Name: Encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprende a encapsular proteínas del citoesqueleto en vesículas unilamelares gigantes mediante una técnica rápida que reduce el tiempo de generación respecto al método cDICE convencional.

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APL reconoce el apoyo de una beca de investigación Humboldt para investigadores experimentados y de la Fundación Nacional de Ciencias (1939310 y 1817909) y los Institutos Nacionales de Salud (R01 EB030031).

1. Preparación de la mezcla de aceite-lípidos
NOTA: El paso debe realizarse en una campana extractora de humos siguiendo todas las pautas de seguridad para el manejo del cloroformo.
<ol><li>Tome 0,5 ml de cloroformo en un vial de vidrio de 15 ml. Añadir 88 μL de 25 mg/ml de dioleoil-fosfocolina (DOPC), 9,3 μL de colesterol de 50 mg/ml y 5 μL de 1 mg/ml de dioleoil-fosfoetanolamina-lisamina rodamina B (rodamina PE) (ver Tabla de materiales) en el vial de vidrio de 15 ml. NOTA: Las fracciones molares finales de DOPC y colesterol en el aceite de silicona / aceite mineral son 69.9% y 30%, respectivamente. Se estableció que el colesterol 20-30 mol% es una concentración optimizada para la fluidez de la membrana y la estabilidad de los GUV generados utilizando la técnica presentada25,26. Fisiológicamente, estos valores están dentro del rango de concentración de colesterol que se encuentra en las membranas plasmáticas de células de mamíferos6. Las existencias de lípidos se adquieren como soluciones en cloroformo y se almacenan a -20 °C. Los viales de stock de lípidos deben aclimatarse a temperatura ambiente antes de abrirse.</li>
	<li>Pipetear 7,2 ml de aceite de silicona y 1,8 ml de aceite mineral en un segundo vial de 15 ml (ver Tabla de materiales). En general, esto debe hacerse en una guantera de baja humedad, principalmente si el aceite mineral se reutiliza.</li>
	<li>Mezcle los aceites mediante vórtice a la velocidad máxima de rotación (3200 rpm) durante 10 s, agregue la mezcla al vial que contiene la mezcla de lípidos en cloroformo y colóquela inmediatamente en el mezclador de vórtice. Vórtice para 10-15 s a la velocidad máxima de rotación (3200 rpm). La mezcla resultante de lípidos en aceite debe estar ligeramente turbia, ya que los lípidos no se disuelven completamente en el aceite, sino que se dispersan como pequeños agregados24.</li>
	<li>Coloque la dispersión de lípidos en aceite en un sonicador de baño (consulte la Tabla de materiales) con una potencia ultrasónica de 80 W y una frecuencia de funcionamiento de 40 kHz a temperatura ambiente durante 30 min. Utilice la mezcla inmediatamente o guárdela a 4 °C durante un máximo de 24 h.</li>
</ol>2. Generación de vesículas
<ol><li>Monte el eje impreso en 3D (Archivo suplementario 1) hecho de resina negra (consulte la Tabla de materiales) en la placa de agitación de sobremesa y ajuste la velocidad de rotación a 1200 rpm.</li>
	<li>Monte la cámara cDICE impresa en 3D (Archivo Complementario 2) hecha de resina transparente (ver Tabla de Materiales) en el eje (Figura 1A, B).</li>
	<li>Prepare las soluciones de actina y proteínas de unión a actina (ABP) por separado en un volumen total de 20 μL.<ol>
<li>Preparar 1-10 μM de actina en tampón de actina globular (G-buffer), incluyendo actina ATTO 488 al 10% (ver Tabla de Materiales). NOTA: 1x G-buffer comprende 5 mM de Tris-HCl, pH 8.0 y 0.2 mM de CaCl2.</li>
		<li>Agregue un tampón filamentoso de polimerización de actina (F-buffer) para comenzar la polimerización de actina en hielo. Mantenga las soluciones en hielo para ralentizar la polimerización de actina antes de la adición de un reticulante. NOTA: El 1x F-buffer contiene 50 mM de KCl, 2 mM de MgCl2 y 3 mM de ATP en 10 mM de Tris, pH 7.5.</li>
		<li>Espere 15 minutos para permitir el inicio de la polimerización de actina en hielo antes de agregar reticulantes de interés en la relación molar deseada. Mantenga la solución en hielo hasta la encapsulación.</li>
		<li>Prepare las proteínas de unión a actina (ABP) por separado en un microtubo (Figura 1C). NOTA: Este paso se realiza cuando una combinación de ABP (por ejemplo, miosina, α-actinina, fasina, complejo Arp2/3) encapsula con actina 25,26,27. En tales casos, la cantidad deseada de cada ABP se extrae de su stock y se agrega al microtubo designado para ABP. Como la solución total debe ser de 20 μL, las alícuotas de ABP deben prepararse de manera que la cantidad deseada de la mezcla total de ABP no exceda de 5-6 μL. El único ABP utilizado en los resultados representativos aquí es la fascina, cuya preparación se menciona a continuación.<ol>
<li>Alícuota 1,57 μL de fasina a partir de 1,75 mg/ml de cepa de fasina (ver Tabla de materiales), y añádala directamente a la solución de actina en la etapa 2.7. Esto corresponde a 2,5 μM de fascina en la solución.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Agregue un 7,5% del medio de gradiente de densidad (consulte la Tabla de materiales) en la solución de actina para crear un gradiente de densidad entre la fase acuosa externa e interna para facilitar la sedimentación de GUV.</li>
	<li>Dispensar 700 μL de la solución externa de 200 mM de glucosa en la cámara (Figura 1D, izquierda). NOTA: La osmolaridad de la solución interna determina la concentración de glucosa. Para estos experimentos, la osmolaridad de la solución interna es de ~ 200 mOsm, por lo que se utiliza una solución de glucosa de 200 mM como solución externa.</li>
	<li>Agregue una cantidad suficiente de mezcla de lípidos y aceite (>3 ml según el tamaño de la cámara) en la cámara hasta que se llene el 60% -80% de la cámara (Figura 1D, derecha). Se formará una interfaz entre la mezcla de lípidos y aceite y la solución externa.</li>
	<li>Transfiera los ABP (preparados en el paso 2.3.4) a la solución de actina. Usando una pipeta regular de 100-1000 μL, transfiera inmediatamente los 700 μL de la mezcla de lípidos y aceite a la mezcla de actina-ABP (Figura 1E, izquierda). Pipetear hacia arriba y hacia abajo 8 veces para generar gotas de lípidos-monocapa del tamaño de una célula con diámetro en el rango de 7-100 μm (Figura 1E, medio). NOTA: El paso 2.7 debe completarse en unos segundos para evitar cualquier ensamblaje de red de actina antes de la encapsulación. Por lo tanto, antes de realizar el paso, asegúrese de que las puntas de la pipeta ya estén insertadas en las pipetas y listas para transferir las mezclas.</li>
	<li>Usando la misma pipeta de 100-1000 μL, dispense inmediatamente toda la emulsión en la cámara giratoria. Las gotas adquirirán una segunda valva de lípidos cruzando la monocapa lipídica en la interfaz aceite-solución externa, formando así GUV (Figura 1E, derecha).</li>
	<li>Retire la cámara de la placa de agitación y deseche la mayor parte de la mezcla de lípidos y aceite inclinando la cámara en el recipiente de desechos para que una gran parte de la mezcla de lípidos y aceite se drene de la gran abertura en el centro de la cámara. NOTA: De esta manera, la mezcla de lípidos y aceites se extrae de la cámara, evitando la mezcla de la mezcla de lípidos y aceites con la solución externa en el siguiente paso.</li>
	<li>Sostenga la cámara con la tapa mirando hacia el usuario. Abra la tapa de la cámara e incline ligeramente la cámara hacia el usuario. La interfaz entre la solución externa que contiene GUV y la mezcla de lípidos y aceite es visible desde la abertura de la cámara (donde se encuentra la tapa).</li>
	<li>Usando una pipeta, recolecte suficiente solución externa que contenga GUV y dispense 50-300 μL de la solución externa en una placa de 96 pocillos para obtener una densidad adecuada de GUV. NOTA: Siguiendo este protocolo, se liberan un total de aproximadamente 2 x 105 GUV en la solución externa dentro de la cámara. La dispersión de GUV no se cuantificó; sin embargo, el diámetro de aproximadamente el 90% de los GUV está en el rango de 12-30 μm. Los GUV con cualquier diámetro en el rango de 7-50 μm se pueden encontrar en la población. Dependiendo del medio de gradiente de densidad encapsulado, el tamaño de GUV y la profundidad de la solución en la placa del pozo, los GUV tardan de 2 a 15 minutos en asentarse en la superficie. El rendimiento de los GUV con haces de actina reconstituidos es de aproximadamente el 90%.</li>
</ol>3. Imágenes y reconstrucción de imágenes 3D
<ol><li>Configure la placa de 96 pocillos en el escenario de un microscopio invertido equipado con una unidad confocal de disco giratorio (o escaneo láser), una cámara EMCCD o sCMOS y una lente de objetivo de inmersión en aceite 60x (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Concéntrese en cualquier región de interés (ROI) y tome una secuencia de imágenes z-stack del ROI con un intervalo z-step de 0,5 μm. NOTA: Debido a que los GUV pueden desplazarse ligeramente en la superficie con el tiempo, se recomienda capturar un conjunto de imágenes de múltiples longitudes de onda en cada plano z si se están obteniendo imágenes de múltiples fluoróforos, es decir, tomar un grupo de imágenes de 561 nm y 488 nm en cada carril z a la vez para capturar imágenes atto 488 actina y Rhod PE.</li>
	<li>Guarde cada secuencia de imágenes de la pila z en formato .tiff.</li>
	<li>Abra una secuencia de imágenes de interés en un software de procesamiento de imágenes (ImageJ/Fiji). Identifica la imagen con la mayor intensidad. Mantenga presionado "ctrl + mayús + c" para abrir la ventana Brillo y contraste y haga clic en Restablecer.</li>
	<li>En el menú ImageJ/Fiji, vaya a Analizar > establecer escala e introduzca la distancia física conocida y su unidad para cada píxel de imagen.</li>
	<li>En el menú ImageJ/Fiji, vaya a Image > Stacks > proyecto 3D para reconstruir una imagen 3D a partir de la pila z. Establezca "Método de proyección" como Punto de brillo, "Espaciado de corte (μm)" como 0.5 y marque interpolar. Las opciones predeterminadas se pueden usar para el resto de la configuración. NOTA: los intervalos z en algunos microscopios pueden no estar calibrados, y el movimiento real en la dirección z puede diferir ligeramente del intervalo z introducido (es decir, 0,5 μm). En tales casos, se puede utilizar una muestra de calibración 3D, como microesferas fluorescentes con un diámetro conocido, para obtener el intervalo z real. Por lo tanto, este valor se utilizará como "Slice Spacing (μm)" para la proyección 3D.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Se han explorado diferentes métodos de generación de GUV para la creación de células sintéticas Sin embargo, la complejidad de los procedimientos, el tiempo prolongado para lograr la encapsulación, la restricción de los tipos de lípidos y la composición molecular del encapsulante, la necesidad de productos químicos no fisiológicos para facilitar la encapsulación, el bajo rendimiento de GUV y las inconsistencias en la eficiencia de la encapsulación han seguido desafiando a los investigadores en este campo. Teniendo en cue...

Los compartimentos bicapa lipídicos se utilizan como células sintéticas modelo para estudiar reacciones orgánicas cerradas y procesos basados en membranas o como módulos portadores en aplicaciones de administración de fármacos 1,2. La biología de abajo hacia arriba con componentes purificados requiere sistemas experimentales mínimos para explorar propiedades e interacciones entre biomoléculas, como proteínas y lípidos 3,4. Sin embargo, con el avance del campo, existe una mayor necesidad de sistemas experimentales más complejos que imiten mejor las condiciones en las células biológicas. La encapsulación en GUV es un enfoque práctico que puede ofrecer algunas de estas propiedades similares a las células al proporcionar una bicapa lipídica deformable y selectivamente permeable y un espacio de reacción confinado. En particular, la reconstitución in vitro de sistemas citoesqueléticos, como modelos de células sintéticas, puede beneficiarse de la encapsulación en compartimentos de membrana5. Muchas proteínas citoesqueléticas se unen e interactúan con la membrana celular. Como la mayoría de los ensamblajes citoesqueléticos forman estructuras que abarcan la totalidad de la célula, su forma está determinada naturalmente por el confinamiento del tamaño de una célula6.
Se utilizan diferentes métodos para generar GUV, como la hinchazón 7,8, la fusión de vesículas pequeñas 9,10, la transferencia de emulsión 11,12, el chorro pulsado13 y otros enfoques microfluídicos 14,15. Aunque estos métodos todavía se utilizan, cada uno tiene sus limitaciones. Por lo tanto, un enfoque robusto y directo con un alto rendimiento de encapsulación GUV es altamente deseable. Aunque técnicas como la hinchazón espontánea y el electroswelling son ampliamente adoptadas para la formación de GUV, estos métodos son principalmente compatibles con composiciones lipídicas específicas16, tampones de baja concentración de sal17, tamaño molecular encapsulante más pequeño18 y requieren un alto volumen del encapsulante. La fusión de múltiples vesículas pequeñas en un GUV es inherentemente energéticamente desfavorable, por lo que requiere especificidad en las composiciones lipídicas cargadas9 y / o agentes externos inductores de fusión, como péptidos19 u otros productos químicos. La transferencia de emulsión y los métodos microfluídicos, por otro lado, pueden requerir la estabilización de gotas a través de la eliminación de surfactantes y solventes después de la formación de bicapas, respectivamente18,20. La complejidad de la configuración experimental y el dispositivo en técnicas microfluídicas como el chorro pulsado imponen un desafío adicional21. cDICE es un método basado en emulsiones derivado de principios similares que rigen la transferencia de emulsión22,23. Una solución acuosa (solución externa) y una mezcla de lípidos y aceite se estratifican por fuerzas centrífugas en una cámara cilíndrica giratoria (cámara cDICE) formando una interfaz saturada de lípidos. El traslado de gotas acuosas monocapas lipídicas a la cámara cDICE giratoria da como resultado la compresión de una bicapa a medida que las gotas atraviesan la interfaz saturada de lípidos hacia la solución acuosa externa22,24. El enfoque cDICE es una técnica robusta para la encapsulación GUV. Con el método modificado presentado, no solo se logra el alto rendimiento de vesículas típico de cDICE con un tiempo de encapsulación significativamente más corto (unos pocos segundos), sino que el tiempo de generación de GUV que permite la observación de procesos dependientes del tiempo (por ejemplo, la formación de redes citoesqueléticas de actina) se reduce significativamente. El protocolo tarda unos 15-20 minutos desde el inicio de la recolección de GUV y las imágenes. Aquí, la generación de GUV se describe utilizando el método cDICE modificado para encapsular actina y proteínas de unión a actina (ABP). Sin embargo, la técnica presentada es aplicable para encapsular una amplia gama de reacciones biológicas e interacciones de membrana, desde el ensamblaje de biopolímeros hasta la expresión de proteínas libres de células y la transferencia de carga basada en la fusión de membranas.

<table><tbody><tr><td>Lípido 18:1 Liss Rhod PE en cloroformo</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>810150C</td><td></td></tr><tr><td>Base polimérica óptica Btm de 96 pozos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Actina del músculo esquelético del conejo</td><td></td><td>Citoesqueleto AKL99-A</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488-actina del músculo esquelético del conejo</td><td>Hypermol</td><td>8153-01</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos Axygen (200 &; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-262</td><td>para el manejo de ABPs</td></tr><tr><td>Resina negra</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPBK-04</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol (polvo)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700100P</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Resina transparente</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Unidad de escáner confocal</td><td>YOKOGAWA</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Medio de gradiente de densidad (Optiprep)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Lípido DOPC en cloroformo</td><td>Avanti Lípidos polares</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Fascin</td><td>casero</td><td>N/A Tampón</td><td></td></tr><tr><td>F</td><td>casero</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos Fisherbrand (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>FS02 Sonicador</td><td>Fischer Scientific</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>Tampón G</td><td>casero</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 cámara</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Acros Organics</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX21</td><td></td></tr><tr><td>Olympus PlanApo N 60x Aceite Microscopio Objetivo</td><td>Olumpus</td><td>1-U2B933</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de silicona</td><td>Sigma-Aldrich 317667</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes

Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Las vesículas unilamelares gigantes (GUV) se utilizan con frecuencia como modelos de membranas biológicas y, por lo tanto, son una gran herramienta para estudiar los procesos celulares relacionados con la membrana in vitro. En los últimos años, la encapsulación dentro de los GUV ha demostrado ser un enfoque útil para los experimentos de reconstitución en biología celular y campos relacionados. Imita mejor las condiciones de confinamiento dentro de las células vivas, a diferencia de la reconstitución bioquímica convencional. Los métodos para la encapsulación dentro de los GUV a menudo no son fáciles de implementar, y las tasas de éxito pueden diferir significativamente de un laboratorio a otro. Una técnica que ha demostrado ser exitosa para encapsular sistemas de proteínas más complejos se llama encapsulación de cruce de interfaz de gota continua (cDICE). Aquí, se presenta un método basado en cDICE para encapsular rápidamente proteínas citoesqueléticas en GUV con alta eficiencia de encapsulación. En este método, en primer lugar, se generan gotas de lípido-monocapa al emulsionar una solución proteica de interés en una mezcla de lípidos / aceites. Después de ser agregadas a una cámara rotativa impresa en 3D, estas gotas de monocapa lipídica pasan a través de una segunda monocapa lipídica en una interfaz agua/aceite dentro de la cámara para formar GUV que contienen el sistema de proteínas. Este método simplifica el procedimiento general de encapsulación dentro de los GUV y acelera el proceso, y por lo tanto nos permite confinar y observar la evolución dinámica del ensamblaje de la red dentro de las vesículas bicapa lipídicas. Esta plataforma es útil para estudiar la mecánica de las interacciones citoesqueleto-membrana en confinamiento.

Para demostrar la generación exitosa de GUV citoesqueléticos utilizando el protocolo actual, se reconstituyeron las estructuras del haz de fasina-actina en guV. La fasina es un reticulador corto de filamentos de actina que forma haces de actina rígidos alineados en paralelo y se purifica de E. coli como proteína de fusión26 de glutatión-S-transferasa (GST). Primero se reconstituyeron 5 μM de actina, incluidos 0,53 μM de actina ATTO488 en el tampón de polimerización de actina y el 7,5% del...

Este artículo presenta un método simple para la producción expedita de vesículas unilamelares gigantes con proteínas citoesqueléticas encapsuladas. El método demuestra ser útil para la reconstitución ascendente de estructuras citoesqueléticas en confinamiento e interacciones citoesqueleto-membrana.

Encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular ...

En los últimos años, la encapsulación dentro de vesículas bicapa lipídicas del tamaño de una célula ha demostrado ser un método útil para experimentos de reconstitución in vitro. El método que presentamos ayudará en gran medida con la reconstitución del citoesqueleto en la investigación de células sintéticas. Con este método, podemos generar vesículas unilamelares gigantes de tamaño heterogéneo con un alto rendimiento.El tiempo de generación de vesículas se reduce significativamente en comparación con la técnica cDICE convencional. Podemos encapsular sistemas de transcripción-traducción libres de células aislados de procesos celulares complejos y simultáneos para examinar las vías moleculares. Este método se puede utilizar para ensamblar protocélulas mínimas hacia la creación de células sintéticas funcionales.Comience a preparar una mezcla de aceite y lípidos transfiriendo dioleoil-fosfocolina, colesterol y rodamina PE a un vial de vidrio de 15 mililitros. Luego, agregue 0.5 mililitros de cloroformo en el vial. Pipetee 7.2 mililitros de aceite de silicona y 1.8 mililitros de aceite mineral en un tubo separado de 15 mililitros y mezcle los aceites vórtice a una velocidad de 3, 200 rotaciones por minuto durante 10 segundos.Luego, agregue la mezcla de aceite al vial que contiene la mezcla de lípidos y cloroformo y vórtice la mezcla a la velocidad de 3, 200 rotaciones por minuto durante 10 a 15 segundos hasta que la mezcla resultante de lípidos en aceite esté ligeramente turbia, ya que los lípidos no se disuelven completamente en el aceite. A continuación, sonice el lípido en la dispersión del aceite en un sonicador de baño con potencia ultrasónica de 80 vatios y una frecuencia de funcionamiento de 40 kilohercios durante 30 minutos a temperatura ambiente. Si no se usa inmediatamente, guarde la mezcla de lípidos y aceite a cuatro grados Celsius durante 24 horas.Para generar las vesículas, use el conjunto con un eje impreso en 3D hecho de resina negra montado en la placa de agitación de sobremesa a la velocidad de 1, 200 rotaciones por minuto. Luego, monte la encapsulación de cruce de interfaz de gota continua impresa en 3D, o cámara cDICE, hecha de resina transparente en el eje de resina negra. Prepare una solución de actina de 1 a 10 micromolares en tampón de actina globular, o tampón G, incluida la actina ATO 488 al 10%.Para comenzar la polimerización de actina, agregue un tampón de polimerización de actina filamentosa, o tampón F, en una solución de actina sobre hielo y luego mantenga las soluciones en hielo para ralentizar la polimerización de actina antes de agregar un reticulador. Para preparar las proteínas de unión a actina, o ABP, a partir de 1,75 miligramos por mililitro de stock de fascin, alícuota 1,57 microlitros de fascin en un microtubo separado. A continuación, agregue un 7,5% de medio de gradiente de densidad en la solución de actina para crear un gradiente de densidad entre la fase acuosa externa e interna y facilitar la sedimentación de vesículas unilamelares gigantes o GUV.Luego, dispense 700 microlitros de glucosa 200 milimolares como solución externa en la cámara. Agregue suficiente mezcla de lípidos y aceite en la cámara hasta que se llene del 60% al 80% de la cámara. Se formará una interfaz entre la mezcla de lípidos y aceite y la solución externa.Prepare una mezcla de actina-ABP transfiriendo ABP a la solución de actina. Luego, use una pipeta regular de 100 a 1, 000 microlitros para transferir los 700 microlitros de la mezcla de lípidos y aceite a la mezcla de actina-ABP. Pipete hacia arriba y hacia abajo ocho veces para generar gotas de emulsión monocapa lipídica del tamaño de una célula con un diámetro de 7 a 100 micras.Use la misma pipeta de 100 a 1, 000 microlitros para dispensar toda la emulsión en la cámara giratoria. Las gotas adquirirán una segunda valva de lípidos cruzando la monocapa lipídica en la interfaz aceite-solución externa, formando así GUVs. Cuando haya terminado, retire la cámara de la placa de agitación y deseche la mayor parte de la mezcla de lípidos y aceite inclinando la cámara en el contenedor de residuos.Al sostener la cámara con la tapa hacia el interior, abra la tapa de la cámara e incline ligeramente la cámara hacia adentro. La interfaz entre la solución externa que contiene GUV y la mezcla de lípidos y aceite será visible desde la abertura de la cámara donde se encuentra la tapa. Use una pipeta para recolectar suficiente solución externa que contenga GUV y dispense de 50 a 300 microlitros de la solución externa en una placa de 96 pocillos para obtener una densidad adecuada de GUV.Para obtener imágenes de los GUV, configure la placa de 96 pocillos en el escenario de un microscopio invertido equipado con una lente de objetivo de inmersión en aceite 60X. Abra una secuencia de imágenes de interés en un software de procesamiento de imágenes, ImageJ Fiji, e identifique la imagen con la mayor intensidad. Mantenga presionada la tecla Control Mayús C para abrir la ventana de brillo y contraste y haga clic en la pestaña de reinicio.En el menú ImageJ Fiji, vaya a las pestañas Analizar y Establecer escala para ingresar la distancia física conocida y la unidad para cada píxel de imagen. Una vez hecho esto, vaya a los botones Imagen, Pilas y luego Proyecto 3D para reconstruir una imagen 3D de la pila Z. Establezca el método de proyección como Punto de brillo, Espaciado de corte como 0,5 micrómetros y, a continuación, marque la casilla Interpolar.Utilice las opciones predeterminadas para el resto de la configuración y capture imágenes. La imagen representativa muestra una imagen confocal de GUV marcados con rodamina PE con haces encapsulados de fascin-actina. La transferencia de las proteínas de unión a la actina a la solución de actina, luego la adición de la mezcla de lípidos y aceite y la generación de gotas monocapa lipídicas deben tener lugar en unos pocos segundos para evitar la formación de redes de actina antes de la encapsulación.Hemos utilizado esta técnica cDICE modificada para examinar los roles de los diferentes enlaces cruzados de la red de actina en la organización de las redes de actinas. Esperamos que este método ayude a otros investigadores a explorar la regulación de otras proteínas del citoesqueleto.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este documento se describen los métodos simples para la preparación de vesículas, la encapsulación de la transcripción y la maquinaria de traducción, y el seguimiento de la producción de proteínas. Los sistemas libres de células resultantes se pueden utilizar como un punto de partida para construir imita celulares cada vez más complejas.

La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares

La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Las vesículas gigantes que contienen componentes altamente empaquetados del tamaño de un micrómetro son modelos celulares útiles. El método de centrifugación en emulsión de agua en aceite es una herramienta sencilla y potente para la preparación de vesículas gigantes con materiales encapsulados.

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En la interfaz de disolventes orgánicos y acuosos, las proteínas anfifílicas a medida similares a la elastina se ensamblan en estructuras supramoleculares complejas como vesículas, fibras y coacervados desencadenados por parámetros ambientales. Los protocolos de montaje descritos producen compartimentos basados en membranas de proteínas (PMBC) con propiedades ajustables, lo que permite la encapsulación de varias cargas.

Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

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Encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes

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