Artículo de método

Cuantificación de la distribución de glucógeno subcelular en fibras musculares esqueléticas mediante microscopía electrónica de transmisión

DOI:

10.3791/63347

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7 de febrero de 2022

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1Research center for applied health science, University College South Denmark, 2Department of Sports Science and Clinical Biomechanics, University of Southern Denmark, 3Department of Biomedical Sciences, Core Facility for Integrated Microscopy, University of Copenhagen

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un procedimiento modificado posterior a la fijación aumenta el contraste de las partículas de glucógeno en el tejido. Este documento proporciona un protocolo paso a paso que describe cómo manejar el tejido, realizar las imágenes y utilizar métodos estereológicos para obtener datos imparciales y cuantitativos sobre la distribución de glucógeno subcelular específico del tipo de fibra en el músculo esquelético.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con el uso de microscopía electrónica de transmisión, se pueden obtener imágenes de alta resolución de muestras fijas que contienen fibras musculares individuales. Esto permite cuantificaciones de aspectos ultraestructurales como fracciones de volumen, relaciones superficie/volumen, morfometría y sitios de contacto físico de diferentes estructuras subcelulares. En la década de 1970, se desarrolló un protocolo para mejorar la tinción de glucógeno en las células y allanó el camino para una serie de estudios sobre la localización subcelular del glucógeno y el tamaño de partícula de glucógeno utilizando microscopía electrónica de transmisión. Si bien la mayoría de los análisis interpretan el glucógeno como si estuviera distribuido homogéneamente dentro de las fibras musculares, proporcionando solo un valor único (por ejemplo, una concentración promedio), la microscopía electrónica de transmisión ha revelado que el glucógeno se almacena como partículas discretas de glucógeno ubicadas en distintos compartimentos subcelulares. Aquí, se describe el protocolo paso a paso desde la recolección de tejidos hasta la determinación cuantitativa de la fracción de volumen y el diámetro de partículas de glucógeno en los distintos compartimentos subcelulares de las fibras musculares esqueléticas individuales. Consideraciones sobre cómo 1) recolectar y teñir muestras de tejido, 2) realizar análisis de imágenes y manejo de datos, 3) evaluar la precisión de las estimaciones, 4) discriminar entre tipos de fibras musculares y 5) se incluyen las trampas y limitaciones metodológicas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las partículas de glucógeno están compuestas por polímeros ramificados de glucosa y diversas proteínas asociadas1 y constituyen un combustible importante durante las altas demandas metabólicas2. Aunque no son ampliamente reconocidas, las partículas de glucógeno también constituyen un combustible local, donde algunos procesos subcelulares utilizan preferentemente el glucógeno a pesar de la disponibilidad de otros combustibles más duraderos como la glucosa plasmática y los ácidos grasos3,4.

La importancia de almacenar glucógeno como combustible localizado específico subcelular ha sido discutida en varias revisiones5,6 basándose principalmente en algunas de las primeras documentaciones de la distribución subcelular del glucógeno por microscopía electrónica de transmisión (TEM)7,8. Los primeros estudios utilizaron diferentes protocolos para aumentar el contraste de glucógeno desde técnicas de tinción histoquímica hasta tinciones negativas y positivas9,10. Un desarrollo metodológico importante fue el protocolo refinado de post-fijación con el osmio reducido en ferrocianuro de potasio11,12,13,14, que mejoró significativamente el contraste de las partículas de glucógeno. Este refinado protocolo no fue utilizado en algunos de los trabajos pioneros sobre el agotamiento del glucógeno inducido por el ejercicio15, sino que fue reintroducido por Graham y sus colegas16,17.

Según las imágenes en 2 dimensiones, la distribución subcelular del glucógeno se describe con mayor frecuencia como partículas de glucógeno ubicadas en tres grupos: subsarcolema (justo debajo de la membrana superficial), intermiofibrilar (entre las miofibrillas) o intramiofibrilar (dentro de las miofibrillas). Sin embargo, las partículas de glucógeno también podrían describirse como asociadas, por ejemplo, al retículo sarcoplásmico7 o núcleos18. Además de la distribución subcelular, la ventaja del contenido de glucógeno estimado por TEM es también que la cuantificación se puede realizar a nivel de fibra única. Esto permite la investigación de la variabilidad de fibra a fibra y análisis correlativos con tipos de fibra y componentes celulares como mitocondrias y gotas de lípidos.

Aquí, se describe el protocolo para el contenido volumétrico específico del tipo de fibra estimado por TEM de las tres piscinas subcelulares comunes de glucógeno (subsarcolema, intermiofibrilar e intramiofibrilar) en las fibras musculares esqueléticas. El método se ha aplicado a los músculos esqueléticos de humanos19, ratas20 y ratones21; así como aves y peces22; y cardiomiocitos de ratas23.

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Protocolo

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El presente protocolo que utiliza muestras de músculo esquelético biopsiado en humanos fue aprobado por los Comités Regionales de Ética de investigación en salud para el sur de Dinamarca (S-20170198). Las biopsias musculares se obtuvieron a través de una incisión en la piel del músculo vastus lateralis utilizando una aguja de Bergström con succión después de que se administró anestesia local por vía subcutánea (1-3 ml de lidocaína al 2% por incisión). Si se utilizaron músculos de rata enteros aislados, los animales fueron sacrificados por luxación cervical antes de que se obtuvieran las biopsias musculares, de acuerdo con las directrices del comité de ética animal del Hospital Universitario de Odense, Dinamarca.

1. Fijación primaria, post-fijación, incrustación, seccionamiento y contraste

  1. Preparar 1,6 ml de solución fijadora primaria (glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,3)) en un tubo de micro centrifugación de 2 ml. Guárdelo a 5 °C durante un máximo de 14 días.
  2. A partir de la biopsia muscular o músculo entero, aísle una muestra pequeña, que tiene un diámetro máximo de 1 mm en cualquier dirección y es un poco más larga en la dirección longitudinal de la fibra que en la sección transversal (para fines de orientación).
  3. Coloque la muestra en el tubo que contiene la solución de fijación primaria fría. Guárdelo a 5 °C durante 24 h.
  4. Lave la muestra cuatro veces (15 min entre cada lavado) en tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M (pH 7,3). Usando pipetas de transferencia, retire el tampón usado del tubo dejando la muestra intacta y, posteriormente, agregue el tampón fresco.
    NOTA: Después del lavado final, la muestra puede almacenarse en el tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M a 5 °C durante varios meses11. El protocolo se puede pausar aquí.
  5. Postfix con tetróxido de osmio al 1% (OsO4) y ferrocianuro de potasio al 1,5% (K4Fe(CN)6) en tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M (pH 7,3) durante 120 min a 4 °C.
    NOTA: El uso de ferrocianuro de potasio al 1,5% (K4Fe(CN)6) es esencial para un contraste óptimo de partículas de glucógeno11,12,13.
  6. Enjuague dos veces en agua de doble destilación a temperatura ambiente (RT).
  7. Deshidrate sumergiéndose en una serie graduada de alcohol (etanol) en RT utilizando las siguientes concentraciones: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) y 100% (10 min).
    NOTA: En cada paso, la muestra se sumerge en etanol, que posteriormente se retira solo parcialmente para evitar el secado de la muestra. Finalmente, se descarta el etanol sobrante.
  8. Infiltrarse con mezclas graduadas de óxido de propileno y resina eposídica en RT utilizando las siguientes relaciones de volumen (óxido de propileno/resina eposídica): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (durante la noche). Al día siguiente, incrustar especímenes en resina eposídica 100% fresca en moldes y polimerizar a 60 °C durante 48 h.
    NOTA: Este método graduado se ajusta a los protocolos anteriores11,12. El protocolo se puede pausar aquí.
  9. Corte secciones ultrafinas (60-70 nm) de fibras orientadas longitudinalmente y recójalas en rejillas de cobre de un agujero de la siguiente manera.
    1. Monte el bloque de un espécimen en el soporte del ultramicrotomo.
    2. Recorte el bloque en la superficie con una cuchilla de afeitar para alcanzar el nivel del tejido.
    3. Monte un cuchillo de diamante (ultracorte 45) delante de la muestra y alinee la superficie de la muestra paralela al cuchillo.
    4. Produzca una sección semifina (1 μm) con el cuchillo de diamante para verificar la orientación de la muestra. Manche la sección semifina con azul toluidina para observación con microscopía de luz.
    5. Recorte el bloque aún más para reducir el área de interés con el fin de obtener secciones ultrafinas adecuadas.
    6. Corte secciones ultrafinas (60-70 nm) con un segundo cuchillo de diamante (ultracorte 45).
    7. Recoge 1-2 secciones en rejillas de cobre de un agujero usando un Perfect Loop.
      NOTA: La rejilla de cobre de un agujero tiene un solo orificio en el medio con membrana de soporte Formvar.
  10. Contraste de las secciones con acetato de uranilo y citrato de plomo sumergiendo las rejillas anteriores en solución de acetato de uranilo (0,5% en agua de doble destilación) durante 20 min, y luego en solución de citrato de plomo (1% en agua de doble destilación) durante 15 min. Lave las rejillas en agua de doble destilación entre y después de las dos manchas.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

2. Imágenes

  1. Encienda el microscopio electrónico de transmisión (operado a un voltaje de aceleración de 80 kV), la computadora y el software de grabación de imágenes. Grabe imágenes digitales con una cámara CCD digital de escaneo lento de 2 k x 2 k y el software de imágenes asociado.
  2. Inserte la rejilla con varias secciones en la etapa del microscopio.
  3. Examine la cuadrícula inicialmente a bajo aumento (por ejemplo, x100) para determinar la calidad de las secciones (es decir, agujeros en la membrana de soporte, escombros, etc.) y elija las secciones de mejor calidad. Con un aumento bajo, determine la dirección de las fibras musculares.
  4. A continuación, aumente el aumento con el haz centrado en una fibra periférica en la sección. Enfoque la imagen a un aumento superior a 30 k para garantizar suficientes detalles finos en la imagen, guiados por una transformación rápida de Fourier en tiempo real, si está disponible. Finalmente, grabe imágenes con un tiempo de exposición de 1 s al aumento deseado.
  5. Adquirir un total de 24 imágenes de una fibra seleccionada aleatoriamente, es decir, 12 imágenes del espacio miofibrilar y 12 imágenes del espacio subsarcolema, a un aumento entre 10 k y 40 k. Asegúrese de que las imágenes se distribuyan a lo largo y ancho de la fibra en un orden aleatorio pero sistemático para obtener resultados imparciales (Figura 1A).
    NOTA: La ampliación óptima depende de la resolución de la cámara disponible y del tamaño de las micrografías. El objetivo es lograr una resolución final, donde los diámetros de las partículas de glucógeno se puedan medir dentro de pasos de 1 nm, e incluir un área total de la región miofibrilar de al menos 70 μm2 y una longitud total de la fibra de al menos 25 μm distribuida en 12 imágenes del espacio miofibrilar y 12 imágenes del espacio subsarcolema por fibra, respectivamente. Las 24 imágenes por fibra probablemente darán una precisión (coeficiente de error) del contenido volumétrico de las diferentes piscinas de glucógeno entre 0,1 y 0,2 en fibras individuales de músculos esqueléticos humanos, ratas y ratones20,21,24 (Figura 2E).
  6. Repita los pasos 2.4 y 2.5 hasta que se tomen imágenes de un total de 6-10 fibras. Si es necesario, corte secciones adicionales (separadas por al menos 150 μm para evitar la superposición de fibras ya fotografiadas) y repita los pasos 1.9-2.5.

3. Análisis de imágenes

  1. Importe imágenes a ImageJ haciendo clic en Archivo > Abrir.
  2. Establezca la escala global para que coincida con el tamaño original de la imagen haciendo clic en Analizar > Establecer escala.
  3. Amplíe el 100% haciendo clic en Imagen > Zoom > In.
  4. Mida el grosor de un disco Z por imagen del espacio miofibrilar (12 por fibra) utilizando la herramienta Línea recta del menú Herramientas (Figura 1D). Calcule el espesor promedio del disco Z de cada una de las 6-10 fibras.
  5. Defina 2-3 fibras con el disco Z promedio más grueso como fibras tipo 1 y 2-3 fibras con el disco Z promedio más delgado como fibras tipo 2. Ignore las fibras intermedias 2-4 para análisis adicionales (Figura 1E).
    NOTA: Los siguientes pasos se repiten para cada una de las 4-6 fibras de la muestra. Las fracciones de volumen de glucógeno se estiman por conteo de puntos como se describe en otra parte25,26. El tamaño de las rejillas se elige para obtener una alta precisión satisfactoria de las estimaciones. Esto a menudo se obtiene al lograr 250 golpes, que luego dicta el número total de puntos necesarios y, a su vez, el área por punto.
  6. Utilice la herramienta Línea segmentada para medir la longitud de la miofibrilla más externa visible justo debajo de la región subesarcolémmica (Figura 2A).
    NOTA: Esta longitud se utiliza para expresar glucógeno subescolamómico por área de superficie (es decir, longitud de la miofibrilla más externa multiplicada por el grosor de la sección (60 nm); ver paso 4.5). Por lo tanto, solo la región subescolema, que está representada por esta longitud, se incluye en el análisis.
  7. Inserte una cuadrícula haciendo clic en Analizar herramientas > > cuadrícula y establezca Área por punto en 32.400 nm2. Cuente el número de aciertos dentro de la longitud disponible en las 12 imágenes subesarcolemmales, donde una cruz golpea el glucógeno subsarcolemmal (Figura 2A). Un golpe se define como una partícula de glucógeno que está presente en la esquina superior derecha de una cruz.
  8. Inserte una cuadrícula haciendo clic en Analizar herramientas de > > cuadrícula y establezca Área por punto en 160.000 nm2. Cuente el número de aciertos en las 12 imágenes miofibrilares, donde una cruz golpea el espacio intramiofibrilar (Figura 2B).
  9. Inserte una cuadrícula haciendo clic en Analizar herramientas > > cuadrícula y establezca Área por punto en 3.600 nm2. Cuente el número de aciertos en las 12 imágenes miofibrilares, donde una cruz golpea el glucógeno intramiofibrilar (Figura 2C).
  10. Inserte una cuadrícula haciendo clic en Analizar herramientas > > cuadrícula y establezca Área por punto en 32.400 nm2. Cuente el número de aciertos en las 12 imágenes miofibrilares, donde una cruz golpea el glucógeno intermiofibrilar (Figura 2D).
  11. Usando la herramienta Línea recta , mida el diámetro de cinco partículas de glucógeno elegidas al azar de cada grupo para cada una de las 12 imágenes para obtener un promedio de 60 partículas por grupo por fibra.
    NOTA: El promedio de 60 partículas cubre en gran medida la variación dentro de la fibra (Figura 2F).

4. Cálculos

  1. Calcule la fracción de área aparente (AA) del espacio intramiofibrilar por espacio miofibrilar como la suma de todos los aciertos divididos por la suma de todos los puntos de las 12 imágenes (del paso 3.8).
  2. Calcule la fracción de área aparente de glucógeno intramiofibrilar por área miofibrilar, glucógeno intermiofibrilar por área miofibrilar y glucógeno subsarcolemado por área de imagen como la suma de todos los aciertos divididos por la suma de todos los puntos de las 12 imágenes (de los pasos 3.7, 3.9 y 3.10).
  3. Calcule la fracción de volumen (VV) de glucógeno intramiofibrilar, intermiofibrilar y subescolémico, respectivamente, como la fracción de área aparente (AA) menos el producto de la densidad superficial (SV) con espesor de sección (t), donde la densidad superficial es la densidad numérica de partículas multiplicada por la superficie media de partículas:
    Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
    Dónde
    Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H))
    t = 0,06 μm
    H = diámetro medio de las partículas (μm)
    NOTA: La fracción de volumen es menor que la fracción de área aparente debido a la contribución de tapas de partículas con su centro fuera de la rebanada25.
  4. Para expresar glucógeno intramiofibrilar por espacio intramiofibrilar, divida la fracción de área del glucógeno intramiofibrilar (paso 4.2) por la fracción de área del espacio intramiofibrilar (paso 4.1). El glucógeno intermiofibrilar se expresa por espacio miofibrilar calculado en el paso anterior (paso 4.3).
  5. Para expresar glucógeno subescolalemmal por área de superficie de la fibra (VS) (miofibrilla más externa), convierta la fracción de volumen de glucógeno a una cantidad absoluta multiplicando con el volumen de la imagen (producto del área y espesor de la sección) y dividiendo por el producto de la longitud media disponible (desde el paso 3.6) con el grosor de la sección (t).
  6. Estime el contenido total de glucógeno volumétrico utilizando los valores de los pasos 4.1, 4.4 y 4.5, de la siguiente manera:
    Glucógeno miofibrilar = Glucógeno intermiofibrilar + (glucógeno intramiofibrilar · fracción de área del espacio intramiofibrilar)
    Al suponer un radio de fibra promedio de 40 μm27, la relación volumen-superficie es de 20:1, por lo que el glucógeno total es:
    Glucógeno total (VV) = Glucógeno miofibrilar + (glucógeno subsarcolema (VS) / 20)
    NOTA: La relación volumen-superficie de 20:1 puede variar de fibra a fibra dependiendo del tamaño real de la fibra y el tamaño de la región subescolema. Esto no se tiene en cuenta con el presente protocolo.
  7. A partir de esto, la contribución relativa de cada grupo se calcula como fracciones de glucógeno total:
    Glucógeno intermiofibrilar / Glucógeno total = Glucógeno intermiofibrilar / Glucógeno total
    Glucógeno intramiofibrilar / Glucógeno total = (Glucógeno intramiofibrilar · fracción de área del espacio intramiofibrilar) / Glucógeno total
    Glucógeno subsarcolema / Glucógeno total = Glucógeno subsarcolema / 20 / Glucógeno total
  8. Para cada grupo de glucógeno, calcule el coeficiente de error (CE), que expresa la incertidumbre de la estimación de glucógeno a nivel de fibra, en función del número de imágenes (n), el número total de cruces en cada imagen (x) y el número de cruces que golpean el glucógeno en el grupo relevante en cada imagen (y) de la siguiente manera28:
    CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑y-1

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando este protocolo, las partículas de glucógeno aparecen negras y distintas (Figuras 1 y Figura 2). Los valores normales de glucógeno se representan en la Figura 3. Estos datos se basan en un total de 362 fibras de 41 jóvenes sanos recogidos en diferentes estudios previos19,24,29,30,31.

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El paso crítico del método es el uso de osmio reducido por ferrocianuro de potasio durante la post-fijación. La selectividad de este fijador modificado para la detección de glucógeno no puede explicarse completamente por la química, pero también incluye hallazgos experimentales que demuestran que no hay detección de tales partículas en tejidos que se sabe que están libres de glucógeno o en el espacio extracelular11.

Los parámetros críticos son la precisión de las estima...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el Comité Olímpico Sueco.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Óxido de 1,2-propilenoMerck75-56-9
Kit de medio de resina 812 incrustaciónTaabT031
Solución de glutaraldehído 25%Merck1.04239.0250
ITEMOlympusSoftware de imagen
Leica EM AC20LeicaSistema de contraste automático
Cámara digital OSIS VeletaOlympus
Solución de tetróxido de osmio al 4%Polysciences0972A
Philips CM 100 Transmisión EMPhilips
potasio (II) trihidratoSigma-Aldrich455989-245G
Tampón cacodilato de sodio 0,2 M ph 7.4Ampliqon.com AMPQ40989.0500
Ultra-micrótomo Leica UC7Leica
Ultrostain citrato de plomo al 3%, solución estabilizadaLeica16707235
Acetato de uranilo dihidratadoPolysciences6159-44-0
Hexacianoferrato de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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