier de valeurs ρs plus élevées, qui permettent une accumulation suffisante de cellules avant d’induire la production6,7, tandis qu’un circuit plus faible mais moins perméable peut favoriser des valeurs plus faibles de ρs pour maximiser le temps d’expression total. De même, certaines voies et protéines recombinantes peuvent bénéficier de niveaux d’expression intermédiaires, qui peuvent être atteints avec des fonctions de lumière uniques. De plus, dans le cas de fermentations utilisant des circuits OptoAMP, le nombre de phases temporelles peut être optimisé. Alors que le protocole démontré décrit un processus triphasé, les fermentations utilisant ces circuits peuvent être contrôlées avec un plus grand nombre de phases définies par des horaires et des durées de service léger uniques. Ainsi, une gamme de ces paramètres doit être testée pour optimiser les performances.

Éviter les sources de contamination lumineuse présente une considération importante lors de la configuration expérimentale. Pour les processus qui nécessitent un retard de la stimulation lumineuse jusqu’à des stades ultérieurs (par exemple, des fermentations sombres à claires), il peut être conseillé de travailler dans une pièce sombre pour éviter l’activation prématurée des systèmes optogénétiques. Dans ces cas, une source de lumière inerte peut être appliquée pour la visibilité pendant la configuration expérimentale (par exemple, une source de lumière rouge lointaine d’environ 700 nm lorsque vous travaillez avec des systèmes activés par la lumière bleue). Un avantage des processus qui commencent par une croissance induite par la lumière (de la lumière à l’obscurité) est que les manipulations expérimentales initiales peuvent être effectuées sous la lumière ambiante avec une grande visibilité.

La facilité avec laquelle un grand nombre de calendriers légers peuvent être appliqués aux fermentations offre la possibilité de développer des méthodes à haut débit pour équilibrer les voies biosynthétiques et élucider les conditions optimales qui maximisent la productivité de la fermentation. Au lieu d’équilibrer les voies métaboliques en testant un grand nombre de constructions assemblées combinatoirement dont chaque enzyme est exprimée par des promoteurs de forces différentes, les voies pourraient être équilibrées en variant les niveaux d’expression des gènes en utilisant différents cycles de service léger à partir d’un nombre beaucoup plus petit de constructions. Cela évite d’avoir à mettre en place des installations expérimentales plus lourdes, telles que la remise en suspension dans différents milieux d’induction ou des dilutions en série pour les inducteurs chimiques. Les expériences optogénétiques pourraient même être automatisées pour augmenter le débit en utilisant des contrôleurs in silico pour fournir des impulsions lumineuses spécifiquement chronométrées ou localisées à différents pools d’échantillons30. Cependant, les expériences à haut débit dans différentes conditions d’éclairage doivent être suffisamment séparées pour éviter la contamination croisée de la lumière, qui peut poser des contraintes spatiales. De plus, l’exigence d’une stimulation lumineuse empêche l’utilisation de la plupart des lecteurs de plaques et des microbioréacteurs pour les mesures en continu. Bien qu’ils ne soient pas encore largement disponibles dans le commerce, plusieurs appareils et algorithmes ont récemment été développés pour des expériences optogénétiques continues et à haut débit, qui aident à répondre à ces contraintes spatiales31,32,33,34. Ainsi, malgré ces limitations, l’optogénétique offre un énorme potentiel pour augmenter le débit expérimental tout en offrant une contrôlabilité accrue.

Les protocoles et la vidéo présentés ici permettront, espérons-le, d’abaisser les obstacles à l’adoption de contrôles optogénétiques du métabolisme cellulaire et des fermentations microbiennes. L’optogénétique est une technologie habilitante pour la recherche fondamentale et les applications biotechnologiques qui peut bénéficier d’un contrôle affiné des expressions géniques, telles que la génétique, la biologie moléculaire et cellulaire, le métabolisme, la biologie des systèmes et la cybergénétique35,36,37,38. En outre, la régulation optogénétique de l’expression des gènes a été démontrée chez d’autres micro-organismes tels que Bacillus subtilis et Pseudomonas aeruginosa, ce qui suggère que les avantages du contrôle de la lumière peuvent être étendus à l’étude et à l’application de diverses espèces39,40,41. Ces possibilités mettent en évidence le potentiel futur de l’optogénétique pour l’ingénierie métabolique, la production de protéines et d’autres applications biotechnologiques.

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Disclosures

Les auteurs ont déposé plusieurs brevets pour les circuits et méthodes optogénétiques décrits dans cet article.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par le département de l’Énergie des États-Unis, l’Office of Science, le numéro de prix DE-SC0019363 du bureau de la recherche biologique et environnementale, le prix NSF CAREER Award CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts et le prix Camille Dreyfus Teacher-Scholar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Agar powder Thermo Fisher Scientific 303991049
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid N/A N/A See Reference 1
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
PmeI New England Biolabs R0560L
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
Replica-plating device Thomas Scientific F37848-0000
Replica-plating pads Sunrise Science Products 3005-012
SC-His powder Sunrise Science Products 1303-030
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100
Sterile sealing film Excel Scientific STR-SEAL-PLT
YPD agar plates VWR 100217-054
Zeocin Thermo Fisher Scientific R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer Cepham Life Sciences 10502
12% Acrylamide protein gels Thermo Fisher Scientific NP0341BOX
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250 Thermo Fisher Scientific 20279
Electrophoresis cell Bio-Rad 1658004
Electrophoresis power supply Bio-Rad 1645050
LB broth (Miller) Fisher Scientific BP97235
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NaCl Thomas Scientific SX0425-1
OptoLAC plasmids N/A N/A See Reference 2
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SOC medium Thermo Fisher Scientific 15544034
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Tris base Fisher Scientific BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid N/A N/A See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
Antifoam Sigma-Aldrich A8311
Bioreactor with control station Eppendorf B120110001
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Bleach VWR Scientific 89501-620 (CS)
Blue LED panel HQRP 884667106091218
BPT tubing Fisher Scientific 14-170-15
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific 7647-01-0
M9 Minimal Salts Thermo Fisher Scientific A1374401
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NH4OH Solution Sigma-Aldrich I0503-1VL
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100

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References

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Bioingénierie numéro 181
Fermentations contrôlées par la lumière pour la production de produits chimiques microbiens et de protéines
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Hoffman, S. M., Lalwani, M. A.,… More

Hoffman, S. M., Lalwani, M. A., Avalos, J. L. Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production. J. Vis. Exp. (181), e63269, doi:10.3791/63269 (2022).

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