La tasa de consumo de oxígeno (OCR) es un indicador común de la función mitocondrial y se puede utilizar para estudiar diferentes modelos de enfermedades. Desarrollamos un nuevo método utilizando un analizador Seahorse XF para medir directamente el OCR en rodajas estriatales agudas de ratones adultos que es más relevante fisiológicamente que otros métodos.
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Artículo de método
Medición de la tasa de consumo de oxígeno en rodajas estriatales agudas de ratones adultos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las mitocondrias juegan un papel importante en la producción celular de ATP, la regulación de especies reactivas de oxígeno yel control de la concentración de Ca 2+. La disfunción mitocondrial se ha implicado en la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Alzheimer. Para estudiar el papel de las mitocondrias en los modelos de estas enfermedades, podemos medir la respiración mitocondrial a través de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) como un proxy de la función mitocondrial. El OCR ya se ha medido con éxito en cultivos celulares, así como en mitocondrias aisladas. Sin embargo, estas técnicas son menos relevantes fisiológicamente que la medición de OCR en cortes cerebrales agudos. Para superar esta limitación, los autores desarrollaron un nuevo método utilizando un analizador Seahorse XF para medir directamente el OCR en cortes estriatales agudos de ratones adultos. La técnica está optimizada con un enfoque en el cuerpo estriado, un área del cerebro involucrada en la EP y la enfermedad de Huntington. El analizador realiza un ensayo de células vivas utilizando una placa de 24 pocillos, que permite la medición cinética simultánea de 24 muestras. El método utiliza piezas perforadas circularmente de cortes de cerebro estriatal como muestras. Demostramos la efectividad de esta técnica mediante la identificación de un OCR basal inferior en rodajas estriatales de un modelo de ratón de EP. Este método será de amplio interés para los investigadores que trabajan en el campo de la EP y la enfermedad de Huntington.
Introducción
La disfunción mitocondrial se ha implicado en varias enfermedades neurológicas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Alzheimer 1,2,3. Los modelos de DP como los ratones y ratas PINK1 knockout (KO) muestran una función mitocondrial deteriorada 4,5,6,7,8,9,10,11.....
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Protocolo
Todos los procedimientos, incluido el trabajo con animales, se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas nacionales e internacionales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Thomas Jefferson. Se utilizaron ratones machos FVB/NTac a la edad de 3 a 14 meses. Los siguientes pasos se realizaron en un entorno no estéril, pero se debe tener precaución para mantener todo lo más limpio posible.
NOTA: El método aquí presentado fue establecido y utilizado en la investigación reportada por Zhi et al.24. Los experimentos descritos aquí utilizaron un analizador de flujo extracelular Seahors....
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Resultados
El primer paso de este estudio fue optimizar el grosor de la rebanada y el tamaño del punzón utilizado para extirpar una sección del cuerpo estriado de la rebanada (Figura 3A). Una rebanada de 150 μm de espesor y un tamaño de punzonado de 1,5 mm dieron los mejores resultados determinados por la eficiencia de acoplamiento (Figura 3B-C). Como se muestra en la Figura 3B, el OCR es relativamente estable.......
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Discusión
El método que desarrollamos permitió utilizar un analizador XF para medir OCR en rodajas estriatales de ratones adultos durante un período de tiempo de 4 h. Este método proporciona una nueva forma de medir la bioenergética celular en punzones extirpados de estructuras cerebrales definidas anatómicamente. Dado que las muestras de tejido que se analizan son bastante pequeñas, se pueden investigar los parámetros metabólicos de áreas cerebrales específicas involucradas en una enfermedad. Además, el uso de rebanadas agudas im.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Wangchen Tsering y Pamela Walter por su lectura crítica y edición de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) (NS054773 a C.J. L. y NS098393 a H.Z.) y el Departamento de Neurociencia de la Universidad Thomas Jefferson (Startup Funds a H.Z.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Accumet AB150 Medidor de pH de sobremesa | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | Para medir el pH |
| Antimicina A de Streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | Para inhibir el complejo III de las mitocondrias |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | SIGMA | A6003 | Para producir líquido cefalorraquídeo artificial modificado (BSA-ACSF) |
| Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) | SIGMA | C2920 | Para desacoplar la respiración mitocondrial |
| D-Glucosa | SIGMA | G8270 | Para producir líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | Para distribuir compuestos |
| HEPES | SIGMA | H3375 | Para hacer líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) |
| Incubadora humidificada sin CO2 | Fisher Scientific | 11-683-230D | Para hidratar placas a 37 &° C |
| Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | Para inhibir la ATP sintasa mitocondrial |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | película de sellado | |
| Rotenona | Tocris | 3616 | Para inhibir el complejo I de las mitocondrias Caballito de |
| mar XF Solución calibrante 500 mL | Caballito de mar Bioscience | 103681-100 | Solución para la calibración de caballitos de mar |
| Analizador de flujo extracelular Seahorse XF Equipo | biociencia | de mar utilizado para analizar la tasa de consumo de oxígeno, | |
| analizador de flujo extracelular Seahorse XFe24 | biociencia | utilizado para analizar la tasa de consumo de oxígeno, nueva generación | |
| Caballito de mar XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Paquete de cartuchos de sensores de analizador de flujo, placas de cultivo de tejidos, pantallas de captura, etc. solución de calibrador y placas de calibración; kit de ensayo. |
| Piruvato de sodio | SIGMA | P2256 | Para evitar cualquier restricción limitante del sustrato en el suministro de sustrato |
| Punzones de biopsia de acero inoxidable | Miltex | Dispositivo utilizado para perforar rodajas | |
| Placa de cultivo celular estéril, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Se utiliza para el punzón de lonchas |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Para cortar tejido cerebral |
| Baño | de aguaThermo Scientific Precision | 282-115 | Para tampón de calor y soluciones |
Referencias
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondria....
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Reimpresiones y permisos
