Encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes

Los compartimentos bicapa lipídicos se utilizan como células sintéticas modelo para estudiar reacciones orgánicas cerradas y procesos basados en membranas o como módulos portadores en aplicaciones de administración de fármacos ^1,2. La biología de abajo hacia arriba con componentes purificados requiere sistemas experimentales mínimos para explorar propiedades e interacciones entre biomoléculas, como proteínas y lípidos ^3,4. Sin embargo, con el avance del campo, existe una mayor necesidad de sistemas experimentales más complejos que imiten mejor las condiciones en las células biológicas. La encapsulación en GUV es un enfoque práctico que puede ofrecer algunas de estas propiedades similares a las células al proporcionar una bicapa lipídica deformable y selectivamente permeable y un espacio de reacción confinado. En particular, la reconstitución in vitro de sistemas citoesqueléticos, como modelos de células sintéticas, puede beneficiarse de la encapsulación en compartimentos de membrana⁵. Muchas proteínas citoesqueléticas se unen e interactúan con la membrana celular. Como la mayoría de los ensamblajes citoesqueléticos forman estructuras que abarcan la totalidad de la célula, su forma está determinada naturalmente por el confinamiento del tamaño de una célula⁶.

Se utilizan diferentes métodos para generar GUV, como la hinchazón ^7,8, la fusión de vesículas pequeñas ^9,10, la transferencia de emulsión ^11,12, el chorro pulsado¹³ y otros enfoques microfluídicos ^14,15. Aunque estos métodos todavía se utilizan, cada uno tiene sus limitaciones. Por lo tanto, un enfoque robusto y directo con un alto rendimiento de encapsulación GUV es altamente deseable. Aunque técnicas como la hinchazón espontánea y el electroswelling son ampliamente adoptadas para la formación de GUV, estos métodos son principalmente compatibles con composiciones lipídicas específicas¹⁶, tampones de baja concentración de sal¹⁷, tamaño molecular encapsulante más pequeño¹⁸ y requieren un alto volumen del encapsulante. La fusión de múltiples vesículas pequeñas en un GUV es inherentemente energéticamente desfavorable, por lo que requiere especificidad en las composiciones lipídicas cargadas⁹ y / o agentes externos inductores de fusión, como péptidos¹⁹ u otros productos químicos. La transferencia de emulsión y los métodos microfluídicos, por otro lado, pueden requerir la estabilización de gotas a través de la eliminación de surfactantes y solventes después de la formación de bicapas, respectivamente^18,20. La complejidad de la configuración experimental y el dispositivo en técnicas microfluídicas como el chorro pulsado imponen un desafío adicional²¹. cDICE es un método basado en emulsiones derivado de principios similares que rigen la transferencia de emulsión^22,23. Una solución acuosa (solución externa) y una mezcla de lípidos y aceite se estratifican por fuerzas centrífugas en una cámara cilíndrica giratoria (cámara cDICE) formando una interfaz saturada de lípidos. El traslado de gotas acuosas monocapas lipídicas a la cámara cDICE giratoria da como resultado la compresión de una bicapa a medida que las gotas atraviesan la interfaz saturada de lípidos hacia la solución acuosa externa^22,24. El enfoque cDICE es una técnica robusta para la encapsulación GUV. Con el método modificado presentado, no solo se logra el alto rendimiento de vesículas típico de cDICE con un tiempo de encapsulación significativamente más corto (unos pocos segundos), sino que el tiempo de generación de GUV que permite la observación de procesos dependientes del tiempo (por ejemplo, la formación de redes citoesqueléticas de actina) se reduce significativamente. El protocolo tarda unos 15-20 minutos desde el inicio de la recolección de GUV y las imágenes. Aquí, la generación de GUV se describe utilizando el método cDICE modificado para encapsular actina y proteínas de unión a actina (ABP). Sin embargo, la técnica presentada es aplicable para encapsular una amplia gama de reacciones biológicas e interacciones de membrana, desde el ensamblaje de biopolímeros hasta la expresión de proteínas libres de células y la transferencia de carga basada en la fusión de membranas.

1. Preparación de la mezcla de aceite-lípidos

NOTA: El paso debe realizarse en una campana extractora de humos siguiendo todas las pautas de seguridad para el manejo del cloroformo.

1. Tome 0,5 ml de cloroformo en un vial de vidrio de 15 ml. Añadir 88 μL de 25 mg/ml de dioleoil-fosfocolina (DOPC), 9,3 μL de colesterol de 50 mg/ml y 5 μL de 1 mg/ml de dioleoil-fosfoetanolamina-lisamina rodamina B (rodamina PE) (ver Tabla de materiales) en el vial de vidrio de 15 ml.
   NOTA: Las fracciones molares finales de DOPC y colesterol en el aceite de silicona / aceite mineral son 69.9% y 30%, respectivamente. Se estableció que el colesterol 20-30 mol% es una concentración optimizada para la fluidez de la membrana y la estabilidad de los GUV generados utilizando la técnica presentada^25,26. Fisiológicamente, estos valores están dentro del rango de concentración de colesterol que se encuentra en las membranas plasmáticas de células de mamíferos⁶. Las existencias de lípidos se adquieren como soluciones en cloroformo y se almacenan a -20 °C. Los viales de stock de lípidos deben aclimatarse a temperatura ambiente antes de abrirse.
2. Pipetear 7,2 ml de aceite de silicona y 1,8 ml de aceite mineral en un segundo vial de 15 ml (ver Tabla de materiales). En general, esto debe hacerse en una guantera de baja humedad, principalmente si el aceite mineral se reutiliza.
3. Mezcle los aceites mediante vórtice a la velocidad máxima de rotación (3200 rpm) durante 10 s, agregue la mezcla al vial que contiene la mezcla de lípidos en cloroformo y colóquela inmediatamente en el mezclador de vórtice. Vórtice para 10-15 s a la velocidad máxima de rotación (3200 rpm). La mezcla resultante de lípidos en aceite debe estar ligeramente turbia, ya que los lípidos no se disuelven completamente en el aceite, sino que se dispersan como pequeños agregados²⁴.
4. Coloque la dispersión de lípidos en aceite en un sonicador de baño (consulte la Tabla de materiales) con una potencia ultrasónica de 80 W y una frecuencia de funcionamiento de 40 kHz a temperatura ambiente durante 30 min. Utilice la mezcla inmediatamente o guárdela a 4 °C durante un máximo de 24 h.

2. Generación de vesículas

1. Monte el eje impreso en 3D (Archivo suplementario 1) hecho de resina negra (consulte la Tabla de materiales) en la placa de agitación de sobremesa y ajuste la velocidad de rotación a 1200 rpm.
2. Monte la cámara cDICE impresa en 3D (Archivo Complementario 2) hecha de resina transparente (ver Tabla de Materiales) en el eje (Figura 1A, B).
3. Prepare las soluciones de actina y proteínas de unión a actina (ABP) por separado en un volumen total de 20 μL.
   1. Preparar 1-10 μM de actina en tampón de actina globular (G-buffer), incluyendo actina ATTO 488 al 10% (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: 1x G-buffer comprende 5 mM de Tris-HCl, pH 8.0 y 0.2 mM de CaCl₂.
   2. Agregue un tampón filamentoso de polimerización de actina (F-buffer) para comenzar la polimerización de actina en hielo. Mantenga las soluciones en hielo para ralentizar la polimerización de actina antes de la adición de un reticulante.
      NOTA: El 1x F-buffer contiene 50 mM de KCl, 2 mM de MgCl₂ y 3 mM de ATP en 10 mM de Tris, pH 7.5.
   3. Espere 15 minutos para permitir el inicio de la polimerización de actina en hielo antes de agregar reticulantes de interés en la relación molar deseada. Mantenga la solución en hielo hasta la encapsulación.
   4. Prepare las proteínas de unión a actina (ABP) por separado en un microtubo (Figura 1C).
      NOTA: Este paso se realiza cuando una combinación de ABP (por ejemplo, miosina, α-actinina, fasina, complejo Arp2/3) encapsula con actina 25,26,27. En tales casos, la cantidad deseada de cada ABP se extrae de su stock y se agrega al microtubo designado para ABP. Como la solución total debe ser de 20 μL, las alícuotas de ABP deben prepararse de manera que la cantidad deseada de la mezcla total de ABP no exceda de 5-6 μL. El único ABP utilizado en los resultados representativos aquí es la fascina, cuya preparación se menciona a continuación.
      1. Alícuota 1,57 μL de fasina a partir de 1,75 mg/ml de cepa de fasina (ver Tabla de materiales), y añádala directamente a la solución de actina en la etapa 2.7. Esto corresponde a 2,5 μM de fascina en la solución.
4. Agregue un 7,5% del medio de gradiente de densidad (consulte la Tabla de materiales) en la solución de actina para crear un gradiente de densidad entre la fase acuosa externa e interna para facilitar la sedimentación de GUV.
5. Dispensar 700 μL de la solución externa de 200 mM de glucosa en la cámara (Figura 1D, izquierda).
   NOTA: La osmolaridad de la solución interna determina la concentración de glucosa. Para estos experimentos, la osmolaridad de la solución interna es de ~ 200 mOsm, por lo que se utiliza una solución de glucosa de 200 mM como solución externa.
6. Agregue una cantidad suficiente de mezcla de lípidos y aceite (>3 ml según el tamaño de la cámara) en la cámara hasta que se llene el 60% -80% de la cámara (Figura 1D, derecha). Se formará una interfaz entre la mezcla de lípidos y aceite y la solución externa.
7. Transfiera los ABP (preparados en el paso 2.3.4) a la solución de actina. Usando una pipeta regular de 100-1000 μL, transfiera inmediatamente los 700 μL de la mezcla de lípidos y aceite a la mezcla de actina-ABP (Figura 1E, izquierda). Pipetear hacia arriba y hacia abajo 8 veces para generar gotas de lípidos-monocapa del tamaño de una célula con diámetro en el rango de 7-100 μm (Figura 1E, medio).
   NOTA: El paso 2.7 debe completarse en unos segundos para evitar cualquier ensamblaje de red de actina antes de la encapsulación. Por lo tanto, antes de realizar el paso, asegúrese de que las puntas de la pipeta ya estén insertadas en las pipetas y listas para transferir las mezclas.
8. Usando la misma pipeta de 100-1000 μL, dispense inmediatamente toda la emulsión en la cámara giratoria. Las gotas adquirirán una segunda valva de lípidos cruzando la monocapa lipídica en la interfaz aceite-solución externa, formando así GUV (Figura 1E, derecha).
9. Retire la cámara de la placa de agitación y deseche la mayor parte de la mezcla de lípidos y aceite inclinando la cámara en el recipiente de desechos para que una gran parte de la mezcla de lípidos y aceite se drene de la gran abertura en el centro de la cámara.
   NOTA: De esta manera, la mezcla de lípidos y aceites se extrae de la cámara, evitando la mezcla de la mezcla de lípidos y aceites con la solución externa en el siguiente paso.
10. Sostenga la cámara con la tapa mirando hacia el usuario. Abra la tapa de la cámara e incline ligeramente la cámara hacia el usuario. La interfaz entre la solución externa que contiene GUV y la mezcla de lípidos y aceite es visible desde la abertura de la cámara (donde se encuentra la tapa).
11. Usando una pipeta, recolecte suficiente solución externa que contenga GUV y dispense 50-300 μL de la solución externa en una placa de 96 pocillos para obtener una densidad adecuada de GUV.
    NOTA: Siguiendo este protocolo, se liberan un total de aproximadamente 2 x 10⁵ GUV en la solución externa dentro de la cámara. La dispersión de GUV no se cuantificó; sin embargo, el diámetro de aproximadamente el 90% de los GUV está en el rango de 12-30 μm. Los GUV con cualquier diámetro en el rango de 7-50 μm se pueden encontrar en la población. Dependiendo del medio de gradiente de densidad encapsulado, el tamaño de GUV y la profundidad de la solución en la placa del pozo, los GUV tardan de 2 a 15 minutos en asentarse en la superficie. El rendimiento de los GUV con haces de actina reconstituidos es de aproximadamente el 90%.

3. Imágenes y reconstrucción de imágenes 3D

1. Configure la placa de 96 pocillos en el escenario de un microscopio invertido equipado con una unidad confocal de disco giratorio (o escaneo láser), una cámara EMCCD o sCMOS y una lente de objetivo de inmersión en aceite 60x (consulte la Tabla de materiales).
2. Concéntrese en cualquier región de interés (ROI) y tome una secuencia de imágenes z-stack del ROI con un intervalo z-step de 0,5 μm.
   NOTA: Debido a que los GUV pueden desplazarse ligeramente en la superficie con el tiempo, se recomienda capturar un conjunto de imágenes de múltiples longitudes de onda en cada plano z si se están obteniendo imágenes de múltiples fluoróforos, es decir, tomar un grupo de imágenes de 561 nm y 488 nm en cada carril z a la vez para capturar imágenes atto 488 actina y Rhod PE.
3. Guarde cada secuencia de imágenes de la pila z en formato .tiff.
4. Abra una secuencia de imágenes de interés en un software de procesamiento de imágenes (ImageJ/Fiji). Identifica la imagen con la mayor intensidad. Mantenga presionado "ctrl + mayús + c" para abrir la ventana Brillo y contraste y haga clic en Restablecer.
5. En el menú ImageJ/Fiji, vaya a Analizar > establecer escala e introduzca la distancia física conocida y su unidad para cada píxel de imagen.
6. En el menú ImageJ/Fiji, vaya a Image > Stacks > proyecto 3D para reconstruir una imagen 3D a partir de la pila z. Establezca "Método de proyección" como Punto de brillo, "Espaciado de corte (μm)" como 0.5 y marque interpolar. Las opciones predeterminadas se pueden usar para el resto de la configuración.
   NOTA: los intervalos z en algunos microscopios pueden no estar calibrados, y el movimiento real en la dirección z puede diferir ligeramente del intervalo z introducido (es decir, 0,5 μm). En tales casos, se puede utilizar una muestra de calibración 3D, como microesferas fluorescentes con un diámetro conocido, para obtener el intervalo z real. Por lo tanto, este valor se utilizará como "Slice Spacing (μm)" para la proyección 3D.

Para demostrar la generación exitosa de GUV citoesqueléticos utilizando el protocolo actual, se reconstituyeron las estructuras del haz de fasina-actina en guV. La fasina es un reticulador corto de filamentos de actina que forma haces de actina rígidos alineados en paralelo y se purifica de E. coli como proteína de fusión26 de glutatión-S-transferasa (GST). Primero se reconstituyeron 5 μM de actina, incluidos 0,53 μM de actina ATTO488 en el tampón de polimerización de actina y el 7,5% del medio de gradiente de densidad. Al agregar fascin a una concentración de 2.5 μM y encapsular la mezcla de fastina-actina, se formaron estructuras de haz de actina en GUV. Las secuencias de imágenes confocales de la pila Z de las estructuras encapsuladas del haz de actina en los GUV marcados con PE de rodamina se capturaron 1 h después de la encapsulación (Figura 2A). Usando este protocolo, la competencia inherente y la clasificación de los reticulantes de actina encapsulados, α-actinina y fascin, que, juntos, forman diferentes patrones de paquetes de actina de una manera dependiente del tamaño de GUV, se demostró previamente26.

Al igual que el enfoque de emulsión invertida modificada presentado aquí, el proceso cDICE tradicional genera GUV citoesqueléticos con alto rendimiento, pero requiere una bomba de jeringa y una configuración de tubos para la inyección controlada de solución de proteína en la cámara giratoria a bajas tasas de flujo del orden de nanolitros por segundo22,28. En este enfoque, la emulsión se genera directamente en la cámara cDICE giratoria; se inserta un capilar delgado en la fase de aceite. La solución de proteína se inyecta a través de una bomba de jeringa. Las gotas se forman y se cortan en la punta capilar antes de viajar hacia la fase externa acuosa, donde se convierten en GUV, similar al método descrito anteriormente. La Figura 2B muestra vesículas que encapsulan una mezcla de reacción utilizando este enfoque. La mezcla de reacción contiene 6 μM de actina que se agrupa en 0,9 μM de fascin. Aquí, los dos métodos y sus resultados no se están comparando, pero tenga en cuenta que ambos generan un alto rendimiento de GUV.

Figura 1: Configuración experimental para generar GUVs. (A) Vista superior y vista de sección lateral de la cámara cDICE. (B) Fotos de la configuración de la cámara giratoria. (C-E) Ilustraciones esquemáticas de procedimientos paso a paso para la generación de GUVs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Encapsulación de estructuras de fibras de actina. (A) Las imágenes muestran cortes confocales de fluorescencia representativos de GUV (izquierda) y proyecciones máximas de una pila z confocal de canales de actina y lípidos (derecha). Fasina, 2,5 μM; actina, 5 μM (incluyendo 10% ATTO 488 actina). Barra de escala = 10 μm. (B) Encapsulación de estructuras de haces de actina utilizando cDICE convencional. La imagen muestra una proyección máxima representativa de imágenes de fluorescencia confocal de haces de actina encapsulados formados en presencia de fascin. Fasina, 0,9 μM; Actina, 6 μM. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Diseño de eje impreso en 3D. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Diseño para la cámara cDICE impresa en 3D. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.