Summary
Detta protokoll beskriver ett nytt bröstavbildningsfönster med ett utbytbart lock (R.MIW). Intravital mikroskopi efter implantation av R.MIW möjliggör longitudinell och flerdagarsavbildning av den friska och sjuka bröstkörteln med en cellulär upplösning under de olika utvecklingsstadierna.
Abstract
Bröstkörtelns grenade struktur är mycket dynamisk och genomgår flera faser av tillväxt och ombyggnad efter födseln. Intravital mikroskopi i kombination med hudflikkirurgi eller implantation av avbildningsfönster har använts för att studera dynamiken hos den friska bröstkörteln i olika utvecklingsstadier. De flesta bröstavbildningstekniker är begränsade till en tidsram på timmar till dagar, medan majoriteten av ombyggnadsprocesserna för bröstkörteln sker inom tidsramar från dagar till veckor. För att studera ombyggnad av bröstkörteln krävs metoder som möjliggör optisk åtkomst till vävnaden av intresse för längre tidsramar. Här beskrivs en förbättrad version av titandäggdjurets avbildningsfönster med ett utbytbart lock (R.MIW) som möjliggör högupplöst avbildning av bröstkörteln med en cellulär upplösning i upp till flera veckor. Viktigt är att R.MIW ger vävnadsåtkomst under hela det intravitala avbildningsexperimentet och kan därför användas för lokal vävnadsmanipulation, märkning, läkemedelsadministration eller bildstyrd mikrodissektion. Sammantaget möjliggör R.MIW högupplöst karakterisering av celldynamiken under bröstkörtelutveckling, homeostas och sjukdom.
Introduction
Bröstepitelet är ett unikt sekretoriskt organ som finns hos däggdjur, som producerar och utsöndrar mjölk för att ge näring åt avkommor. Under hela livet genomgår bröstkörteln flera omgångar av utveckling och tillväxt, som åtföljs av strukturella och funktionella förändringar i vävnaden1. Beroende på utvecklingsstadiet är celltyperna som bidrar till vävnadsombyggnad olika, liksom platsen i duktalträdet.
Multifoton intravital mikroskopi (IVM) möjliggör studier av bröstcelldynamik in vivo i den ursprungliga och minimalt störda inställningen 2,3,4. För att få visuell tillgång till bröstkörteln har flera tillfälliga ex vivo- eller hudflikavbildningstekniker publicerats under olika stadier av bröstkörtelutveckling, inklusive puberteten 4,5,6,7, vuxen ålder 2,8, laktation 9,10,11,12 och tumördynamik 13,14 ,15. Även om dessa tekniker resulterar i hög rumsligt och tidsmässigt upplöst avbildning av bröstcelldynamik, är tidsramen begränsad till timmar medan de flesta ombyggnadsprocesser för bröstkörteln tar dagar till veckor. Därför krävs metoder som möjliggör optisk åtkomst till vävnaden av intresse för förlängda tidsramar. Under årens lopp har flera permanenta bildfönster utvecklats för brösttumöravbildning 15,16,17,18, inklusive ett titandäggdjursavbildningsfönster (MIW)2,3,19. Även om det var mycket användbart för att studera brösttumörtillväxt, förblev visualiseringen av den friska bröstkörtelstrukturen begränsad till några dagar. Nyligen utvecklades ett flexibelt kiselavbildningsfönster som möjliggör visualisering av pubertal bröstkörtel under flera veckor20. Bröstkörteln är emellertid inbäddad i en adipocytrik fettkudde, vilket leder till omfattande ljusspridning och som ett resultat begränsad synlighet av bröstduktstrukturen. Därför krävs överlägsna avbildningsförhållanden hela tiden för att visualisera vävnadsdynamiken under längre tidsperioder i bröstkörteln. Varken den klassiska MIW eller det flexibla kiselfönstret möjliggör vävnadsmanipulation eller optimering av fysisk vävnadsplats före avbildning, eftersom fönstret bildar ett slutet system efter operation och implantation. Som ett resultat kommer optimal optisk tillgång till den underliggande bröstvävnaden sannolikt att uteslutas under längre tidsperioder. Däremot möjliggör hudklafftekniken optimering och ompositionering av vävnaden under avbildningssessionen och en hudflik kan upprepas flera gånger2. Upprepade avbildningssessioner genom en hudklaff är dock endast möjliga när tillräcklig tid (minst 7 dagar) fördelas mellan operationer för att möjliggöra återhämtning av huden och är därför mest lämpad för att studera processer på längre tidsskalor. Dessutom är det lämpligt att inte utföra denna procedur många gånger på grund av dess invasiva natur och stor risk för infektioner och ärrbildning vid sårstängning.
För att övervinna dessa begränsningar, dvs. för att säkerställa optimala avbildningsförhållanden under en längre tidsperiod vid hög frekvens och samtidigt tillåta vävnadsmanipulation, utformades en förbättrad titanversion av MIW med ett utbytbart lock (R.MIW) för att visualisera den friska och sjuka bröstkörteln under flera dagar till veckor2 (figur 1A, B). R.MIW var specialdesignad för att ge optimal vävnadsåtkomst, vilket möjliggör direkt vävnadsmanipulation under hela IVM-experimentets varaktighet och därmed möjliggör visualisering av bröstkörteln vid rätt tidpunkt och plats under längre tidsperioder. När den är stängd bildar R.MIW ett lufttätt system som är jämförbart med den klassiska MIW (figur 1C). När R.MIW öppnas under aseptiska förhållanden tillåter R.MIW lokal vävnadsmanipulation för att förbättra optisk åtkomst och möjliggör också lokal administrering av ämnen, såsom väghämmare eller agonister, injektion av olika celltyper av intresse, såsom cancercells- eller immuncellpopulationer, eller tillsats av vävnadsmärkningsfärgämnen. Locket kan öppnas när som helst mellan bildsessionerna utan att orsaka skador på den underliggande vävnaden.
Figur 1: Utformning av bröstavbildningsfönstret med ett utbytbart lock. (B) Övre vy och sidovy av bröstavbildningsfönstret, som består av en yttre ring och en inre ring med ett spår däremellan för att säkra fönstret i musens hud med hjälp av en plånbokssträng sutur. Den yttre ringen har ett litet spår som passar lockets fyra utsprång (armar). (C) Tecknad film och bilder som visar lockets öppnings- och stängningsmekanismer. De sneda utsprången ser till att locket är fixerat inuti fönsterkarmen. Denna siffra har modifierats från Messal m.fl. 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Detta protokoll beskriver design- och implantationsproceduren för R.MIW, liksom en longitudinell IVM-strategi för att återbesöka samma bröstkanaler och deras visualisering med en cellulär upplösning. R.MIW gör det möjligt att följa celldelningar och morfologiska förändringar under olika utvecklingsfaser av bröstkörteln i olika fluorescerande reportermusmodeller. Sammantaget underlättar R.MIW högupplöst karakterisering av celldynamiken under bröstkörtelutveckling, homeostas och sjukdom.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs i detta dokument utfördes i enlighet med riktlinjerna från IACUC och KU Leuven och genomfördes inom ramen för godkänd projektansökan P160/2020. Innan du genomför detta protokoll, granska analgesistrategin med den institutionella veterinären och administrera pre- och postoperativ analgesi enligt institutionella riktlinjer.
1. Beredning av R.MIW (beräknad tid: 2 timmar)
OBS: För konstruktionen av R.MIW är det lämpligt att hitta en lokal tillverkare som specialiserat sig på att arbeta med hårda material som titan, eftersom detta kräver specialverktyg och expertis. Verkstäder som specialiserat sig på design och tillverkning av titanproteser har vanligtvis maskiner och expertis för att producera R.MIW-delarna.
- Placera locket på R.MIW på en steril yta med lockets utsida uppåt (och lockets armar sluttande nedåt; Figur 1A).
- Applicera cyanoakrylatlim runt hela lockets kant och placera försiktigt ett 10 mm runt glasöverdrag ovanpå locket.
OBS: Förbered alltid ett extra lock med ett glasöverdrag som backup under det kirurgiska ingreppet. - Använd en steril träpinne för att placera glasöverdragen och använd lite kraft för att trycka ner den för att säkerställa en lufttät tätning mellan glasöverdragen och lockets ram. Se till att hålen i lockets armar inte täcks av glaset.
- Desinficera locken och R.MIW genom att sänka ner i 80% etanol i minst 30 minuter i en sluten petriskål.
OBS: Lämna inte locken längre än 1 timme i 80% etanol för att undvika upplösning av cyanoakrylatlimmet. - Ta bort överflödigt cyanoakrylatlim från glasöverdragsglaset med en bomullsspets indränkt i aceton.
- Förvara locken och R.MIW i en steril miljö tills vidare användning.
OBS: R.MIW-ramen och locken kan förvaras i ett sterilt rör eller påse i högst 1 vecka. När du återupptar experimentet, undersök alltid om glasöverdragsglaset fortfarande är ordentligt fastsatt på locket innan du fortsätter med protokollet.
2. Förberedelse för operation (beräknad tidpunkt: 15 min)
OBS: För R.MIW-implantationsproceduren kan honmöss (>3,5 veckor gamla) av vilken stam som helst användas.
- Behåll steriliteten genom att använda sterila handskar och sterilisera alla föremål som kommer i kontakt med musen. Tvätta kirurgiska verktyg med vatten och mild tvål, lufttorka, linda in i aluminiumfolie utan exponerade hörn eller kanter och sterilisera med en autoklav under en cykel på 20 minuter vid 120 °C före operationen.
- Förbered en steril kirurgisk plattform och sterilisera ytorna med 80% etanol.
OBS: För att säkerställa sterilitet kan operationen utföras i ett flödesskåp. - Slå på värmedynan och täck mattan med ett sterilt draperi. Placera de sterila instrumenten på det sterila draperiet och placera R.MIW och minst två glastäckta lock i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en petriskål (stäng locket för att undvika yttre kontaminering).
- Bedöva musen i en induktionskammare med en 3% isofluran / O2-blandning . Se till att djuret är tillräckligt avslappnat för att enkelt kunna manipuleras och överföras till näsmasken utan kamp.
- Överför musen från induktionskammaren till en anestesinosmask och minska isoflurannivån till 1,5% - 2% isofluran / O2-blandning . Verifiera full anestesi genom att utföra ett tassuttagstest.
- För att utföra tassuttagstestet, kläm fast djurtassen med naglar eller trubbiga ändtångar. I avsaknad av muskelreflex, betrakta djuret som medvetslöst och fortsätt för kirurgisk förberedelse. Utför detta test före djurmanipulation och upprepa regelbundet under anestesi- och kirurgiska ingrepp för att bekräfta anestesi.
- Applicera ögonsalva för att förhindra uttorkning av hornhinnan.
- Raka området runt den 4: e bröstkörteln med ett rakblad (figur 2A). Använd den 4: e bröstvårtan som ett landmärke. Ta bort lösa hårstrån med tejp.
OBS: Alternativt kan hårborttagningskräm användas för att ta bort hårstrån. - Desinficera den exponerade huden med 80% etanol eller povidon-jod och placera musen i det sterila kirurgiska området på ryggen med nosen i en anestesi näsmask med 1,5% isofluran / O2-blandning .
- Säkra musens fram- och bakben med pappersband.
OBS: Lämna den sövda och återhämtande musen på värmedynan så mycket som möjligt, under och efter operationen. - Använd ett förklippt sterilt kirurgiskt draperi eller gasbind för att täcka musen medan du lämnar det kirurgiska området exponerat.
3. R.MIW-implantation (beräknad tidpunkt: 30 min)
- Kontrollera om djuret är tillräckligt bedövat genom att utföra ett tassuttagstest. Lyft försiktigt huden med en fin Graefe-tång och gör ett 10-15 mm diagonalt snitt med en liten fjädersax i huden ovanpå den 4: e bröstfettdynan med den 4: e bröstvårtan som orienteringspunkt (figur 2A). Se till att inte skära eller skada bukhinnan eller bröstkörteln.
- Definiera intresseområdet (ROI) baserat på makroskopiska egenskaper hos bröstvävnaden, inklusive placeringen av lymfkörteln eller en tumörskada, och försök att hålla ROI central med avseende på snittet.
- Separera huden från bröstfettkudden och underliggande vävnadsskikt med trubbig dissektion på upp till 5-8 mm runt snittlinjen för att skapa en ficka som passar R.MIW-ramen (figur 2BI).
- Plocka upp R.MIW med sterila pincett och testa om snittet är tillräckligt stort för att sätta in fönstret. Om det behövs, förstora snittet något tills R.MIW passar in.
- Ta bort R.MIW och placera en sutur med handväska runt snittet med en 5-0 silkesutur (flätad, ej resorberbar). Placera suturen 1-2 mm från snittets kant från utsidan till insidan av huden, med början från snittets kaudala ände.
- Flytta cirka 5 mm upp längs snittet och för suturtråden genom huden från insidan till utsidan. Upprepa denna procedur längs snittets kant och därigenom skapa en cirkulär sutur bestående av 5-6 slingor (figur 2BII). Suturgängans slutliga utgång ska placeras cirka 2-5 mm från den första ingången.
OBS: Var försiktig så att du inte placerar suturen för nära snittets kant, eftersom detta ökar risken för hudrivning. Att placera suturen för långt från snittets kant ökar risken för infektion mellan överflödig hud och spåret på R.MIW. - Montera R.MIW inuti snittet och använd Graefe-pincetten för att försiktigt placera huden i spåret på R.MIW. Se till att lämna suturens öglor utanför.
- Dra i öglorna på handväskans sutur och dra åt suturen i spåret på R.MIW genom att försiktigt dra i båda ändarna av suturen (figur 2BIII). Bind av med kirurgiska knutar och skär bort överflödig tråd.
- Applicera vaselin på R.MIW: s inre kant med en tandpetare, samtidigt som du ser till att undvika den underliggande vävnaden. Tryck försiktigt fönsterkarmen nedåt med sterila pincett eller två fingertoppar och placera locket i R.MIW-ramen (figur 1B). Detta kommer att undvika en volym luft mellan bröstkörtelvävnaden och R.MIW-locket.
- Placera spetsarna på tunn tång genom hålen i lockets armar och dra åt locket genom att vrida locket medurs (cirka 5 °) (figur 1C och figur 2BIV).
- Om lite luft kvarstår efter att R.MIW-locket har dragits åt, använd en steril insulinnål för att ta bort överflödig luft. För nålen genom huden in i hålrummet mellan bröstvävnaden och locket och dra långsamt ut kolven och skapa därmed ett vakuum mellan bröstkörtelvävnaden och R.MIW-locket.
- Administrera, efter operationen, analgesi såsom buprenorfin (0,1 mg/kg utspädd i steril 0,9% NaCl) genom subkutan injektion. Upprepa subkutan injektion med buprenorfin vid 8 timmar och 16 timmar efter operationen.
- Sätt tillbaka musen i buren för att återhämta sig och övervaka noga tills den är helt vaken, eller fortsätt med steg 4 för omedelbar avbildning.
- Vid detta postkirurgiska stadium, övervaka mössen noggrant för tecken på obehag eller komplikationer baserat på vitala parametrar, såsom andning, reaktivitet, beteende, hållning och kroppsvikt. Övervaka huden som omger fönstret noggrant för tecken på inflammation och nekros. Om inga komplikationer uppstår kommer R.MIW att möjliggöra upprepade IVM-sessioner under flera veckor efter implantation.
Figur 2: Översikt över det kirurgiska ingreppet och fönsterimplantationen. (A) Ett diagonalt snitt görs nära den 4: e bröstvårtan på en kvinnlig mus och huden och underliggande vävnad kopplas bort genom trubbig dissektion. (B) Den inguinala lymfkörteln och formen på fettkudden kan användas för rätt orientering av vävnaden (I). En handväska-sträng sutur placeras i huden runt snittet (II), och efter montering i fönsterramen dras suturen åt i spåret för att säkra fönsterramen och säkras med kirurgiska knutar (III). Det sista steget är införandet och låsningen av locket i fönsterramen (IV). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Upprepad intravital mikroskopi genom R.MIW
OBS: Den upprepade IVM-strategin som beskrivs här var optimerad för ett inverterat multifotonkonfokalsystem utrustat med ett motoriserat steg och en mörk klimatkammare vid 35,8 °C.
- Bedöva musen i en induktionskammare med en 3% isofluran / O2-blandning . Verifiera medvetslöshet genom att utföra ett tassuttagstest (beskrivs i steg 2.6). Applicera ögonsalva för att förhindra uttorkning av hornhinnan under bildsessionen.
- Kontrollera tillståndet för R.MIW-ramen och locket, inklusive suturernas stabilitet eller eventuella skador på locket. Vid skador på locket kan locket bytas ut enligt beskrivningen i steg 5.
- Överför musen till en förvärmd (37 °C), skräddarsydd bildlåda (bild 3A) och placera musen med huvudet i noskonen. Bildlådan består av en ram som passar in i mikroskopets automatiserade steg. Ramen är utformad för att hålla ett skräddarsytt inlägg med ett hål på R.MIW:s diameter (figur 3A).
- Ett inlopp med en noskon är ansluten till lådans framsida och fäst vid en isofluranförångningsstation med 2% -3% isofluran / O2-blandning. Ett uttag är anslutet till en anestesirensningsenhet för att säkerställa cirkulation och för att förhindra ansamling av isofluran i lådan. Bildlådan kan stängas med ett transparent lock.
- Placera musen på inlägget på ett sådant sätt att R.MIW faller i hålet på bildrutans inlägg (figur 3A). Applicera parafilm och papperstejp över musens baksida för att stabilisera musen och minska vävnadsrörelsen på grund av andning.
- Stäng bildlådan med locket och sätt in bildlådan i mikroskopets stadium.
- Minska isoflurandosen gradvis under avbildningssessionen för att upprätthålla en stabil men ytlig anestesi (vanligtvis mellan 1,5% -0,8% isofluran / O2-blandning ).
- Ge rätt näring under avbildning enligt beskrivningen nedan.
- För avbildningssessioner <3 timmar, injicera musen subkutant med 200-300 μL steril PBS för hydrering.
- För avbildningssessioner >3 timmar följer du stegen nedan.
- För långvarig avbildning, infusera musen med näringsämnen. För detta, använd en kommersiellt tillgänglig steril infusera blandning innehållande aminosyror och glukos. Placera en flexibel nål subkutant i musens hals och säkra den med papperstejp.
- Fäst en 10 ml spruta med den beredda näringsblandningen på ett flexibelt kiselrör och tryck igenom näringsblandningen tills den har nått rörets ände.
- Anslut silikonröret till den flexibla nålen. Ta änden av slangen och placera den genom ett av hålen i bildlådan (från insidan till utsidan och lämna nålfästet i lådan).
- Injicera 50 μl infusera lösning var 30:e minut.
- Säkra bildlådan i mikroskopets stadium och definiera intresseområdet med hjälp av mikroskopets epifluorescensläge.
- Använd önskade mikroskopinställningar beroende på musmodell (figur 3B). Kärlstrukturer, kollagenmönster (visualiserade av andra harmoniska generationen) och andra stabila anatomiska strukturer, inklusive inguinal lymfkörteln, kan användas som landmärken. Hämta bilder med ett inverterat multifoton konfokalmikroskop på ett 12-bitars djup och ett 25x vattenmål med en Z-stegsstorlek som sträcker sig från 1,0 till 4,0 μm (total z-stack som sträcker sig från 150 till 800 μm). Använd följande standardinställningar: 1024 x 1024-format, 600 Hz skanningshastighet, dubbelriktat läge.
- Visualisera kollagen I-fibrer genom att utföra andra harmoniska generationen genom att använda en excitationsvåglängd på 860 nm och detektion vid 425-435 nm. Excitations- och detektionsvåglängder för de olika fluoroforerna anges i tabell 1.
Tabell 1. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
- Använd funktionen Spiral i navigatörsläge för avbildningsprogramvara för att generera en stor översiktsplattakan skapa en referenskarta över vävnaden (figur 3B). Definiera ROI: erna i spiralöversikten, definiera de övre och nedre Z-planen för att bestämma Z-stacken. Tryck på Start för att få detaljerade tredimensionella (xyz) eller fyrdimensionella Z-stackar (xyzt) av vävnaden.
OBS: Under hela bildexperimentet bör musen övervakas noggrant. För långa avbildningssessioner rekommenderas en pulsoximeter och temperatursond. Musens andning ska vara regelbunden och i samma takt. Om musen börjar visa tecken på flämtning bör mängden isofluran minskas. - I slutet av varje bildsession, håll musen på en värmedyna tills den är helt vaken. Om musen visar tecken på obehag eller nedsatt rörlighet, håll buret under en längre tid på värmedynan och ge näringsgeler istället för den vanliga chow.
OBS: Mellan bildsessionerna bör musen övervakas noggrant för tecken på obehag som minskad mat- och vattenförbrukning, snabb andning, minskad rörelse, tremor, onormal kroppshållning eller ovårdad päls. Vid tydliga tecken på obehag, följ institutionella riktlinjer för djurskydd och avsluta experimentet när det humana effektmåttet har uppnåtts. - Upprepa steg 4.1–4.12 för varje upprepad avbildningssession och använd översiktspanelerna för att spåra samma position(er) över flera tidpunkter (bild 3B). Bildfrekvensen beror på forskningsfrågan och tidpunkten för den studerade processen och varierar vanligtvis från bildsessioner två gånger om dagen till en gång per vecka.
- I slutet av den önskade experimentperioden avlivar du djuren med en implanterad R.MIW med djupbedövning med isofluran följt av cervikal dislokation. Dissekera om så önskas de organ som är av intresse för ytterligare ex vivo-analyser .
- Alternativt kan du hålla djuret vid liv för framtida in vivo-analyser . Ta i så fall bort påsens sutur som håller R.MIW genom att klippa den med fjädersax och ta försiktigt bort fönsterringen från mushuden med trubbiga pincett. Rengör kanterna på huden som tidigare höll fönstret och fortsätt med en enkel kontinuerlig sutur (absorberbart material, såsom polyglykolsyra).
- När huden är stängd, knyt de inledande och avslutande suturtrådarna med två fyrkantiga knutar (4 kast). För att minimera vävnadsischemi bör knutarna vara tillräckligt lösa för att tillåta blodflöde vid hudkanten. Desinficera såret med povidon-jod för att förhindra inflammation och för att främja läkning av huden.
Bild 3: Longitudinellt IVM-arbetsflöde. (A) Schematisk skildring av ett typiskt flerdagars IVM-experiment. (B) Avbildning av en tumörogen region i den vuxna bröstkörteln. Före varje bildsession kan en översiktspanel med låg upplösning (den övre panelen) underlätta identifieringen av de regioner som är av intresse under efterföljande bilddagar. Kollagen I-mönstret (andra harmoniska generationen, magenta), vävnadsstruktur och mönster av differentiellt märkta celler med fluorescerande proteiner (avbildade i grönt, gult och rött) kan användas för att spåra samma vävnadsområde. Skalstänger representerar 1 mm (översikt kakelkan) och 100 μm (bottenpaneler). (C) Schematisk representation av R26-Confetti-reporterkonstruktionen . Vid tamoxifeninducerad Kre-rekombination konstruerar konfetti stokastiskt rekombiner, vilket resulterar i uttrycket av en av de fyra fluoroforerna (nGFP, YFP, RFP eller mCFP). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Öppna och stänga locket på R.MIW mellan bildsessionerna
- Behåll steriliteten genom att använda sterila handskar och sterilisera alla föremål som kommer i kontakt med musen. Autoklav kirurgiska verktyg före operationen (se steg 2 för mer information).
- Slå på värmedynan och täck mattan med ett sterilt draperi och bedöva musen i en induktionskammare med en blandning på 3% isofluran / O2 . Verifiera adekvat anestesi genom att utföra ett tassabstinensreflextest.
- Överför musen från induktionskammaren till en anestesinosmask och sänk isoflurannivån till 1,5% -2% isofluran / O2-blandningen .
- Placera spetsarna på tunna pincett genom hålen i lockets armar och lossa locket genom att vrida locket moturs. Applicera vid behov lite förvärmd steril PBS (37 °C) på fönstret för att underlätta lossning av locket.
- Placera locket på R.MIW i en steril skål med steril PBS tills vidare användning. Rengör lockets täckglas med demi-vatten och därefter 80% etanol. Förvara locket i steril PBS tills vidare användning.
- Förhindra att den exponerade vävnaden torkar ut genom att tillsätta några droppar steril PBS till vävnadsytan.
- Applicera eller injicera något ämne eller celler av intresse på den exponerade vävnaden, en maximal volym på 50 μL kan användas. Vänta några minuter tills vätskan absorberas av vävnaden. Alternativt kan vävnaden manipuleras eller omplaceras med hjälp av sterila, trubbiga pincett för att optimera avbildningsförhållandena för specifika ROI.
- Applicera vaselin på den inre kanten av R.MIW, se till att undvika den underliggande vävnaden. Placera locket i R.MIW-ramen enligt beskrivningen i steg 3.9, placera spetsarna på tunna pincett genom hålen i lockets armar och dra åt locket genom att vrida locket medurs (cirka 5 °).
Representative Results
För att studera den proliferativa dynamiken hos bröstepitelceller under de olika utvecklingsstadierna i bröstkörteln utfördes det beskrivna protokollet. Utformningen av R.MIW visas i figur 1, och proceduren för att implantera en R.MIW sammanfattas i figur 2. R.MIW implanteras kirurgiskt mellan bröstkörteln och huden. En sutur används för att hålla i fönsterringen och förhindra att mössen drar i suturerna (figur 2). Suturerna som håller R.MIW är gjorda av icke-absorberbart siden, som har allergivänliga egenskaper, en mjuk konsistens och är lätt att hantera. R.MIW-ringen är tillverkad av titan, ett av de mest biokompatibla materialen som inte främjar inflammation eller nekros efter implantation21. Om de aseptiska förhållandena följs och suturerna utförs väl, utgör R.MIW-bröstkörtelimplantationen en låg risk för postoperativa komplikationer. Dessutom, till skillnad från bukavbildningsfönsterimplantation22, är R.MIW-implantation inte en begränsande faktor för musöverlevnad eftersom bröstkörteln inte är ett viktigt organ och tillåter daglig avbildning upp till den gräns som anges i det etiska protokollet. Den enda faktorn som begränsar varaktigheten av fönsterimplantation är hudens homeostatiska omsättning, vilket så småningom kommer att leda till att suturerna faller ut efter 4 - 6 veckor. Därför är det viktigt att regelbundet inspektera suturernas stabilitet. Om så önskas kan suturerna tas bort och ersättas med en ny sutur med handväska under aseptiska förhållanden (som beskrivs i steg 3.5 - 3.8) för att lugna fönsterstabiliteten.
En stor utmaning när du använder flerdagsavbildningsmetoden är att spåra en ROI på på varandra följande dagar. För detta ändamål kan en snabb översiktssökning inkluderas innan du väljer ROI (er) (figur 3B). Flera vävnadsmärken kan användas för att spåra samma region i vävnaden, inklusive kollagennätverkssignalen (visualiserad av andra harmoniska generationen), vävnadsstruktur, liksom lokala mönster av celler differentiellt eller stokastiskt märkta med färgämnen eller fluorescerande proteiner (Figur 3B). I detta representativa exempel implanterades en R.MIW på den 4: e bröstkörteln i en MMTV-PyMT; R26-CreERT2het; R26-Confettihet honmus vid början av palpabel tumörbildning. Därefter inducerades stokastisk rekombination genom injektion av 1,5 mg tamoxifen, vilket resulterade i rekombination av konfettikonstruktionen i vissa celler (figur 3C). De rekombinerade tumörcellerna följdes under en period av 20 dagar (figur 3B,C). Om avbildning av samma region i bröstkörteln under på varandra följande dagar är utesluten kan fönstret öppnas i en aseptisk miljö (som beskrivs i steg 5.1) för att ytterligare rensa upp och flytta vävnaden för att förbättra synligheten och bildförvärvet (figur 3A).
Med hjälp av denna metod följdes den utvecklande bröstkörteln under puberteten på encellsnivå. Upprepad IVM genom en R.MIW utfördes med hjälp av R26-CreERT2het; R26-mTmGoch honmöss mellan 4-6 veckors ålder, där alla celler är märkta med membran tdTomato (figur 4A)23. Möss injicerades med en låg dos tamoxifen (0,2 mg/25 g kroppsvikt), vilket resulterade i sporadisk rekombination av mTmG-konstruktionen, vilket orsakade en förändring från rött till grönt i vissa celler i alla vävnader, inklusive bröstkörteln (figur 4B). Samma ROI återbesöktes under flera dagar för att visualisera morfologiska förändringar i bröstkörteln, inklusive duktal förlängning och duktal förgrening (figur 4C) med en cellulär upplösning. Viktigt är att denna kombination av stokastisk cellmärkning och flerdagars IVM också möjliggör visualisering av de dynamiska förändringarna i duktalmiljön, såsom dynamiken hos enskilda celler i stroma som omger töjnings- och förgreningskanalerna (figur 4D) samt celldynamiken i inguinal lymfkörteln (Figur 4E).
Figur 4: Flerdagars IVM av pubertal förgreningsmorfogenes. R26-mTmG-möss i åldern mellan 4-6 veckor injicerades med en låg dos tamoxifen som ledde till kremedierad rekombination av R26-mTmG-allelen och avbildades på dag 1, 3 och 5 för att följa de dynamiska förändringarna i utvecklande bröstkörtel. (B) Schematisk representation av R26-mTmG-muskonstruktionen, som under icke-rekombinerade förhållanden resulterar i allestädes närvarande uttryck av membran tdTomato (mT). Vid Kre-medierad rekombination växlas mT för membran eGFP (mG) uttryck. C) 3D-återgivning av en töjande och förgrenande bröstkanal under flera dagar avbildad genom en R.MIW i en R26-CreERT2. R26-mTmG honmus vid 6 veckors ålder. (D) Enstaka Z-planbilder av förgreningsspetsen (övre paneler) och förlängningsgrenen (nedre paneler). mT är avbildad i rött och mG i cyan, skalstänger representerar 100 μm (A och B). Enstaka celler i stroma markeras med vita asterisker. Observera att signalintensiteten ökades manuellt för att markera de enskilda cellerna i stroma, vilket ledde till ett något överexponerat utseende av bröstepitelcellerna. E) Representativa bilder av inguinal lymfkörtel i en R26-CreERT2. R26-mTmG honmus avbildad genom en R.MIW, som visar en översiktspanelsökning (vänster panel), zoombilder (höger paneler) av ett enda Z-plan (överst) och en 3D-rendering (botten). Andra harmoniska generationen (kollagen I) visas i grönt, mT i rött och mG i cyan. Skalstreck representerar 500 μm (översiktsplattorkan) och 100 μm (zoombilder). Figurpanelerna C och D är modifierade från Messal m.fl. 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
På samma sätt, i den vuxna bröstkörteln, möjliggör den föreslagna R.MIW-metoden visualisering av samma duktala strukturer under flera dagar med kompromisslös synlighet. Även användningen av mindre ljusa fluorescerande reportermodeller24, såsom Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP) musmodell, möjliggör visualisering av duktal stabilitet och subtila morfologiska förändringar med en cellulär upplösning (Figur 5). Observera att synligheten mellan dag 3 och dag 5 förbättrades avsevärt efter vävnadsompositionering (figur 5).
Figur 5: Flerdagarsavbildning av den vuxna bröstkörteln 3D renderade bilder av en bröstduktal struktur av en vuxen kvinnlig Cdh1-mCFP (cyan, som markerar ecadherin-positiva luminala celler uttryck) mus under flera på varandra följande dagar. Kollagen I-mönstret (andra harmoniska generationen, magenta) användes för att spåra samma ROI, och Cdh1-mCFP-signalen användes för att markera de duktala (luminala) cellerna. Observera att synligheten efter dag 3 förbättrades genom öppningen av R.MIW-locket och omplaceringen av vävnaden. Skalstreck representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För att bedöma proliferativ heterogenitet hos bröstepitelcellerna under hormoncykeln på encellsnivå användes den fotokonvertibla Kikume Green-Red (KikGR) reportermusmodellen25,26, som har allestädes närvarande uttryck av KikGR-proteinet. KikGR är en ljus fluorofor som genomgår grön-till-röd omvandling vid exponering för violett ljus och det röd/gröna förhållandet kan användas som en proxy för den proliferativa aktiviteten hos en cell2 (figur 6A,B). Med hjälp av R.MIW-metoden följde vi samma celler i det duktala trädet i den vuxna bröstkörteln under flera dagar och fann tidigare oväntad proliferativ heterogenitet i hela duktalträdet (figur 6C). Höga och låga proliferativa celler fördelades lika över de olika konverterade områdena (figur 6C, D). På grund av att angränsande celler på lokal nivå visade stora skillnader i deras röd/gröna förhållande (figur 6C,D). Kvantifiering av det röd-gröna förhållandet mellan olika celler (som en proxy för deras proliferativa aktivitet) 10 dagar efter fotokonvertering, avslöjade mycket varierande utspädningshastigheter för vissa celler inom samma duktala mikromiljö (figur 6E). Tillsammans avslöjar dessa data en anmärkningsvärd lokal proliferativ heterogenitet inom den vuxna bröstkörteln, och samtidigt en global enhetlig omsättningshastighet.
Figur 6: Longitudinell IVM av proliferativ heterogenitet i den vuxna bröstkörteln med kikGR-musmodellen. Avbildningssessionerna upprepades på dag 2, 6 och 10 efter konvertering. (B) Schematisk avbildning av de hypotetiska resultaten vid fotokonvertering av KikGR-bröstepitelceller efter proliferation (vänster panel) och ingen spridning (höger panel) som en funktion av tiden. (C) Samma område av bröstkörteln avbildades genom en R.MIW under en period av 10 dagar. Mindre regioner fotokonverterades på dag 0 och visar en liknande utspädningshastighet för Kikume-röda signalen över tid, vilket indikerar en lika stor omsättningshastighet i hela epitelet. (D) Zoombilder (enstaka Z-plan) av de angivna regionerna i panel C visar proliferativ heterogenitet på cellnivå 6 och 10 dagar efter fotokonvertering. Skalstreck representerar 100 μm (panel C) och 10 μm (panel D). (E) Kvantifiering av det röd-gröna förhållandet mellan slumpmässigt utvalda celler (n = 48 celler) i tre fotokonverterade områden. En hög röd/grön kvot är ett tecken på en låg utspädningsgrad och låg proliferativ aktivitet, medan en låg röd/grön kvot är ett tecken på en hög utspädningshastighet och spridning. Figurpanelerna C- E har modifierats från Messal m.fl. 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
R.MIW möjliggör longitudinell avbildning av den friska och sjuka bröstkörteln i sin ursprungliga och minimalt störda miljö och möjliggör upprepad visualisering av bröstkörteln i olika utvecklingsstadier. R.MIW-designen gör att fönstret kan öppnas när som helst under experimentet. Långsiktig visuell tillgång till vävnaden av intresse kan hindras, till exempel genom ackumulering av cellskräp på täckglaset. I sådana fall kan R.MIW öppnas före eller omedelbart efter en avbildningssession för att möjliggöra rengöring av hela det synliga vävnadsområdet och locket. Det avtagbara locket möjliggör också manipuleringar av vävnaden såväl som lokal applicering av ämnen, såsom specifika hämmare och terapier, märkning av färgämnen eller specifika celltyper av intresse.
Denna metod övervinner begränsningen av de tidigare beskrivna brösthudflikprocedurerna 4,7,8,13, som är begränsade till en avbildningssession och kan visualisera processer som förgrening av morfogenes (figur 5), homeostatisk vävnadsomsättning (figur 6) eller tumörtillväxt på cellnivå (figur 3B ). Men samtidigt tillåter R.MIW lokal manipulation av vävnaden mellan avbildningssessioner, vilket utgör en stor tillgång för R.MIW jämfört med den tidigare publicerade MIW 3,18 och alla andra bildfönster20,22. När du öppnar R.MIW är det viktigt att alltid upprätthålla aseptiska förhållanden för att förhindra infektionskälla. Möjligheten att öppna R.MIW i en aseptisk miljö gör det möjligt att optimera bildförhållandena före varje bildsession, vilket avsevärt förbättrar långsiktig visuell tillgång till vävnaden av intresse. Specifikt, i bröstkörteln, som är inbäddad i en adipocytrik stroma, är detta av stort värde. Dessutom kan det utbytbara locket unikt möjliggöra lokal administrering av terapier, olika celltyper, märkningsfärger, bildstyrd mikrodissektion eller någon annan lokal manipulation av vävnaden utan att behöva avsluta IVM-experimentet. Till exempel, för att studera tumörinitiering, kan specifika cancercellpopulationer injiceras direkt i duktalt träd eller stroma vid en bestämd IVM-tidpunkt och exakt bröstkörtelplats, så länge denna ROI är tillgänglig via R.MIW-ringen. För att studera tumörprogression kan specifika cancercellpopulationer (på en specifik plats, i en specifik mikromiljö eller med ett specifikt beteende) fotomarkeras under IVM-sessionen och därefter mikrodissekeras med hjälp av ett fluorescerande dissektionsmikroskop efter öppnandet av R.MIW. Isolerade celler kan bearbetas ytterligare för nedströmsanalyser, såsom (encells) mRNA-sekvensering. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan man koppla in vivo-cellbeteende till molekylära uttrycksprofiler. Fördelen med lokal läkemedelsadministration som möjliggörs av R.MIW gör att vävnaden kan avbildas före och direkt efter behandlingen. Det intervall som behövs för att ta bort musen från bildlådan och därefter utföra lokal läkemedelsadministration efter att R.MIW-locket har öppnats kan utföras på några minuter, vilket möjliggör omedelbar fasfångst av snabbverkande läkemedel.
Vi visar att IVM i bröstkörteln genom R.MIW är kompatibel med många olika fluorescerande reportermusmodeller. Den fettrika miljön är utmanande att avbilda, och därför rekommenderas användning av ljusa fluoroforer. Men som visas här kan ännu mindre ljusa fluoroforer som mCFP visualiseras genom R.MIW under optimala bildförhållanden. Oundvikligen kommer fettkudden att utesluta avbildning av de djupare duktala strukturerna och begränsa avbildningen till de mer ytliga kanalerna. En översiktsbild med låg upplösning i början av varje IVM-experiment hjälper till att identifiera de duktala strukturer av intresse som är tillräckligt ytliga för högupplöst avbildning. Lokal vävnadsmanipulation, avlägsnande av bindväv eller ompositionering av fettvävnaden efter öppnande av R.MIW kan optimera IVM för specifika ROI som överlagras av fettvävnad. Detta är en viktig fördel jämfört med alla tidigare fönsterdesigner, som inte tillåter att utföra dessa manipuleringar och skulle kräva fullständigt avlägsnande av själva fönstret. Specifikt, för visualisering av inguinal lymfkörtel, rekommenderas att försiktigt ta bort den överliggande fettvävnaden, vilket minskar ljusspridning och möjliggör högupplöst avbildning. När du manipulerar vävnaden, håll alltid aseptiska tillstånd och förhindra blödning eller allvarlig skada på vävnaden, eftersom de kan påverka de processer som studeras under IVM-experimentet.
R.MIW är tillverkad av titan, ett material som vanligtvis används i klinisk praxis för att ersätta hårda vävnader som leder eller benplattor. Titan har flera fördelar jämfört med stålfönster, inklusive dess lätta och inerta karaktär21. Nyligen användes flera andra material för att generera nya bildfönstertyper, inklusive det flexibla kiselfönstret20. Till skillnad från R.MIW kräver det flexibla fönstret inga suturer för implantation och är lämpligt för nästan vilken anatomisk position som helst, särskilt när det gäller mjuka och ömtåliga vävnader. Kiselfönster har en minimal inverkan på djurens rörlighet på grund av deras lätta och deformerbara natur och kanske mer lämpade i experiment som studerar snabb vävnadsutvidgning och tillväxt20. En annan fördel jämfört med titanversionen är att kiselfönster är kompatibla med andra bildmetoder, inklusive magnetisk resonansavbildning20,27. Det är dock viktigt att komma ihåg att målen är optimerade för 0,17 mm glasöverdrag. Dessutom är bröstvävnad mottaglig för andningsrörelser, som är svåra att begränsa med det flexibla fönstret, särskilt när man använder ett inverterat mikroskop. Andningsartefakter minimeras av R.MIW-designen och fixeringen av R.MIW i bildrutans inlägg. Som ett resultat förvrängs inte bilder som förvärvats med den föreslagna R.MIW-installationen på grund av andningsartefakter. Emellertid kan mindre drifter i vävnadslokalisering inträffa, som vanligtvis är gradvisa och kan korrigeras med hjälp av programvara för rörelsekorrigering efter förvärv28. Med den ökande verktygslådan av IVM-teknik 2,20 kommer de specifika kraven för varje experiment så småningom att avgöra det bästa sättet att in vivo-visualisering av vävnaden av intresse. Olika fönsterkonstruktioner har olika fördelar och nackdelar och beroende på forskningsfrågan, den tillgängliga mikroskopiinställningen, den nödvändiga rumsliga och tidsmässiga upplösningen och den totala tidsperioden för den studerade processen måste det optimala tillvägagångssättet bestämmas.
Sammanfattningsvis underlättar R.MIW högupplöst karakterisering av celldynamiken under bröstkörtelutveckling, homeostas och sjukdom under flera dagar till veckor.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Research Foundation Flanders (PhD grant fundamental research 11L7222N till M.C.), Boehringer Ingelheim Foundation (PhD Fellowship to C.L.G.J.S), ett EMBO postdoctoral fellowship (bidrag ALTF 1035-2020 till C.L.G.J.S.) och Doctor Josef Steiner Award (till J.v.R).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl | BD | 306573 | Other brands available |
| 10 mm round coverglass | Fisher scientific | 10696365 | Other brands available |
| 5-0 braided silk suturs | Ethicon | W580 | |
| 80% Ethanol | homemade | NA | |
| Anesthesia induction box | Kentscientific | VetFlo-MSEKIT | |
| Buprenorphine (Vetergesic®) | Ecuphar | NA | |
| Cotton tips (sterile) | Fisher scientific | 13113743 | Other brands available |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | NA | Other brands available |
| Eye ointment | Duratears | NA | |
| Flexible butterfly needle | Greiner Bio-One | 450120 | Other brands available |
| Graefe forceps (blunt) | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Kentscientific | RightTemp Jr. | Other brands available |
| Imaging box | Custom made | NA | |
| Infuse nutrient mixture | Braun | Nutriflex special 70/240 | |
| Insulin syringes | BD | 324911 | Other brands available |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane vaporizer | Kentscientific | VetFlo-1231K | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12510-14 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | semi-transparent tape |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Razor blades | Fisher scientific | 11904325 | Other brands available |
| Silicon tubing | Solutions Elastomeres | NA | Any houseware |
| Spring scissors (small) | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Syringe (10 ml) | BD | 305482 | Other brands available |
| Thin forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | |
| Titanium lid for mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Titanium mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Wooden sticks toothpicks | Fisher scientific | NC1678836 | Other brands available |
References
- Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
- Scheele, C. L., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
- Kotsuma, M., et al. Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier. IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).
- Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).
- Entenberg, D., et al. large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).
- Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins. Advances in Intravital Microscopy. , Springer. Netherlands. 187-204 (2014).
- Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
- Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. IntraVital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Niinomi, M. Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods. Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. A global double-fluorescent cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), New York, N.Y. 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Developmental Biology. 9, 49 (2009).
- Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape. Science. 316 (5825), New York, N.Y. 719-723 (2007).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Warren, S. C., et al. Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data. eLife. 7, 35800 (2018).
