Encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes

Yashar Bashirzadeh; Nadab Wubshet; Thomas Litschel; Petra Schwille; Allen P. Liu

doi:10.3791/63332

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Artículo de método

Encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes

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DOI:

10.3791/63332

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10 de noviembre de 2021

Yashar Bashirzadeh^*¹ , Nadab Wubshet^*¹ , Thomas Litschel² , Petra Schwille³ , Allen P. Liu¹^,⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, ²John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, ³Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, ⁴Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁶Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un método simple para la producción expedita de vesículas unilamelares gigantes con proteínas citoesqueléticas encapsuladas. El método demuestra ser útil para la reconstitución ascendente de estructuras citoesqueléticas en confinamiento e interacciones citoesqueleto-membrana.

Resumen

Las vesículas unilamelares gigantes (GUV) se utilizan con frecuencia como modelos de membranas biológicas y, por lo tanto, son una gran herramienta para estudiar los procesos celulares relacionados con la membrana in vitro. En los últimos años, la encapsulación dentro de los GUV ha demostrado ser un enfoque útil para los experimentos de reconstitución en biología celular y campos relacionados. Imita mejor las condiciones de confinamiento dentro de las células vivas, a diferencia de la reconstitución bioquímica convencional. Los métodos para la encapsulación dentro de los GUV a menudo no son fáciles de implementar, y las tasas de éxito pueden diferir significativamente de un laboratorio a otro. Una técnica que ha demostrado ser exitosa para encapsular sistemas de proteínas más complejos se llama encapsulación de cruce de interfaz de gota continua (cDICE). Aquí, se presenta un método basado en cDICE para encapsular rápidamente proteínas citoesqueléticas en GUV con alta eficiencia de encapsulación. En este método, en primer lugar, se generan gotas de lípido-monocapa al emulsionar una solución proteica de interés en una mezcla de lípidos / aceites. Después de ser agregadas a una cámara rotativa impresa en 3D, estas gotas de monocapa lipídica pasan a través de una segunda monocapa lipídica en una interfaz agua/aceite dentro de la cámara para formar GUV que contienen el sistema de proteínas. Este método simplifica el procedimiento general de encapsulación dentro de los GUV y acelera el proceso, y por lo tanto nos permite confinar y observar la evolución dinámica del ensamblaje de la red dentro de las vesículas bicapa lipídicas. Esta plataforma es útil para estudiar la mecánica de las interacciones citoesqueleto-membrana en confinamiento.

Introducción

Los compartimentos bicapa lipídicos se utilizan como células sintéticas modelo para estudiar reacciones orgánicas cerradas y procesos basados en membranas o como módulos portadores en aplicaciones de administración de fármacos ^1,2. La biología de abajo hacia arriba con componentes purificados requiere sistemas experimentales mínimos para explorar propiedades e interacciones entre biomoléculas, como proteínas y lípidos ^3,4. Sin embargo, con el avance del campo, existe una mayor necesidad de sistemas experimentales más complejos que imiten mejor las cond....