Artículo de método

Acustoforesis microfluídica para la separación fluvial de bacterias gramnegativas utilizando perlas de afinidad aptámero

DOI:

10.3791/63300

⸱

17 de octubre de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Digital Anti-Aging Health Care, Inje University, 2Micro device Lab Co., Ltd, 3Biohealth Products Research Center (BPRC), Inje University, 4Department of Biomedical Engineering, Inje University

En este artículo

Resumen

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Este documento describe la fabricación y operación de chips acústoforeticos microfluídicos utilizando la técnica de acustoforesis microfluídica y microperlas modificadas con aptámero que se pueden usar para el aislamiento rápido y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe la fabricación y operación de chips acústoforéticos microfluídicos utilizando una técnica de acustoforesis microfluídica y microperlas modificadas con aptámero que se pueden usar para el aislamiento rápido y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio. Este método mejora la eficiencia de separación utilizando una mezcla de microcanales largos y cuadrados. En este sistema, la muestra y el búfer se inyectan en el puerto de entrada a través de un controlador de flujo. Para el centrado de cuentas y la separación de muestras, la alimentación de CA se aplica al transductor piezoeléctrico a través de un generador de funciones con un amplificador de potencia para generar fuerza de radiación acústica en el microcanal. Hay un canal bifurcado tanto en la entrada como en la salida, lo que permite la separación, purificación y concentración simultáneas. El dispositivo tiene una tasa de recuperación del >98% y una pureza del 97,8% hasta una concentración de dosis 10x. Este estudio ha demostrado una tasa de recuperación y pureza más alta que los métodos existentes para separar las bacterias, lo que sugiere que el dispositivo puede separar las bacterias de manera eficiente.

Introducción

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Se están desarrollando plataformas microfluídicas para aislar bacterias de muestras médicas y ambientales, además de métodos basados en transferencia dieléctrica, magnetoforesis, extracción de perlas, filtrado, microfluídica centrífuga y efectos inerciales, y ondas acústicas superficiales 1,2. La detección de bacterias patógenas se continúa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero suele ser laboriosa, compleja ylenta 3,4. Los sistemas de acustoforesis microfluídica son una alternativa para abordar esto a través de un rendimiento razonable y aislamiento celular sin contacto 5,6,7. La acustoforesis es una tecnología que separa o concentra cuentas utilizando el fenómeno del movimiento del material a través de una onda sonora. Cuando las ondas sonoras entran en el microcanal, se clasifican según el tamaño, la densidad, etc., de las perlas, y las células se pueden separar de acuerdo con las propiedades bioquímicas y eléctricas del medio de suspensión 7,8. En consecuencia, se han realizado activamente muchos estudios acustoforéticos 9,10,11, y recientemente, se han introducido simulaciones numéricas 3D del movimiento acustoforético inducido por la corriente acústica impulsada por límites en microfluídica de onda acústica de superficie estacionaria 12.

Estudios en diversos campos están examinando cómo reemplazar los anticuerpos 2,3. El aptámero es un material diana de alta selectividad y especificidad, y se están realizando muchos estudios 2,9,10,13. Los aptámeros tienen ventajas de pequeño tamaño, excelente estabilidad biológica, bajo costo y alta reproducibilidad en comparación con los anticuerpos y están siendo estudiados en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas 2,3,14.

Aquí, este artículo describe un protocolo de tecnología de acustoforesis microfluídica que se puede utilizar para la separación rápida y eficiente de bacterias Gram-negativas (GN) de un medio utilizando microperlas modificadas con aptámero. Este sistema genera una onda estacionaria acústica bidimensional (2D) a través de un solo accionamiento piezoeléctrico al estimular simultáneamente dos resonancias ortogonales dentro de un microcanal rectangular largo para alinear y enfocar microperlas unidas a aptámeros en los puntos nodo y antinodo para una eficiencia de separación 2,11,15,16 . Hay un canal bifurcado tanto en la entrada como en la salida, lo que permite la separación, purificación y concentración simultáneas.

Este protocolo puede ser útil en el campo del diagnóstico temprano de enfermedades infecciosas bacterianas, así como una respuesta rápida, selectiva y sensible a las infecciones bacterianas patógenas a través del monitoreo del agua en tiempo real.

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Protocolo

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1. Diseño del chip de acustoforesis microfluídica

NOTA: La Figura 1 muestra un esquema de la separación y recolección de microperlas diana de microcanales por acustoforesis. El chip de acustoforesis microfluídica está diseñado con un programa CAD.

  1. Diseñe un chip de acustoforesis microfluídica que utilice una mezcla de perlas modificadas con aptámero y perlas de poliestireno (PS) recubiertas de estreptavidina correspondientes al tamaño de las bacterias para estudiar el rendimiento de separación del dispositivo.
  2. Diseñe un chip de acustoforesis microfluídica que recoja las perlas de PS en la salida objetivo y deseche el resto a través de la salida después de inyectar una mezcla de muestra de PS en la entrada de la muestra (ver Figura 2 y Tabla 1).
    NOTA: Para este propósito, el chip acustofluídico está diseñado y consta de dos entradas para inyectar muestras y tampón, un canal principal con un transductor piezoeléctrico conectado (PZT) para permitir que las microperlas se alineen centralmente, y dos salidas a través de las cuales se recogen las muestras y se descargan los desechos (Figura 3A)
  3. Diseñar un chip de acustoforesis microfluídica en el que las microperlas, el tampón, las bacterias y los aptámeros pasan a través del canal principal, con las microperlas alineadas centralmente a través de la acustoforesis en chip inducida por el PZT (Figura 3B, C)

2. Fabricación de chips de acustoforesis microfluídica

NOTA: Ensamble cuatro capas en el siguiente orden: una capa de vidrio-silicio de borosilicato, una capa de silicio, una capa de vidrio de borosilicato y una capa de PZT, como se muestra en la Figura 3A,B.

  1. Prepare vidrio de borosilicato (la capa superior) con orificios de 2 mm de diámetro mediante chorro de arena17 en la entrada y salida para conectar tubos de polieteretercetona (PEEK). El vidrio borosilicato mide 20 × 80 × 0,5 mm3.
  2. Preparar una capa de canal de silicio de 200 μm de espesor con un microcanal con un área de sección transversal de 0,2 × 0,2 mm2 formado mediante una fotorresistencia y un patrón de silicio obtenido mediante grabado iónico reactivo profundo (RIE)18. Taladrar orificios de 1 mm de diámetro para los canales de entrada de muestras y tampón y los canales de recogida y salida de residuos durante el grabado iónico reactivo.
    NOTA: Aquí, el grabado iónico utiliza el proceso RIE para formar microcanales. Se aplicó una fotorresistencia en forma de canal en una oblea de silicio para la capa del canal de silicio. La oblea de silicio recubierta de PR se grabó con plasma generado mediante la aplicación de 13,56 Mhz al flúor18.
  3. Preparar un chip con las capas por encima y por debajo de la capa de silicio (20 × 80 × 0,5 mm 3) preparado en el paso 2.2 (20 × 80 × 0,5 mm3) unido al vidrio de borosilicato en el paso 2.1 y una tercera capa de vidrio de borosilicato utilizando anodización a 1.000 V y 400 °C19.
  4. Fijar un PZT (20 × 40 mm2) a la capa de vidrio de borosilicato a lo largo del canal microfluídico utilizando un adhesivo de cianoacrilato (10 μL o menos).
    NOTA: Aplique el adhesivo como una capa muy delgada en el canal utilizando un hisopo de algodón para minimizar cualquier cambio en la altura. La figura 3C es una imagen del dispositivo.

3. Cepas bacterianas y cultivo

NOTA: Consulte la Tabla 2 para seleccionar e incubar bacterias GN y Gram-positivas (GP) para experimentos. Para el método de cultivo, consulte los pasos 3.1-3.4. Todas las bacterias deben incubarse en condiciones aeróbicas hasta obtener una absorbancia de 0,4 a 600 nm (OD600).

  1. Para bacterias GN como Escherichia coli DH5α, Escherichia coli KCTC2571, Sphingomonas insulae y Pseudomonas pictorum y bacterias GP como Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus pasteuri, incubar en medio Luria-Bertani a 37 °C y 220 rpm durante 16 h.
  2. Para Enterobacter (GN) y Bacillus megaterium (GP; KCTC 1021), incubar en medio caldo nutritivo a 37 °C y 220 rpm durante 16 h.
  3. Para Enterococcus thailandicus (GP), incubar en de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) medio a 37 °C y 220 rpm durante 16 h.
  4. Para Listeria grayi (GP), incubar en medio de infusión cerebral corazón a 37 °C y 220 rpm durante 16 h.
  5. Centrifugar (9056 x g) las bacterias cultivadas durante 1 minuto a temperatura ambiente (RT), luego lavar dos veces con 1x tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  6. Prepare las bacterias GN y GP seleccionadas para el análisis resuspendiendo en tampón PBS.

4. Microperlas e inmovilización del aptámero en microperlas

  1. Resuspender la mezcla de microperlas recubiertas de estreptavidina (10 μm) (Tabla de materiales) antes de usarla (mezclar mediante vórtice durante 20 s).
  2. Preparar el aptámero desnaturalizando a 95 °C durante 3 min y luego volver a plegarlo a 0 °C durante 2 min.
  3. Transfiera 250 μL de la mezcla de microperlas resuspendidas recubiertas de estreptavidina a un tubo de 1,5 ml y lave con tampón Tris-HCl (50 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 5 mM KCL, 100 mM NaCl) a RT. Luego agregue 100 μL de aptámero de ADN biotinilado al tubo.
  4. Incubar la mezcla a RT durante 30 min mientras gira (25 rpm).
  5. Después de la centrifugación (9056 x g), lavar el tubo dos veces con 200 μL de tampón Tris-HCl a RT.
  6. Añadir 10 μL de BSA (100 mg/ml) al tubo de muestra lavado e incubar durante 30 min a RT con rotación (25 rpm).
  7. Finalmente, lave las microperlas modificadas con aptámero dos veces por centrifugación (9056 x g) en tampón Tris-HCl a RT.

5. Configuración y funcionamiento de la acustoforesis

  1. Conecte los tubos de PEEK a las dos entradas para inyectar dos muestras y tampón y las dos salidas para recoger y descargar los residuos (Figura 4).
  2. Llene manualmente el canal de acustoforesis microfluídica con agua desmineralizada sin burbujas con una jeringa de 10 ml.
  3. Prepare un controlador de presión de precisión con dos o más canales de salida para controlar el flujo de fluido. Luego, llene los viales con muestra y tampón con dos orificios en sus tapas, respectivamente, y conéctelos a la entrada del chip.
    NOTA: Un controlador de presión de precisión con dos o más canales de salida se puede reemplazar con múltiples controladores de presión de precisión. En la entrada del tampón, un tampón capaz de generar un flujo laminar que evita que la muestra se mueva hacia el centro durante la inyección de la muestra se inyecta a través de un controlador de flujo.
  4. Después de preparar el dispositivo, inyecte la muestra y el tampón aplicando una presión de 2 kPa a la entrada de la muestra y de 4 kPa a la entrada del tampón utilizando el dispositivo de control de presión de precisión.
    NOTA: En este momento, para un flujo laminar suave, la presión de inyección del tampón debe ser mayor que la presión de inyección de la muestra. El flujo es controlado por un controlador de flujo fijado al aspirador conectado al canal de entrada.
  5. Concéntrese en una cuenta para moverla hacia el centro del canal microfluídico usando el PZT mientras verifica a través del microscopio.
    NOTA: Cuanto más grande sea la cuenta, mayor será el efecto en la forma de onda, por lo que es más fácil alinearla con el punto de nodo. El generador de funciones con amplificador aplica potencia a PZT para generar onda sinusoidal en el microcanal. Dado que las partes superior e inferior del microcanal están hechas de vidrio, la onda sinusoidal generada se refleja y crea un punto de nodo7.
  6. Genere una frecuencia de resonancia de 3,66 MHz utilizando un generador de funciones de un solo canal y amplifique una señal típica en 16 dB (aproximadamente nueve veces) utilizando un amplificador de potencia (Figura 4).
    NOTA: La frecuencia de resonancia del actuador debe coincidir con el tamaño del canal; debido a que el canal es cuadrado, el PZT opera a una frecuencia precisa para crear un solo nodo.
  7. Observe los procesos de separación y enriquecimiento en el chip acustofluídico con un microscopio de fluorescencia y una cámara de alta velocidad que funciona a 1.200 fps.
  8. Cuantificar y analizar la presencia o ausencia de bacterias GN y bacterias GP verificando las imágenes tomadas con la cámara de microscopio de fluorescencia de las perlas y bacterias unidas a bacterias descargadas a través de las muestras de recolección y salida de desechos.
    NOTA: Las microperlas con tampón, bacterias y aptámeros pasan a través del canal principal, y las microperlas se alinean centralmente a través de la acustoforesis en chip inducida por el PZT. Finalmente, las microperlas que se han unido a las bacterias GN se recolectan en la salida de recolección, y las bacterias no recolectadas se descargan a través de la salida de desechos.

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Resultados

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La Figura 5 muestra la imagen del flujo de cuentas en función del voltaje PZT (OFF, 0.1 V, 0.5 V, 5 V). En el caso del chip acústoforético introducido en este estudio, se confirmó que a medida que aumentaba el voltaje del PZT, aumentaba la concentración central de las perlas de 10 μm. La mayoría de las perlas de 10 μm se concentraron en el centro a 5 V del voltaje PZT. A través de este resultado, se generó una frecuencia resonante de 3.66 MHz en un generador de funciones de un solo canal, y ...

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Discusión

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Desarrollamos un dispositivo microfluídico de levitación sónica para capturar y transferir bacterias GN de muestras de cultivo a alta velocidad basado en un método de funcionamiento continuo según su tamaño y tipo, y microperlas modificadas con aptámero. El microcanal largo y cuadrado permite un diseño más simple y una mayor rentabilidad para la acustoforesis 2D que la reportada anteriormente 20,21,22,23,24,25,26.

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (Ministerio de Ciencia y TIC). (No. NRF-2021R1A2C1011380)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 y micro; m microperlas de poliestirenoBang LaboratoriesPS04001Perlas de tamaño de célula
10 y micro; m Microperlas recubiertas de estreptavidinaBang LaboratoriesCP01007Perlas de afinidad de aptámero
Oblea de silicona de 4 pulgadas/molde SU-84science29-03573-01Componentes del chip
AptámeroTecnologías de ADN integradoGN3-6'RNApara la conjugación de bacterias
Vidrio de borosilicatoSchottBOROFLOAT 33Componentes de la
centrífugaDaihanCF-10Partículas de desperdicio
Pegamento de cianoacrilato3MAD100Adjuntar PZT al microchip
Escherichia coli DH5 y alfa;KCTCKCTC2571Bacterias objetivo
Generador funcionalGW InstekAFG-2225Frecuencia de generación
Cámara de alta velocidadPhotronFASTCAM MiniObservación de la separación
Placa calefactoraComo unoHI-1000Placa calefactora para el curado de PDMS LÍQUIDO
JERINGA KOVAX-JERINGA 10 mL JeringaKoreavaccine22G-10MLLlene el canal de acustoforesis microfluídica con agua desmineralizada sin burbujas.
Polidimetilsiloxano líquido, PDMSDow Corning Inc.Sylgard 184Componentes de la viruta
LB Caldo MillerBD Difco244620Cultivo celular (medio Luria-Bertani)
MicroscopioOlympus Corp.IX-81Observación de la separación
Tampón PBSCapricornio científicoPBS-1ABacterias de desgaste
Tubos de PEEKSaint-Gobain Ppl Corp.AAD04103Inyectar o recoger partículas
Transductor piezoeléctricoFuji CeramicsC-213Generar onda específica en el canal
Amplificador de potenciaAmplificador de investigación75A250AFrecuencia de amplificación
Controlador de presión/μ fluconAMEDAMED-μ fluconControl del controlador de presión/caudal de aire
Tampón Tris-HClinvitrogen15567027Partículas de desgaste
Rotador de tubosSeouLin BioscienceSLRM-3Modificación de aptámero y cordón
de chip

Referencias

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