Protocolo basado en microdisección láser para el análisis LC-MS/MS del perfil proteómico de gránulos de neuromelanina

Summary

Aquí se presenta un protocolo robusto para aislar gránulos de neuromelanina del tejido humano post-mortem substantia nigra pars compacta mediante microdisección láser. Este protocolo revisado y optimizado minimiza enormemente el tiempo requerido para la recolección de muestras, reduce la cantidad de muestra requerida y mejora la identificación y cuantificación de proteínas mediante análisis LC-MS / MS.

Abstract

La neuromelanina es un pigmento negro-marrón, presente en los llamados gránulos de neuromelanina (NMG) en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta. Además de la neuromelanina, los NMG contienen una variedad de proteínas, lípidos y metales. Aunque las neuronas dopaminérgicas que contienen NMG se pierden preferentemente en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y la demencia con cuerpos de Lewy, solo se sabe poco sobre el mecanismo de formación de NMG y el papel de los NMG en la salud y la enfermedad. Por lo tanto, es esencial una mayor investigación sobre la caracterización molecular de los NMG. Desafortunadamente, los protocolos estándar para el aislamiento de proteínas se basan en la ultracentrifugación por gradiente de densidad y, por lo tanto, requieren grandes cantidades de tejido humano. Por lo tanto, aquí se establece un protocolo automatizado basado en microdisección láser (LMD) que permite la recolección de NMG y tejido circundante de sustancia negra (SN) utilizando cantidades mínimas de tejido de manera imparcial y automatizada. Las muestras extirpadas se analizan posteriormente por espectrometría de masas para descifrar su composición proteómica. Con este flujo de trabajo, se identificaron 2.079 proteínas, de las cuales 514 proteínas se identificaron exclusivamente en NMG y 181 en SN. Los resultados actuales se han comparado con un estudio previo que utiliza un enfoque similar basado en LMD que alcanza una superposición del 87,6% para ambos proteomas, verificando la aplicabilidad del protocolo revisado y optimizado presentado aquí. Para validar los hallazgos actuales, las proteínas de interés se analizaron mediante espectrometría de masas dirigida, por ejemplo, experimentos de monitoreo de reacciones paralelas (PRM).

Introduction

Cada tejido consiste en una mezcla heterogénea de diferentes tipos de células, pero el aislamiento específico de un tipo de célula a menudo es indispensable para una caracterización más precisa. La microdisección láser (LMD), que acopla un microscopio con una aplicación láser, es una herramienta poderosa para el aislamiento específico de áreas de tejido, células individuales o subestructuras celulares a partir de un compuesto complejo. La aplicación de LMD en combinación con espectrometría de masas (LMD-MS) ya se ha implementado con éxito para varias preguntas de investigación, incluido el aislamiento de ADN¹, ARN² y pro....

Protocol

El uso de tejido cerebral humano fue aprobado por el comité de ética de la Ruhr-University Bochum, Alemania (número de expediente 4760-13), de acuerdo con las regulaciones y directrices alemanas. Este protocolo se ha aplicado en rodajas de tejido de substantia nigra pars compacta obtenidas comercialmente. En la figura 1 se muestra una descripción gráfica del protocolo presentado.

1. Sección de tejidos

1. Preenfríe la cámara de criostato.
   NOTA: Cada tejido requiere diferentes temperaturas de criostato, que se pueden encontrar en el protocolo del proveedor respectivo.

Results

El aislamiento específico de NMGs y tejido SN es el paso más importante para la aplicación exitosa de este protocolo. Utilizando la función de análisis de campo de visión en el software proporcionado por el proveedor del LMD, los NMG se pueden seleccionar automáticamente de una manera dependiente del color. Por lo tanto, se deben identificar las áreas de tejido que contienen NMG (Figura 2A) y se debe realizar un análisis de campo de visión con umbrales de color ajustados, lo.......

Discussion

La LMD es una técnica ampliamente aplicable para el aislamiento de áreas específicas de tejido, células individuales o estructuras subcelulares. En el protocolo revisado y automatizado presentado aquí, esta técnica se aplica para el aislamiento específico de gránulos de neuromelanina (NMG) y tejido circundante de NMG (SN). Hasta ahora, se publicaron y utilizaron ampliamente dos enfoques diferentes para el aislamiento de NMG del tejido cerebral post-mortem humano:

a) Un gradiente de sa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-ditiotreitol	AppliChem	A1101
Acetonitrilo	Merck	1.00029.2500
Bicarbonato de amonio	Sigma-Aldrich	A6141
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	56302
Yodoacetamida	AppliChem	A1666,0100
Micro Tubo 500	Carl Zeiss	415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid espectrómetro de masas	Thermo Fisher	Scientific IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeam	Zeiss	494800-0014-000
PEN Portaobjetos de membrana	Carl Zeiss	415190-9041-000
substantia nigra pars compacta cortes de tejido Biobanco	Navarrabiomed (Pamplona, España)
Ácido trifluoroacético	Merck	91707
Grado de secuenciación de tripsina	Serva	37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano LC	system Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Nombre del software	Weblink/Company	Version
FreeStyle	Thermo Fisher Scientific	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0
PALMRobo	Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	Thermo Fisher Scientific	4.3