Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Hurtig indkapsling af rekonstitueret cytoskelet inde i gigantiske unilamellare vesikler

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63332
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1,4,5,6
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 2John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 3Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 6Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikel introducerer en simpel metode til hurtig produktion af gigantiske unilmellære vesikler med indkapslede cytoskeletale proteiner. Metoden viser sig at være nyttig til bottom-up rekonstitution af cytoskeletale strukturer i indespærring og cytoskelet-membraninteraktioner.

Abstract

Gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er) bruges ofte som modeller af biologiske membraner og er derfor et godt værktøj til at studere membranrelaterede cellulære processer in vitro. I de senere år har indkapsling inden for GUV'er vist sig at være en nyttig tilgang til rekonstitutionseksperimenter inden for cellebiologi og beslægtede områder. Det efterligner bedre indespærringsforhold inde i levende celler i modsætning til konventionel biokemisk rekonstitution. Metoder til indkapsling inde i GUV'er er ofte ikke lette at implementere, og succesraten kan variere betydeligt fra laboratorium til laboratorium. En teknik, der har vist sig at være vellykket til indkapsling af mere komplekse proteinsystemer, kaldes kontinuerlig dråbegrænseflade, der krydser indkapsling (cDICE). Her præsenteres en cDICE-baseret metode til hurtigt indkapsling af cytoskeletale proteiner i GUV'er med høj indkapslingseffektivitet. I denne metode genereres først lipid-monolagsdråber ved at emulgere en proteinopløsning af interesse i en lipid / olieblanding. Efter at være blevet tilsat i et roterende 3D-trykt kammer, passerer disse lipid-monolagede dråber derefter gennem et andet lipidmonolag ved en vand / oliegrænseflade inde i kammeret for at danne GUV'er, der indeholder proteinsystemet. Denne metode forenkler den overordnede procedure for indkapsling inden for GUV'er og fremskynder processen og giver os således mulighed for at begrænse og observere den dynamiske udvikling af netværkssamling inde i lipiddobbeltlags vesikler. Denne platform er praktisk til at studere mekanikken i cytoskelet-membraninteraktioner i indespærring.

Introduction

Lipid-dobbeltlagsrum anvendes som syntetiske modelceller til undersøgelse af lukkede organiske reaktioner og membranbaserede processer eller som bærermoduler i lægemiddelleveringsapplikationer 1,2. Bottom-up biologi med oprensede komponenter kræver minimale eksperimentelle systemer til at udforske egenskaber og interaktioner mellem biomolekyler, såsom proteiner og lipider 3,4. Men med udviklingen af feltet er der et øget behov for mere komplekse eksperimentelle systemer, der bedre efterligner betingelserne i biologiske celler. Indkapsling i GUV'er er en praktisk tilgang, der kan tilbyde nogle af disse cellelignende egenskaber ved at tilvejebringe et deformerbart og selektivt permeabelt lipiddobbeltlag og et begrænset reaktionsrum. Især in vitro-rekonstitution af cytoskeletale systemer, som modeller af syntetiske celler, kan drage fordel af indkapsling i membranrum5. Mange cytoskeletale proteiner binder og interagerer med cellemembranen. Da de fleste cytoskeletale samlinger danner strukturer, der spænder over hele cellen, bestemmes deres form naturligt af cellestørrelse indespærring6.

Forskellige metoder anvendes til at generere GUV'er, såsom hævelse 7,8, lille vesikelfusion 9,10, emulsionsoverførsel 11,12, pulserende jetting13 og andre mikrofluidiske tilgange14,15. Selvom disse metoder stadig bruges, har hver sine begrænsninger. Således er en robust og ligetil tilgang med et højt udbytte af GUV-indkapsling yderst ønskelig. Selvom teknikker som spontan hævelse og elektroswelling er bredt anvendt til dannelse af GUV'er, er disse metoder primært kompatible med specifikke lipidsammensætninger16, buffere med lav saltkoncentration17, mindre indkapslingsmiddel molekylær størrelse18 og kræver et stort volumen af indkapslingsmidlet. Sammensmeltning af flere små vesikler til en GUV er i sagens natur energetisk ugunstig, hvilket kræver specificitet i ladede lipidsammensætninger9 og / eller eksterne fusionsinducerende midler, såsom peptider19 eller andre kemikalier. Emulsionsoverførsel og mikrofluidiske metoder kan derimod kræve dråbestabilisering gennem fjernelse af overfladeaktivt stof og opløsningsmiddel efter dannelse af tolag, henholdsvis18,20. Kompleksiteten af eksperimentel opsætning og enhed i mikrofluidiske teknikker såsom pulserende jetting pålægger en yderligere udfordring21. cDICE er en emulsionsbaseret metode afledt af lignende principper for emulsionsoverførsel22,23. En vandig opløsning (ydre opløsning) og en lipid-olieblanding stratificeres af centrifugalkræfter i et roterende cylindrisk kammer (cDICE-kammer), der danner en lipidmættet grænseflade. Shuttling lipid monolayered vandige dråber i det roterende cDICE kammer resulterer i lynlåsning af et dobbeltlag, da dråber krydser den lipidmættede grænseflade ind i den ydre vandige opløsning22,24. cDICE-tilgangen er en robust teknik til GUV-indkapsling. Med den præsenterede modificerede metode opnås ikke kun det høje vesikleudbytte, der er typisk for cDICE med en signifikant kortere indkapslingstid (et par sekunder), men GUV-genereringstid, der muliggør observation af tidsafhængige processer (f.eks. Actin cytoskeletal netværksdannelse) reduceres signifikant. Protokollen tager ca. 15-20 minutter fra starten til GUV-indsamling og billeddannelse. Her beskrives GUV-generering ved hjælp af den modificerede cDICE-metode til indkapsling af actin og actinbindende proteiner (ABP'er). Den præsenterede teknik er imidlertid anvendelig til indkapsling af en bred vifte af biologiske reaktioner og membraninteraktioner, fra samling af biopolymerer til cellefri proteinekspression til membranfusionsbaseret lastoverførsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af olie-lipid-blanding

BEMÆRK: Trinnet skal udføres i en stinkhætte efter alle sikkerhedsretningslinjerne for håndtering af chloroform.

  1. Tag 0,5 ml chloroform i et 15 ml glashætteglas. Der tilsættes 88 μL 25 mg/ml dioleoylphosphocholin (DOPC), 9,3 μL 50 mg/ml kolesterol og 5 μL 1 mg/ml dioleoyl-phosphoethanolamin-lissamin rhodamin B (rhodamin PE) (se materialetabel) i hætteglasset på 15 ml glas.
    BEMÆRK: De sidste molfraktioner af DOPC og kolesterol i silikoneolie / mineralolie er henholdsvis 69,9% og 30%. Det blev fastslået, at 20-30 mol% kolesterol er en optimeret koncentration for membranfluiditet og stabilitet af GUV'er genereret ved anvendelse af den præsenterede teknik25,26. Fysiologisk ligger disse værdier godt inden for kolesterolkoncentrationsintervallet, der findes i pattedyrcelleplasmamembraner6. Lipidlagre erhverves som opløsninger i chloroform og opbevares ved -20 °C. Lipid stock hætteglas bør akklimatiseres til stuetemperatur, før de åbnes.
  2. Pipette 7,2 ml silikoneolie og 1,8 ml mineralolie i et andet 15 ml hætteglas (se materialetabel). Generelt skal dette gøres i en handskeboks med lav luftfugtighed, hovedsageligt hvis mineralolien genbruges.
  3. Bland olierne ved hvirvel ved hvirvel ved den maksimale rotationshastighed (3200 o / min) i 10 s, tilsæt blandingen til hætteglasset, der indeholder lipid-i-chloroformblandingen, og læg den straks på hvirvelblanderen. Vortex i 10-15 s ved den maksimale rotationshastighed (3200 o / min). Den resulterende lipid-i-olie-blanding bør være lidt overskyet, da lipiderne ikke er fuldt opløst i olien, men snarere spredt som små aggregater24.
  4. Sæt lipid-i-olie-dispersionen i en badseksonator (se Tabel over materialer) med ultralydseffekt på 80 W og driftsfrekvens på 40 kHz ved stuetemperatur i 30 minutter. Blandingen anvendes straks eller opbevares ved 4 °C i højst 24 timer.

2. Vesicle generation

  1. Monter den 3D-printede aksel (Supplerende fil 1) lavet af sort harpiks (se materialetabel) på omrøringspladen på bordpladen, og indstil rotationshastigheden til 1200 omdr./min.
  2. Monter det 3D-printede cDICE-kammer (supplerende fil 2) lavet af klar harpiks (se materialetabel) på akslen (figur 1A,B).
  3. Der fremstilles actin- og actinbindende proteiner (ABP) opløsninger separat i et samlet volumen på 20 μL.
    1. Der fremstilles 1-10 μM actin i kugleformet actinbuffer (G-buffer), herunder 10 % ATTO 488 actin (se materialetabel).
      BEMÆRK: 1x G-buffer består af 5 mM Tris-HCl, pH 8,0 og 0,2 mM CaCl2.
    2. Tilsæt trådformede actinpolymerisationsbuffer (F-buffer) for at starte actinpolymerisation på is. Opbevar opløsningerne på is for at bremse actinpolymerisationen inden tilsætning af en tværbinding.
      BEMÆRK: 1x F-bufferen indeholder 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 og 3 mM ATP i 10 mM Tris, pH 7,5.
    3. Vent i 15 minutter for at muliggøre initiering af actinpolymerisation på is, før du tilføjer tværbindinger af interesse ved det ønskede molære forhold. Opbevar opløsningen på is indtil indkapsling.
    4. Forbered aktinbindende proteiner (APP'er) separat i et mikrorør (figur 1C).
      BEMÆRK: Dette trin udføres, når en kombination af ABP'er (f.eks. myosin, α-actinin, fascin, Arp2/3-kompleks) indkapsler med actin 25,26,27. I sådanne tilfælde trækkes den ønskede mængde af hver ABP fra dens lager og tilsættes til det mikrorør, der er udpeget til ABP'er. Da den samlede opløsning skal være 20 μL, skal der fremstilles lageraliquoter af ABP'er, således at den ønskede mængde af den samlede ABP-blanding ikke overstiger 5-6 μL. Den eneste ABP, der anvendes i de repræsentative resultater her, er fascin, hvis fremstilling er nævnt nedenfor.
      1. Aliquot 1,57 μL fascin fra en fascinstamme på 1,75 mg/ml (se materialetabellen) og tilsættes direkte til actinopløsningen i trin 2.7. Dette svarer til 2,5 μM fascin i opløsningen.
  4. Tilsæt 7,5 % densitetsgradientmedium (se tabel over materialer) i actinopløsningen for at skabe en densitetsgradient mellem den ydre og den indre vandige fase for at lette GUV-sedimentering.
  5. Dispensere 700 μL af den ydre opløsning af 200 mM glucose i kammeret (figur 1D, venstre).
    BEMÆRK: Osmolariteten af den indre opløsning bestemmer koncentrationen af glucose. Til disse eksperimenter er osmolariteten af den indre opløsning ~ 200 mOsm, så en 200 mM glucoseopløsning anvendes som den ydre opløsning.
  6. Tilsæt en tilstrækkelig mængde lipid-olieblanding (>3 ml baseret på kammerstørrelsen) i kammeret, indtil 60% -80% af kammeret er fyldt (figur 1D, højre). Der dannes en grænseflade mellem lipid-olieblandingen og den ydre opløsning.
  7. ABP'er (fremstillet i trin 2.3.4) overføres til actinopløsningen. Ved hjælp af en almindelig 100-1000 μL pipette overføres straks 700 μL af lipid-olieblandingen til actin-ABP-blandingen (figur 1E, venstre). Pipette op og ned 8 gange for at generere lipid-monolagsdråber i cellestørrelse med diameter i området 7-100 μm (figur 1E, midten).
    BEMÆRK: Trin 2.7 skal udfyldes på få sekunder for at undgå enhver aktinnetværkssamling inden indkapsling. Før du udfører trinnet, skal du således sikre dig, at pipettespidserne allerede er indsat i pipetterne og klar til at overføre blandingerne.
  8. Ved hjælp af den samme 100-1000 μL pipette skal du straks dispensere hele emulsionen i det roterende kammer. Dråber vil erhverve en anden folder af lipider ved at krydse lipidmonolaget ved olie-ydre opløsningsgrænsefladen og derved danne GUV'er (figur 1E, højre).
  9. Fjern kammeret fra omrøringspladen og kassér det meste af lipidolieblandingen ved at vippe kammeret i affaldsbeholderen, så en stor del af lipid-olieblandingen drænes fra den store åbning i midten af kammeret.
    BEMÆRK: På denne måde trækkes lipid-olieblandingen ud af kammeret og undgår blanding af lipid-olieblanding med den ydre opløsning i næste trin.
  10. Hold kammeret med låget vendt mod brugeren. Åbn kammerlåget, og vip kammeret let mod brugeren. Grænsefladen mellem den ydre opløsning indeholdende GUV'er og lipidolieblandingen er synlig fra kammeråbningen (hvor låget er placeret).
  11. Brug en pipette til at samle tilstrækkelig ydre opløsning indeholdende GUV'er og dispensere 50-300 μL af den ydre opløsning i en 96-brønds plade for at opnå en passende tæthed af GUV'er.
    BEMÆRK: Efter denne protokol frigives i alt ca. 2 x 105 GUV'er i den ydre opløsning inde i kammeret. GUV-dispersiteten blev ikke kvantificeret; diameteren på ca. 90% af GUV'erne ligger imidlertid i området 12-30 μm. GUV'er med enhver diameter i området 7-50 μm kan findes i befolkningen. Afhængigt af det indkapslede densitetsgradientmedium, GUV-størrelse og opløsningsdybde i brøndpladen tager det 2-15 minutter for GUV'er at slå sig ned på overfladen. Udbyttet af GUV'er med rekonstituerede actinbundter er ca. 90%.

3. Billeddannelse og 3D-billedrekonstruktion

  1. Opsæt 96 brøndpladen på scenen i et omvendt mikroskop udstyret med en roterende disk (eller laserscanning) konfokal enhed, et EMCCD eller et sCMOS-kamera og en olienedsænkning 60x objektivlinse (se Materialetabel).
  2. Fokuser på ethvert område af interesse (ROI), og tag en z-stack-billedsekvens fra ROI med et z-trininterval på 0,5 μm.
    BEMÆRK: Fordi GUV'er kan forskydes lidt på overfladen over tid, anbefales det at tage et multibølgelængdesæt af billeder ved hvert z-plan, hvis der afbildes flere fluoroforer, dvs. tage en gruppe på 561 nm og 488 nm billeder ved hver z-bane ad gangen for at fange ATTO 488 actin- og Rhod PE-billeder.
  3. Gem hver z-stack-billedsekvens i .tiff format.
  4. Åbn en billedsekvens af interesse i en billedbehandlingssoftware (ImageJ/Fiji). Identificer billedet med den højeste intensitet. Hold "ctrl + shift + c" nede for at åbne vinduet Lysstyrke og kontrast, og klik på Nulstil.
  5. I menuen ImageJ/Fiji skal du gå til Analysér > Indstil skala og indtaste den kendte fysiske afstand og dens enhed for hver billedpixel.
  6. I menuen ImageJ/Fiji skal du gå til Image > Stacks > 3D-projekt for at rekonstruere et 3D-billede fra z-stakken. Indstil "Projektionsmetode" som lysstyrkepunkt, "Skiveafstand (μm)" som 0,5, og marker Interpolat. Standardindstillingerne kan bruges til resten af indstillingerne.
    BEMÆRK: z-intervaller i nogle mikroskoper kalibreres muligvis ikke, og den faktiske bevægelse i z-retning kan afvige lidt fra det indtastede z-interval (dvs. 0,5 μm). I sådanne tilfælde kan en 3D-kalibreringsprøve, såsom fluorescerende mikrosfærer med en kendt diameter, anvendes til at opnå det faktiske z-interval. Denne værdi vil således blive brugt som "Slice Spacing (μm)" til 3D-projektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at demonstrere den vellykkede generation af cytoskeletale GUV'er ved hjælp af den nuværende protokol blev fascin-actinbundtstrukturer i GUV'er rekonstitueret. Fascin er en kort tværbinding af actinfilamenter, der danner stive paralleljusterede actinbundter og renses fra E. coli som Glutathion-S-Transferase (GST) fusionsprotein26. 5 μM actin blev først rekonstitueret, herunder 0,53 μM ATTO488 actin i actinpolymerisationsbufferen og 7,5% af densitetsgradientmediet. Ved tilsætning af fascin i en koncentration på 2,5 μM og indkapsling af fascin-actinblandingen blev der dannet actinbundtstrukturer i GUV'er. Z-stack konfokale billedsekvenser af de indkapslede actinbundtstrukturer i de rhodamin PE-mærkede GUV'er blev fanget 1 time efter indkapsling (figur 2A). Ved hjælp af denne protokol blev iboende konkurrence og sortering af de indkapslede actin-tværbindinger, α-actinin og fascin, som tilsammen danner forskellige actinbundtmønstre på en GUV-størrelsesafhængig måde, tidligere påvist26.

Ligesom den modificerede inverterede emulsionsmetode, der præsenteres her, genererer den traditionelle cDICE-proces cytoskeletale GUV'er med højt udbytte, men kræver alligevel en sprøjtepumpe og slangeopsætning til kontrolleret injektion af proteinopløsning i det roterende kammer ved lave strømningshastigheder i størrelsesordenen nanoliter pr. Sekund22,28. I denne fremgangsmåde genereres emulsionen direkte i det roterende cDICE-kammer; en tynd kapillær indsættes i oliefasen. Proteinopløsningen injiceres gennem en sprøjtepumpe. Dråber dannes og skæres af ved kapillærspidsen, før de bevæger sig mod den vandige ydre fase, hvor de bliver til GUV'er, svarende til den ovenfor beskrevne metode. Figur 2B viser vesikler, der indkapsler en reaktionsblanding ved hjælp af denne fremgangsmåde. Reaktionsblandingen indeholder 6 μM actin, som er bundtet af 0,9 μM fascin. Her sammenlignes de to metoder og deres resultater ikke, men bemærk, at de begge genererer et højt udbytte af GUV'er.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel opsætning til generering af GUV'er. (A) Topvisning og sidesektionsvisning af cDICE-kammeret. (B) Billeder af opsætningen af spindekammeret. (C-E) Skematiske illustrationer af trinvise procedurer for generering af GUV'er. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Indkapsling af actinbundtstrukturer. (A) Billederne viser repræsentative fluorescenskonfokale skiver af GUV'er (venstre) og maksimale fremspring af en konfokal z-stak af actin- og lipidkanaler (højre). Fascin, 2,5 μM; actin, 5 μM (herunder 10% ATTO 488 actin). Skalastang = 10 μm. (B) Indkapsling af actinbundtstrukturer ved hjælp af konventionel cDICE. Billedet viser en repræsentativ maksimal projektion af konfokale fluorescensbilleder af indkapslede actinbundter dannet i nærvær af fascin. Fascin, 0,9 μM; Actin, 6 μM. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: 3D-trykt akseldesign. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Design til det 3D-printede cDICE-kammer. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskellige metoder til generering af GUV'er er blevet undersøgt til oprettelse af syntetiske celler Imidlertid er kompleksiteten af procedurerne, forlænget tid til at opnå indkapsling, begrænsning af lipidtyper og molekylær sammensætning af indkapslingsmiddel, behov for ikke-fysiologiske kemikalier til at lette indkapsling, lavt GUV-udbytte og uoverensstemmelser i indkapslingseffektiviteten fortsat udfordre forskere på dette område. I betragtning af den brede vifte af potentielle undersøgelser, der kan påbegyndes i bottom-up syntetisk biologi, kan en sømløs GUV-indkapslingsmetode med høj gennemstrømning, der er kompatibel med forskellige lipidsammensætninger og kan indkapsle alle molekyler uanset størrelse, anspore nye muligheder for at studere komplekse biomimiksyntetiske systemer. cDICE-metoden har elimineret de fleste udfordringer og begrænsninger, der er forbundet med tidligere GUV-genereringsmetoder.

Tilgangen og de styrende principper til generering af GUV'er ved hjælp af cDICE-metoden går forud for platformen og er blevet implementeret i tidligere teknikker såsom den omvendte emulsionsoverførsel12. Imidlertid har den omvendte emulsionsoverførselsmetode begrænsninger såsom lavt vesikkeludbytte og heterogenitet af vesikler. For cDICE-metoden, der præsenteres her, dispergeres lipider i olie i form af aggregater på snesevis af nanometer (størrelsen af lipidaggregatet afhænger af den samlede koncentration af lipider)24. Dispersion af lipider er i to blandbare olier, hvor en (mineralolie) kan opløse lipider og en anden olie (siliciumolie), der ikke er blandbar med lipider. Dette skaber lipidaggregat coacervates ved hjælp af opløsningsmiddelforskydning29. Denne særlige dispersionsmetode letter øjeblikkelig monolagsmætning af vandige dråber og hurtigere fornyelse af lipider ved den olie-vandige grænseflade, da vandige dråber kontinuerligt krydser den lipidmættede olie-vandige grænseflade. Dette forbedrer også efterfølgende dobbeltlagslynlåsning for at danne GUV'er og øger GUV-gennemstrømningen. Centrifugalkræfterne, der genereres af det roterende kammer, er optimale til at stritle polydispergede dråber over den lipidmættede grænseflade. Den oprindelige version af cDICE-metoden bruger en mikrokapillær dyse til at injicere den indre opløsning i olie-lipidblandingen. I denne tilgang genererer forskydningskræfter skabt af den roterende olie-lipidblanding vandige dråber, der til sidst omdannes til GUV'er som beskrevet. Men med det formål at reducere den tid, det tager at forberede injektionsplatformen, især kritisk for hurtige reaktioner, såsom actinnetværkssamling og potentiel tilstopning af mikrokapillæren, genereres vandige dråber med lipidmonolag nu ved at tilsætte olie-lipidblandingen direkte til den indre opløsning og pipettere op og ned. Denne fremgangsmåde eliminerer tidsforsinkelsen i GUV-indkapsling til et hurtigt reaktionseksperiment.

Blandt de udfordringer, der er forårsaget af tidligere GUV-genereringsmetoder, er begrænsningen af lipidtyper (ladning af lipid og fase af lipid) afhængigt af teknikken til GUV-generering. Flere lipidtyper, herunder DOPC, dioleoyl-glycero-hosphoserin (DOPS), dioleoyl-glycerosuccinat (DGS), dimyristoyl-glycero-phosphocholin (DMPC) og kombinationer af forskellige lipider og kolesterol i varierende koncentrationer blev testet. Under alle forhold er cDICE-metoden vist at danne GUV'er med en høj indkapslingseffektivitet ved et konsekvent højt GUV-udbytte. Desuden har cDICE-metoden også vist sig effektivt at indkapsle forskellige cellulære komponenter, herunder cytoskeletale proteiner, cellefri ekspressionsreaktioner, trængselsmidler, farvestoffer og andre cellulære molekyler i forskellige størrelser uden tab af indkapslingseffektivitet eller nedsat gennemstrømning. Desuden kan den modificerede cDICE ligesom normale inverterede emulsionsoverførselsmetoder30 potentielt tillade generering af asymmetriske GUV'er til fremtidigt arbejde. Forskellige lipidsammensætninger kan bruges til den indre folder og den ydre folder, da monolagsdråber dannes separat (inde i et mikrorør ved pipettering op og ned), inden dobbeltlaget lynes inde i cDICE-kammeret. Sedimentering af lipider observeres, når lipid-olieblandingen holdes længe; dog kan man simpelthen hvirvle lipid-olieblandingen før indkapsling for at sprede lipidaggregater igen. Det er vigtigt at bemærke, at indkapslingskvaliteten kan blive kompromitteret, når lipid-olieblandingerne holdes længere, som indikeret af mere signifikante end sædvanlige lipidaggregater i lipid-olieblandingen. Selvom de ikke er testet, kan disse aggregater potentielt resultere i ufuldkommenhed i dobbeltlagslynlåsning, og aggregaterne kan også ende med at blive indkapslet med indre opløsning, der kompromitterer det ønskede kemiske miljø.

Begrænsningen af den præsenterede modificerede tilgang til dannelse af vandige dråber er at skabe ensartethed i størrelsen af dråber. Selvom dette kan forbedres ved at anvende mikrokapillær injektion af indre opløsning ved forskellige strømningshastigheder for at regulere GUV-størrelser, er det mindre ønskeligt at overvåge hurtige reaktioner som actinsamling i indkapslede GUV'er. Ved at lave dråber ved at pipettere op og ned, der resulterer i forskellige GUV-størrelser, kan man analysere populationer af samme størrelse vesikler. Bekymringer om mulig olieretention i dobbeltlag hindrer vedtagelsen af de fleste GUV-genereringsteknikker, herunder emulsionsbaserede GUV-genereringsteknikker såsom cDICE21. Den resterende mængde olie i membranen kan dog reduceres ved anvendelse af organiske agenser såsom 1-octanol, som kan fjernes efter generering af vesiklerne31,32. Fremtidige ændringer af metoden, eventuelt ved at ændre opløsningsmiddelsammensætningen, skal undersøges.

Der er mange områder i bottom-up syntetisk biologi, der endnu ikke skal undersøges og måske kræver celleefterlignende indespærringer af GUV'er. Sådanne eksperimentelle bestræbelser nødvendiggør GUV-generationsplatforme som cDICE for at generere GUV'er robust, samtidig med at de effektivt indkapsler forskellige molekyler af interesse. Mange cellulære processer forekommer hurtigere end den tid, det tager at indkapsle molekyler ved hjælp af tidligere GUV-genereringsteknikker. Som beskrevet her indkapsles actinopløsninger hurtigt nok til at observere vesikledeformation som følge af actinnetværkssamling. Sådanne syntetiske celler med rekonstitueret actincytoskelet har afsløret træk ved actinnetværksorganisation i nærværelse af forskellige tværbindinger 5,25,33 og membranombygning 25,27,28. De vil inspirere til fremtidigt arbejde med at skabe mere sofistikerede syntetiske celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

APL anerkender støtte fra et Humboldt Research Fellowship for Erfarne Forskere og fra National Science Foundation (1939310 and 1817909) og National Institutes of Health (R01 EB030031).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase ThermoFisher Scientific 165305
Actin from rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle Hypermol 8153-01
Axygen microtubes (200 µL) Fisher Scientific 14-222-262 for handling ABPs
Black resin Formlabs RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder) Avanti Polar Lipids 700100P
Choloroform Sigma Aldrich 67-66-3
Clear resin Formlabs RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit YOKOGAWA CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep) Sigma-Aldrich D1556
DOPC lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 850375C
Fascin homemade N/A
F-buffer homemade N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129
FS02 Sonicator Fischer Scientific FS20
G-buffer homemade N/A
Glucose Sigma-Aldrich 158968
iXon X3 camera Andor DU-897E-CS0
Mineral oil Acros Organics 8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective Olumpus 1-U2B933
Silicone oil Sigma-Aldrich 317667

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
  2. Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
  3. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  4. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
  5. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  6. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  8. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
  9. Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).
  10. Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
  11. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
  12. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  15. Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
  16. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  17. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  18. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  19. Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).
  20. Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
  21. Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
  22. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  23. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  24. Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
  25. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
  26. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
  27. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
  28. Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
  29. Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  31. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  32. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  33. Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).

Tags

Bioengineering Udgave 177 Emulsionsoverførsel cDICE GUV'er bottom-up rekonstitution actin fascin
Hurtig indkapsling af rekonstitueret cytoskelet inde i gigantiske unilamellare vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bashirzadeh, Y., Wubshet, N.,… More

Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (177), e63332, doi:10.3791/63332 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter