Artículo de método

Técnica de fraccionamiento cuantitativo de microtúbulos para separar microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre en tejidos de ratón

3.3K vistas

⸱

DOI:

10.3791/63358

⸱

17 de noviembre de 2023

 , 
1Department of Neuropathology, Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 2Center for Research in Neurodegenerative Diseases, Doshisha University, 3Laboratory of Physiology and Anatomy, School of Pharmacy, Nihon University

En este artículo

Resumen

Los microtúbulos, que son polímeros de tubulina, desempeñan un papel crucial como componente del citoesqueleto en las células eucariotas y son conocidos por su inestabilidad dinámica. Este estudio desarrolló un método para fraccionar microtúbulos para separarlos en microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre para evaluar la estabilidad de los microtúbulos en varios tejidos de ratón.

Resumen

Los microtúbulos, compuestos por dímeros de α/β-tubulina, son un componente crucial del citoesqueleto de las células eucariotas. Estos polímeros en forma de tubo exhiben inestabilidad dinámica a medida que las subunidades de heterodímero de tubulina se someten a polimerización y despolimerización repetitivas. El control preciso de la estabilidad y la dinámica de los microtúbulos, logrado a través de las modificaciones postraduccionales de la tubulina y las proteínas asociadas a los microtúbulos, es esencial para diversas funciones celulares. Las disfunciones en los microtúbulos están fuertemente implicadas en la patogénesis, incluidos los trastornos neurodegenerativos. La investigación en curso se centra en agentes terapéuticos dirigidos a los microtúbulos que modulan la estabilidad, ofreciendo posibles opciones de tratamiento para estas enfermedades y cánceres. En consecuencia, comprender el estado dinámico de los microtúbulos es crucial para evaluar la progresión de la enfermedad y los efectos terapéuticos.

Tradicionalmente, la dinámica de los microtúbulos se ha evaluado in vitro o en células cultivadas mediante fraccionamiento aproximado o inmunoensayo, utilizando anticuerpos dirigidos a modificaciones postraduccionales de la tubulina. Sin embargo, el análisis preciso del estado de la tubulina en los tejidos mediante estos procedimientos plantea desafíos. En este estudio, desarrollamos un método simple e innovador de fraccionamiento de microtúbulos para separar microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre en tejidos de ratón.

El procedimiento consistió en homogeneizar tejidos de ratón disecados en un tampón estabilizador de microtúbulos en una proporción de volumen de 19:1. A continuación, los homogeneizados se fraccionaron mediante un proceso de ultracentrifugación de dos pasos tras una centrifugación lenta inicial (2.400 × g) para eliminar los residuos. La primera etapa de ultracentrifugación (100.000 × g) precipitó microtúbulos estables, mientras que el sobrenadante resultante se sometió a una segunda etapa de ultracentrifugación (500.000 × g) para fraccionar los microtúbulos lábiles y los dímeros de tubulina soluble. Este método determinó las proporciones de tubulina que constituyen microtúbulos estables o lábiles en el cerebro del ratón. Además, se observaron distintas variaciones tisulares en la estabilidad de los microtúbulos que se correlacionaron con la capacidad proliferativa de las células constituyentes. Estos hallazgos ponen de relieve el importante potencial de este novedoso método para analizar la estabilidad de los microtúbulos en condiciones fisiológicas y patológicas.

Introducción

Los microtúbulos (MT) son estructuras tubulares alargadas que comprenden protofilamentos formados por subunidades heterodímeras de α/β-tubulina. Desempeñan un papel esencial en diversos procesos celulares, como la división celular, la motilidad, el mantenimiento de la forma y el transporte intracelular, lo que los convierte en componentes integrales del citoesqueleto eucariota. El extremo negativo de las MT, donde la subunidad de α-tubulina está expuesta, es relativamente estable, mientras que el extremo positivo, donde la subunidad de β-tubulina está expuesta, sufre despolimerización dinámica y polimerización2. Este ciclo continuo de adición y disociación de dímeros de tubulina en el extremo positivo, denominado inestabilidad dinámica, da lugar a un proceso repetitivo de rescate y catástrofe3. Los MT exhiben dominios focales con variaciones localizadas en la inestabilidad dinámica, incluyendo dominios estables y lábiles4.

El control preciso de la inestabilidad dinámica de las MT es crucial para numerosas funciones celulares, particularmente en neuronas caracterizadas por morfologías intrincadas. La adaptabilidad y durabilidad de las MT juegan un papel vital en el desarrollo y buen funcionamiento de las células nerviosas 5,6,7. Se ha encontrado que la inestabilidad dinámica de los MT está asociada con varias modificaciones postraduccionales (PTM) de la tubulina, como acetilación, fosforilación, palmitoilación, destirosinación, delta 2, oxidación de poliglutamina y poliglicación. Además, la unión de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP) sirve como mecanismo regulador8. Los PTM, excluyendo la acetilación, se producen predominantemente en la región carboxiterminal de la tubulina situada en la superficie externa de los MT. Estas modificaciones crean diversas condiciones superficiales en los MT, lo que influye en su interacción con los MAP y, en última instancia, gobierna la estabilidad del MT9. La presencia de un residuo de tirosina carboxiterminal en la α-tubulina es indicativa de MT dinámicos, que son rápidamente reemplazados por el pool de tubulina libre. Por el contrario, la destirosinación del extremo carboxilo y la acetilación de Lys40 significan MTs estables con inestabilidad dinámica reducida 9,10.

Los PTM de la tubulina se han empleado ampliamente en experimentos para evaluar la dinámica y la estabilidad de las MT 5,7,11,12,13,14,15. Por ejemplo, en los estudios de cultivos celulares, las tubulinas se pueden segregar en dos grupos: el grupo de tubulinas libres y el grupo MT. Esto se logra liberando tubulina libre a través de la permeabilización celular antes de fijar los MT restantes 15,16,17,18,19. Los métodos bioquímicos implican el uso de estabilizadores químicos de MT que protegen a las MT de catástrofes, permitiendo la separación de MTs y tubulina libre a través de la centrifugación20,21,22. Sin embargo, estos procedimientos no diferencian entre MT estables y menos estables (lábiles), lo que hace imposible cuantificar MT o tubulina soluble en tejidos como el cerebro. En consecuencia, la evaluación de la estabilidad de la MT en organismos en condiciones fisiológicas y patológicas ha demostrado ser un desafío. Para abordar esta limitación experimental, hemos desarrollado una técnica novedosa para separar con precisión las MT y la tubulina libre en tejido de ratón23.

Este método único de fraccionamiento de MT implica la homogeneización de los tejidos en condiciones que mantienen el estado de la tubulina en los tejidos y la centrifugación en dos pasos para separar las MT estables, las MT lábiles y la tubulina libre. Este sencillo procedimiento puede aplicarse a estudios amplios, como la investigación básica sobre las MT y las MAP en organismos vivos, los análisis fisiológicos y patológicos de la salud y las enfermedades asociadas a la estabilidad de la MT, y el desarrollo de fármacos y otras terapias dirigidas a las MT.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Método de fraccionamiento MT

NOTA: Todos los experimentos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Doshisha. Aquí se utilizaron ratones C57BL/6J de ambos sexos, de 3 a 4 meses de edad. En este protocolo, los tejidos disecados, por ejemplo, el cerebro, el hígado o el timo, se homogeneizaron inmediatamente en un tampón estabilizador de microtúbulos (MSB) helado, que contenía Taxol (estabilizador de MT) a una concentración que impedía no solo la despolimerización sino también la repolimerización de MT. El homogeneizado se separó en tres fracciones mediante un proceso de ultracentrifugación de dos pasos (Figura 1). Todos los pasos de este protocolo se completaron sin interrupción en un ambiente de temperatura fría, y los tejidos y fracciones no se congelaron hasta que se disolvieron en tampón de muestra de dodecil sulfato de sodio (SDS).

  1. Preparación de MSB y microtubos
    1. Para preparar MSB, mezcle los siguientes reactivos: 0,1 M de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), pH 6,8 (neutralizado por KOH), 10% glicerol, 0,1 mM de DTT, 1 mM de MgSO 4, 1 mM de EGTA, 0,5% de Triton X-100, inhibidores de la fosfatasa (1 mM de NaF, 1 mM de β-glicerofosfato, 1 mM de Na3VO4, 0,5 μM de ácido okadaico), 1x cóctel de inhibidores de la proteasa, e inhibidores de la proteasa (0,1 mM PMSF, 0,1 mM DIFP, 1 μg/mL de pepstatina, 1 μg/mL de antidolor, 10 μg/mL de aprotinina, 10 μg/mL de leupeptina, 50 μg/mL de TLCK) (ver Tabla de Materiales) y se denominan MSB(-).
    2. Justo antes de la disección del tejido, agregue 10 μM de Taxol y 2 mM de GTP (ver Tabla de Materiales) a MSB(-). Este búfer se denota como MSB(+). Prepare el tampón el día de su uso y manténgalo en hielo.
    3. Prepare los microtubos para la toma de muestras. Microtubo vacío de 2,0 mL para almacenamiento homogeneizado; microtubo vacío de 1,5 mL para el almacenamiento de lisado de sobrenadante1 (S1), muestra de precipitado2 (P2) y precipitado3 (P3); Microtubo de 1,5 ml con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada para el almacenamiento de tejido disecado; Microtubo de 1,5 ml con 200 μl de tampón de muestra de 2 SDS (0,16 M Tris pH 6,8; 20% glicerol; 2% 2-mercaptoetanol; 4% SDS) para el almacenamiento de muestras S1 y sobrenadante3 (S3); y microtubo de centrifugación para rotores centrífugos TLA55 y TLA120.2 (ver Tabla de Materiales). Etiquete todos los tubos y colóquelos en hielo.
  2. Homogeneización de tejidos de ratón
    1. Prepare una mesa refrigerada para la disección de tejidos. Primero, llene una caja con hielo picado y coloque dos placas de Petri sobre hielo, una con el lado interno hacia arriba y la otra con el lado externo. Llene el PBS helado en un plato para el lavado transitorio y el almacenamiento de los tejidos disecados. Coloque papel de filtro humedecido con PBS en otro plato volteado.
    2. Para sacrificar un ratón, realice la luxación cervical bajo anestesia profunda con un anestésico mixto de butorfanol, midazolam y medetomidina. Luego, diseccione inmediatamente los tejidos, por ejemplo, el cerebro, el hígado o el timo, y lávelos con PBS helado en una placa de Petri.
      NOTA: Cualquier tipo de tejido blando puede ser analizado por este método. Sin embargo, el tamaño del tejido está limitado por el rango de volumen recomendado del homogeneizador utilizado. Por ejemplo, si se utiliza un volumen de 2 ml de homogeneizador, se recomiendan 50-100 mg de tejido.
    3. Después de pesar los microtubos de 1,5 ml llenos de PBS para el almacenamiento de tejido disecado, corte y almacene los tejidos dentro de los microtubos y vuelva a pesar cada microtubo. El peso húmedo de cada tejido se puede calcular restando el peso del tubo antes y después de agregar el tejido.
    4. Homogeneizar inmediatamente el tejido en MSB(+) helado con un homogeneizador refrigerado (ver Tabla de Materiales). El volumen de MSB(+) fue 19 veces (μL) el peso húmedo del tejido (mg). Realizar la homogeneización con 20 pasadas hasta que desaparezcan los trozos de tejido.
      NOTA: Por ejemplo, se utilizan 1.900 μL de MSB(+) por 100 mg de tejido. Dado que el volumen de MSB(+) que se va a añadir debe ajustarse para cada peso húmedo de las piezas de tejido analizadas, es necesario pesar cada pieza de tejido con precisión.
  3. Centrifugación de los homogeneizados de tejido de ratón
    1. Mover todo el homogeneizado a un microtubo de 2 mL con una pipeta Pasteur y centrifugar a 2.400 × g durante 3 min a 2 °C para eliminar los residuos por precipitación.
    2. Transfiera todo el sobrenadante (fracción S1) a un nuevo microtubo y vórtice de 1,5 ml. A continuación, alícuota 200 μL de fracción S1 en un microtubo de centrifugación y centrifugar a 100.000 × g utilizando un rotor TLA-55 durante 20 min a 2 °C para obtener las proteínas de peso molecular relativamente grandes como precipitado (fracción P2).
      NOTA: El volumen de la muestra sometida a los pasos de ultracentrifugación afecta el radio de centrifugación y la eficiencia de precipitación de las moléculas. Mantenga el volumen de la muestra a 200 μL o menos después de este paso para evitar un fraccionamiento inexacto.
    3. Centrifugar todo el sobrenadante resultante (fracción S2) a 500.000 × g utilizando un rotor TLA-120.2 durante 60 min a 2 °C para separar los complejos de proteínas insolubles en el precipitado (fracción P3) de las proteínas solubles en el sobrenadante (fracción S3).
    4. Añadir 400 μL de tampón de muestra 1x SDS (0,08 M Tris pH 6,8; 10% glicerol; 1% 2-mercaptoetanol; 2% SDS) a los tubos de fracción P2 y P3 y sonicar brevemente para disolver el precipitado. Transfiera estas muestras fraccionadas a un microtubo vacío de 1,5 ml.
    5. Disuelva la fracción total de S3 en 200 μL de tampón de muestra SDS 2x.
    6. Mezcle las fracciones S1 restantes con un volumen igual de tampón de muestra SDS 2x para su uso como curva estándar para Western bóset.
    7. Hervir todas estas muestras a 100 °C durante 3 min. Una vez que las muestras se hayan enfriado a temperatura ambiente, guárdelas a -20 °C.
  4. Cuantificación de proteínas en cada fracción
    1. Cuantificar las proteínas de las fracciones P2, P3 y S3 mediante Western blot. En primer lugar, utilice la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10% (SDS-PAGE) para separar las proteínas de las fracciones P2, P3 y S3 debidamente diluidas, y la muestra de S1 diluida en serie de cualquier individuo como una curva estándar. Luego, electroseque las muestras en membranas de fluoruro de polivinilideno (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: La relación de dilución de cada fracción depende de la concentración de una proteína objetivo y de la reactividad del anticuerpo. (p. ej., α-tubulina, TUBB3, β-tub y tubulina tirosinada en el tejido cerebral: S3 = 1/400, P3 = 1/2.000, P2 = 1/2.000, S1 = 1/50,000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; tubulina acetilada en tejido cerebral: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8.000, S1 = 1/100.000, 1/40.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/4.000; α-tubulina en el hígado: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; α-tubulina en timo: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000 dilución de la concentración tisular).
    2. Bloquear la membrana con leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris (50 mM de Tris-HCl pH 7,6; 152 mM de NaCl) con 0,1% de Tween 20 (TBS-T) durante más de 30 min.
    3. Sumergir la membrana en el anticuerpo primario que contiene TBS-T (ver Tabla de Materiales) durante más de 2 h. Después de eso, lave la membrana con TBS-T durante 3 minutos (3 veces).
    4. Marcar el anticuerpo primario utilizando anticuerpos secundarios conjugados con HRP (ver Tabla de materiales) en TBS-T durante más de 1 h. Después de eso, lave la membrana con TBS-T durante 3 minutos (3 veces).
    5. Desarrollar las membranas con el reactivo de quimioluminiscencia mejorada. A continuación, analice las bandas de interés con un analizador de imágenes luminiscentes (consulte la tabla de materiales).
    6. Cuantifique las intensidades de las bandas de proteínas utilizando un software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) y cree una curva estándar trazando las unidades de dilución de las muestras S1 diluidas utilizadas para la curva estándar a lo largo del eje X y las intensidades de banda a lo largo del eje Y.
    7. Lea la concentración de proteína (unidad) correspondiente a las muestras de fracción diluida. Multiplique la concentración leída por el factor de dilución de la muestra para obtener una unidad de proteína en cada fracción. Divida la unidad medida de cada fracción por la unidad de proteína total (P2 + P3 + S3) para obtener un porcentaje.

2. Evaluación de las propiedades de la tubulina en cada fracción

NOTA: Este método bioquímico proporciona tres grupos de complejos de tubulina definidos por las propiedades de sedimentación. Aquí, se identificó el estado de los complejos de tubulina obtenidos en estas fracciones en función del tamaño del complejo y de los PTM de tubulina. Complete todos los pasos de este protocolo sin interrupción en un entorno de temperatura fría, pero no congele las muestras fraccionadas hasta que se disuelvan en el tampón de muestras SDS.

  1. Ensayo de trampa de filtro
    1. Filtrar las fracciones S2 y S3 (500 μL cada una) utilizando una columna de centrifugación de ultrafiltración de 300 kDa (ver Tabla de Materiales). Realice una centrifugación de 14.000 × g a 2 °C hasta que se filtre todo el sobrenadante, las proteínas eluidas se recojan en los tubos receptores y las proteínas atrapadas permanezcan en el filtro de los tubos de depósito.
    2. Trasladar los filtrados enteros (aproximadamente 500 μL) en tubos receptores en nuevos microtubos de 1,5 ml y disolverlos en 500 μl de tampón de muestra SDS 2x.
    3. Solubilizar los residuos en el filtro de los tubos de depósito en 1.000 μL de 1x tampón de muestra SDS pipeteando y transfiriendo las muestras a un nuevo microtubo de 1,5 mL.
    4. Hervir las muestras a 100 °C durante 3 min. Una vez que las muestras se hayan enfriado a temperatura ambiente, guárdelas a -20 °C.
    5. Analizar las cantidades de tubulina por Western blot con DM1A (anticuerpo anti-α-tubulina, ver Tabla de Materiales).
  2. Cromatografía de exclusión por tamaño
    1. Preparar el tampón portador (0,1 M MES, pH 6,8; glicerol al 10%; 1 mM MgSO4; 1 mM EGTA; 0,1 mM DTT) suplementado con una concentración de 1/10 de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa como se describe en el paso 1.1.1. Luego, filtre la solución y guárdela en un ambiente frío.
    2. Preparar una columna de cromatografía de filtración en gel equipada con un sistema de cromatografía líquida preparativa en una cámara de cromatografía (ver Tabla de Materiales) a 4 °C.
    3. Antes de inyectar las muestras en la columna, fluya 180 ml del tampón portador para lavar la columna. El caudal es de 1 mL/min durante 3 h.
    4. Inyecte en la columna la tubulina porcina purificada disponible en el mercado (véase la Tabla de materiales) como control o la fracción S3 de cerebros de ratón (500 μl cada uno).
    5. Eluir a un caudal de 1,0 ml/min con tampón portador. Recoja las fracciones de 1,5 ml durante 120 min. Monitorizar las proteínas eluidas por absorbancia a 280 nm. Mantenga la presión máxima por debajo de 0,3 MPa.
    6. Después de vórtice de las fracciones recolectadas, mezcle 50 μL de ellas con 50 μL de tampón de muestra SDS 2x en un microtubo de 1,5 mL. Hervir todas las muestras a 100 °C durante 3 min. Una vez que las muestras se hayan enfriado a temperatura ambiente, guárdelas a -20 °C.
    7. Analizar las cantidades de tubulina por Western blot con DM1A, anticuerpo anti-α-tubulina y KMX-1, anticuerpo anti-β-tubulina (ver Tabla de Materiales).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Cuantificación de tubulina en las fracciones P2, P3 y S3 del cerebro de ratón mediante el método de fraccionamiento MT
La tubulina en el tejido de ratón se separó en las fracciones P2, P3 y S3 mediante el método de fraccionamiento MT y se cuantificó mediante Western blot (Figura 1A). El precipitado de MTs que permaneció en la fracción P2 por ultracentrifugación a 100.000 × g durante 20 min representó el 34,86% ± el 1,68% de la tubulina total en el cerebro de un r...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La tarea más importante cuando se investiga el estado de la tubulina en el tejido de los organismos vivos es prevenir la polimerización o despolimerización accidental de la MT durante la preparación. La estabilidad de los MT en las muestras se ve afectada por factores como la concentración de Taxol en MSB, la proporción de cantidad de tejido a tampón y la temperatura durante el proceso desde la extracción del tejido hasta la homogeneización y centrifugación. Por lo tanto, se optimizaron las condiciones en cada paso del p...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que denunciar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por JST, el establecimiento de becas universitarias para la creación de innovación científica y tecnológica (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), una subvención para becarios de JSPS (A.HT.; 23KJ2078), una subvención para la investigación científica (B) JSPS KAKENHI (22H02946 para TM), una subvención para la investigación científica en áreas innovadoras titulada "Envejecimiento de las proteínas cerebrales y control de la demencia" del MEXT (TM; 26117004), y por la beca de investigación Uehara de la Fundación Uehara Memorial (TM; 202020027). Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CAJA DE TUBO DE 1,5 ML DE 500Beckman Coulter357448
1A2Sigma-AldrichT9028dilución 1:5.000
ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES)Nacalai Tesque02442-44
300 kDa columna de centrifugación de ultrafiltraciónAprosciencePT-1013
6-11B1Sigma-AldrichT74511:5.000 dilución
Ä KTAprime plusCytiva11001313
anti-ratón IgGJackson ImmunoResearch115-035-146dilución 1:5.000
antidolorPeptide Institute Inc.4062
aprotininaNacalai Tesque03346-84
Chemi-Lumi One LNacalai Tesque07880-54
Sistema de filtro de vacío con tapa de botellaCorning4307580.22µ m 33.2cm² membrana de nitrocelulosa
DIFPSigma-Aldrich55-91-4 
HOMOGENEIZADOR DIGITAL HK-1AS ONE1-2050-11
DM1ASigma-AldrichT9026dilución 1:5.000
DTTNacalai Tesque14128-46
EGTANacalai Tesque37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll Pall CorporationBSP0161
glicerolNacalai Tesque17018-25
GTPNacalai Tesque17450-61
MICRO CENTRÍFUGA REFRIGERADA DE ALTA VELOCIDAD KitmanTOMYKITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg columnaCytiva28-9893-35
Software de medición de imagen FUJIFILUM Wako Corporación Química Pura
ImmunoStar LD FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation292-69903
KMX-1MilliporeMAB3408dilución 1:5.000
Analizador de imágenes luminiscentes LAS-4000FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptinaPeptide Institute Inc.43449-62
MgSO4Nacalai Tesque21003-75
Na3VO4Nacalai Tesque32013-92
NaFNacalai Tesque31420-82
ácido okadaicoLC LaboratoriesO-2220 
OPTIMA MAX-XPBeckman Coulter393315
pepstatinaNacalai Tesque26436-52
PMSFNacalai Tesque27327-81
Tubos de centrífuga de policarbonato para TLA120.2Beckman Coulter343778
Cóctel de inhibidores de la proteasa (cOmplete™, sin EDTA)Roche11873580001
Tubulina purificada CitoesqueletoT240
QSONICA Q55QSonicaQ55
TaxolLC LaboratoriesP-9600
Rotor TLA-120.2Beckman Coulter357656
Rotor TLA-55Beckman Coulter366725
TLCKNacalai Tesque34219-94
Triton X-100Nacalai Tesque12967-45
β-glicerofosfatoSigma-AldrichG9422

Referencias

  1. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  2. Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
  3. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  4. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  5. Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
  6. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the neuronal microtubule cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  7. Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
  8. Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  9. Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207(2017).
  10. Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
  11. Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837(2013).
  12. Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
  13. Zhang, F., et al. Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease. Translational Neurodegeneration. 4, 9(2015).
  14. Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
  15. Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
  16. Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
  17. Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
  18. Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
  19. Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
  20. Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
  21. Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
  22. Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
  23. Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
  24. Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
  25. Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
  26. Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
  27. Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
  28. Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
  29. Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
  30. Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
  31. Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
  32. Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
  33. Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415(2018).
  34. Boiarska, Z., Passarella, D. Microtubule-targeting agents and neurodegeneration. Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

T cnica de ultracentrifugaci nmodificaciones de la tubulinaWestern blotestabilidad de los microt bulosdin mica del citoesqueleto

Artículos relacionados