Artículo de método
Los microtúbulos, que son polímeros de tubulina, desempeñan un papel crucial como componente del citoesqueleto en las células eucariotas y son conocidos por su inestabilidad dinámica. Este estudio desarrolló un método para fraccionar microtúbulos para separarlos en microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre para evaluar la estabilidad de los microtúbulos en varios tejidos de ratón.
Los microtúbulos, compuestos por dímeros de α/β-tubulina, son un componente crucial del citoesqueleto de las células eucariotas. Estos polímeros en forma de tubo exhiben inestabilidad dinámica a medida que las subunidades de heterodímero de tubulina se someten a polimerización y despolimerización repetitivas. El control preciso de la estabilidad y la dinámica de los microtúbulos, logrado a través de las modificaciones postraduccionales de la tubulina y las proteínas asociadas a los microtúbulos, es esencial para diversas funciones celulares. Las disfunciones en los microtúbulos están fuertemente implicadas en la patogénesis, incluidos los trastornos neurodegenerativos. La investigación en curso se centra en agentes terapéuticos dirigidos a los microtúbulos que modulan la estabilidad, ofreciendo posibles opciones de tratamiento para estas enfermedades y cánceres. En consecuencia, comprender el estado dinámico de los microtúbulos es crucial para evaluar la progresión de la enfermedad y los efectos terapéuticos.
Tradicionalmente, la dinámica de los microtúbulos se ha evaluado in vitro o en células cultivadas mediante fraccionamiento aproximado o inmunoensayo, utilizando anticuerpos dirigidos a modificaciones postraduccionales de la tubulina. Sin embargo, el análisis preciso del estado de la tubulina en los tejidos mediante estos procedimientos plantea desafíos. En este estudio, desarrollamos un método simple e innovador de fraccionamiento de microtúbulos para separar microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre en tejidos de ratón.
El procedimiento consistió en homogeneizar tejidos de ratón disecados en un tampón estabilizador de microtúbulos en una proporción de volumen de 19:1. A continuación, los homogeneizados se fraccionaron mediante un proceso de ultracentrifugación de dos pasos tras una centrifugación lenta inicial (2.400 × g) para eliminar los residuos. La primera etapa de ultracentrifugación (100.000 × g) precipitó microtúbulos estables, mientras que el sobrenadante resultante se sometió a una segunda etapa de ultracentrifugación (500.000 × g) para fraccionar los microtúbulos lábiles y los dímeros de tubulina soluble. Este método determinó las proporciones de tubulina que constituyen microtúbulos estables o lábiles en el cerebro del ratón. Además, se observaron distintas variaciones tisulares en la estabilidad de los microtúbulos que se correlacionaron con la capacidad proliferativa de las células constituyentes. Estos hallazgos ponen de relieve el importante potencial de este novedoso método para analizar la estabilidad de los microtúbulos en condiciones fisiológicas y patológicas.
Los microtúbulos (MT) son estructuras tubulares alargadas que comprenden protofilamentos formados por subunidades heterodímeras de α/β-tubulina. Desempeñan un papel esencial en diversos procesos celulares, como la división celular, la motilidad, el mantenimiento de la forma y el transporte intracelular, lo que los convierte en componentes integrales del citoesqueleto eucariota. El extremo negativo de las MT, donde la subunidad de α-tubulina está expuesta, es relativamente estable, mientras que el extremo positivo, donde la subunidad de β-tubulina está expuesta, sufre despolimerización dinámica y polimerización2. Este cic....
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1. Método de fraccionamiento MT
NOTA: Todos los experimentos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Doshisha. Aquí se utilizaron ratones C57BL/6J de ambos sexos, de 3 a 4 meses de edad. En este protocolo, los tejidos disecados, por ejemplo, el cerebro, el hígado o el timo, se homogeneizaron inmediatamente en un tampón estabilizador de microtúbulos (MSB) helado, que contenía Taxol (estabilizador de MT) a una concentración que impedía no solo la despolimerización sino también la repolimerización de MT. El homogeneizado se separó en tres fracciones mediante un proceso de ul....
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Cuantificación de tubulina en las fracciones P2, P3 y S3 del cerebro de ratón mediante el método de fraccionamiento MT
La tubulina en el tejido de ratón se separó en las fracciones P2, P3 y S3 mediante el método de fraccionamiento MT y se cuantificó mediante Western blot (Figura 1A). El precipitado de MTs que permaneció en la fracción P2 por ultracentrifugación a 100.000 × g durante 20 min representó el 34,86% ± el 1,68% de la tubulina total en el cerebro de un r.......
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La tarea más importante cuando se investiga el estado de la tubulina en el tejido de los organismos vivos es prevenir la polimerización o despolimerización accidental de la MT durante la preparación. La estabilidad de los MT en las muestras se ve afectada por factores como la concentración de Taxol en MSB, la proporción de cantidad de tejido a tampón y la temperatura durante el proceso desde la extracción del tejido hasta la homogeneización y centrifugación. Por lo tanto, se optimizaron las condiciones en cada paso del p.......
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Los autores no tienen conflictos de intereses que denunciar.
Este trabajo fue apoyado en parte por JST, el establecimiento de becas universitarias para la creación de innovación científica y tecnológica (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), una subvención para becarios de JSPS (A.HT.; 23KJ2078), una subvención para la investigación científica (B) JSPS KAKENHI (22H02946 para TM), una subvención para la investigación científica en áreas innovadoras titulada "Envejecimiento de las proteínas cerebrales y control de la demencia" del MEXT (TM; 26117004), y por la beca de investigación Uehara de la Fundación Uehara Memorial (TM; 202020027). Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CAJA DE TUBO DE 1,5 ML DE 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | dilución 1:5.000 |
| ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa columna de centrifugación de ultrafiltración | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5.000 dilución |
| Ä KTAprime plus | Cytiva | 11001313 | |
| anti-ratón IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | dilución 1:5.000 |
| antidolor | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinina | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Sistema de filtro de vacío con tapa de botella | Corning | 430758 | 0.22µ m 33.2cm² membrana de nitrocelulosa |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| HOMOGENEIZADOR DIGITAL HK-1 | AS ONE | 1-2050-11 | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | dilución 1:5.000 |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll Pall Corporation | BSP0161 | ||
| glicerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| MICRO CENTRÍFUGA REFRIGERADA DE ALTA VELOCIDAD Kitman | TOMY | KITMAN-24 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg columna | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Software de medición de imagen | FUJIFILUM Wako Corporación Química Pura | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | dilución 1:5.000 |
| Analizador de imágenes luminiscentes LAS-4000 | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptina | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| ácido okadaico | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatina | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Tubos de centrífuga de policarbonato para TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa (cOmplete™, sin EDTA) | Roche | 11873580001 | |
| Tubulina purificada | Citoesqueleto | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| Rotor TLA-120.2 | Beckman Coulter | 357656 | |
| Rotor TLA-55 | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glicerofosfato | Sigma-Aldrich | G9422 |
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