Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Förster Resonans Energy Transfer Mapping: En ny metode til at belyse globale strukturelle træk

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

Undersøgelsen beskriver metoden til FRET-kortlægning, herunder valg af mærkningssteder, valg af farvestoffer, erhvervelse og dataanalyse. Denne metode er effektiv til bestemmelse af bindingssteder, konformationsændringer og dynamiske bevægelser i proteinsystemer og er mest nyttig, hvis den udføres sammen med eksisterende 3D-strukturelle oplysninger.

Abstract

Förster resonans energioverførsel (FRET) er en etableret fluorescensbaseret metode, der anvendes til succesfuldt at måle afstande i og mellem biomolekyler in vitro såvel som i celler. I FRET vedrører effektiviteten af energioverførsel, målt ved ændringer i fluorescensintensitet eller levetid, afstanden mellem to fluorescerende molekyler eller etiketter. Bestemmelse af dynamik og konformationsændringer fra afstandene er blot nogle eksempler på anvendelser af denne metode til biologiske systemer. Under visse omstændigheder kan denne metode tilføje til og forbedre eksisterende røntgenkrystalstrukturer ved at give information om dynamik, fleksibilitet og tilpasning til bindende overflader. Vi beskriver brugen af FRET og tilhørende afstandsbestemmelse til at belyse strukturelle egenskaber gennem identifikation af et bindingssted eller orienteringen af dimerunderenheder. Gennem velovervejet valg af mærkningssteder og ofte anvendelse af flere mærkningsstrategier har vi med succes anvendt disse kortlægningsmetoder til at bestemme globale strukturelle egenskaber i et protein-DNA-kompleks og SecA-SecYEG-proteintranslokationssystemet. I SecA-SecYEG-systemet har vi brugt FRET-kortlægningsmetoder til at identificere præproteinbindingsstedet og bestemme den lokale konformation af det bundne signalsekvensområde. Denne undersøgelse skitserer trinene til udførelse af FRET-kortlægningsundersøgelser, herunder identifikation af passende mærkningssteder, diskussion af mulige etiketter, herunder ikke-indfødte aminosyrerester, mærkningsprocedurer, hvordan man udfører målinger og fortolkning af dataene.

Introduction

For proteiner fører belysning af dynamik sammen med 3-dimensionel (3-D) strukturel viden til en forbedret forståelse af struktur-funktionsforhold mellem biomolekylære systemer. Strukturelle metoder, såsom røntgenkrystallografi og kryogen elektronmikroskopi, fanger en statisk struktur og kræver ofte bestemmelse af flere strukturer for at belyse aspekter af biomolekylebinding og dynamik1. Denne artikel diskuterer en løsningsbaseret metode til kortlægning af globale strukturelle elementer, såsom bindingssteder eller bindingsinteraktioner, der potentielt er mere forbigående og mindre lette at fange ved statiske metoder. Stærke kandidatsystemer til denne metode er dem, hvor en 3D-struktur tidligere er blevet bestemt ved røntgenkrystallografi, NMR-spektroskopi eller andre strukturelle metoder. I dette tilfælde udnytter vi røntgenkrystalstrukturen i SecA-SecYEG-komplekset, en central aktør i proteinets generelle sekretoriske vej, til at kortlægge placeringen af et signalpeptidbindingssted ved hjælp af Förster resonansenergioverførsel (FRET) inden transport af præproteinet over membranen2. Manipulation af det biologiske system gennem genetiske modifikationer kombineret med vores viden om 3D-strukturen muliggjorde bestemmelsen af konformationen af signalsekvensen og det tidlige modne område umiddelbart før indsættelse i kanal 3.

FRET involverer strålingsfri overførsel af energi fra et molekyle (donor) til et andet (acceptor) på en afstandsafhængig måde, der er gennem rum 4,5. Effektiviteten af denne overførsel overvåges gennem enten et fald i donor eller en stigning i acceptorfluorescensintensitet. Effektiviteten af energioverførsel kan beskrives som

E = R06/(R06 + R6)

hvor R0-værdien er den afstand, hvor overførslen er 50% effektiv6. Teknikken er tidligere blevet beskrevet som en molekylær lineal og er effektiv til at bestemme afstande i området 2,5-12 nm, afhængigt af identiteten af donoracceptorfarvestofferne 4,7,8,9. Donorfluorescensensensiteterne og levetiderne med eller uden acceptor gør det muligt at bestemme overførselseffektiviteten og dermed afstande 5,8. På grund af teknologiens tilgængelighed, metodens følsomhed og brugervenlighed har FRET også fundet bred anvendelse på områder som enkeltmolekyle fluorescensspektroskopi og konfokal mikroskopi6. Fremkomsten af fluorescerende proteiner såsom grønt fluorescerende protein har gjort observationen af intracellulær dynamik og levende celledannelse relativt letkøbt10,11. Mange FRET-applikationer som disse diskuteres detaljeret i dette virtuelle nummer.

I denne undersøgelse fokuserer vi især på brugen af FRET-målinger til at give afstandsværdier til bestemmelse af strukturelle detaljer. Tidligere er FRET-målinger blevet anvendt effektivt til at bestemme konformationen af DNA-molekyler, når de er bundet til protein 12,13,14, proteiners indre dynamik og proteinbindingsinteraktioner 15,16,17. Fordelene ved denne metode ligger i evnen til at bestemme fleksible og dynamiske strukturelle elementer i en løsning med relativt lave mængder materiale. Det er vigtigt, at denne metode er særlig effektiv, når den anvendes sammen med eksisterende strukturelle oplysninger og ikke kan bruges som et middel til bestemmelse af 3D-struktur. Metoden giver den bedste indsigt og forfinelse af struktur, hvis arbejdet bygger på eksisterende strukturelle oplysninger ofte kombineret med beregningssimulering18,19. Her beskrives brugen af afstande opnået fra steady-state og tidsopløste FRET-målinger til at kortlægge et bindingssted, hvis placering ikke var kendt, på en eksisterende krystallografisk struktur af SecA-SecYEG-komplekset, større proteiner i den generelle sekretoriske vej3.

Den generelle sekretoriske vej, et stærkt bevaret system fra prokaryoter til eukaryoter til arkæer, formidler transporten af proteiner enten over eller ind i membranen til deres funktionelle placering i cellen. For gramnegative bakterier, såsom E. coli, den organisme, der anvendes i vores undersøgelse, indsættes proteiner i eller translokeres over den indre membran til periplasmen. Det bakterielle SecY-kanalkompleks (kaldet translocon) koordinerer med andre proteiner for at translokere det nyligt syntetiserede protein, som er rettet mod dets korrekte placering i cellen gennem en signalsekvens, der typisk er placeret ved N-terminalen20,21. For proteiner bundet til periplasmen associeres ATPase SecA-proteinet med ribosomets udgangstunnel og med præproteinet, efter at ca. 100 rester er blevet oversat22. Sammen med SecB chaperone-proteinet opretholder det præproteinet i en udfoldet tilstand. SecA binder sig til SecYEG-translocon og letter gennem mange cyklusser af ATP-hydrolyse proteintransport over membranen23,24.

SecA er et multidomæneprotein, der findes i cytosoliske og membranbundne former. Et homodimerisk protein i cytosolen, SecA består af et præproteinbindende eller tværbindende domæne25, to nukleotidbindende domæner, et spiralformet vingedomæne, et spiralformet stilladsdomæne og to helixfinger (THF)26,27,28,29 (figur 1). I tidligere krystallografiske undersøgelser af SecA-SecYEG-komplekset antydede placeringen af THF, at det var aktivt involveret i proteintranslokation, og efterfølgende tværbindingseksperimenter med signalpeptidet fastslog yderligere betydningen af denne region i proteintranslokation30,31. Tidligere undersøgelser ved hjælp af FRET-kortlægningsmetoden viste, at eksogene signalpeptider binder til denne region af SecA 2,32. For fuldt ud at forstå konformationen og placeringen af signalsekvensen og den tidlige modne region af præproteinet inden indsættelse i SecYEG-kanalen blev der oprettet en proteinkimera, hvor signalsekvensen og resterne fra det tidlige modne område blev fastgjort til SecA gennem en Ser-Gly-linker (figur 1). Ved hjælp af denne biologisk levedygtige konstruktion blev det yderligere demonstreret, at signalsekvensen og den tidlige modne region af præproteinet binder til THF på en parallel måde2. Efterfølgende blev FRET-kortlægningsmetoden brugt til at belyse konformationen og placeringen af signalsekvensen og det tidlige modne område i nærværelse af SecYEG som beskrevet nedenfor3.

Kendskab til 3D-strukturen i SecA-SecYEG-komplekset 33,34,35 og den mulige placering af bindingsstedet gjorde det muligt for os med omtanke at placere donor-acceptor-etiketter på steder, hvor skæringspunktet mellem individuelle FRET-afstande identificerer bindingsstedets placering. Disse FRET-kortlægningsmålinger afslørede, at signalsekvensen og det tidlige modne område af præproteinet danner en hårnål med spidsen placeret ved mundingen af SecYEG-kanalen, hvilket viser, at hårnålstrukturen er skabeloniseret før kanalindsættelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udvælgelse af mærkningssteder

  1. Identificer mindst tre potentielle mærkningssteder for at triangulere det formodede bindingssted på de eksisterende proteinstrukturer. I dette tilfælde blev SecA, SecYEG og preprotein knyttet til SecA gennem genetisk fusion identificeret2.
    1. Vælg mærkningssteder inden for 25-75 Å fra det formodede bindingssted, og i relativt statiske områder af proteinet bestemmer afstanden det specifikke FRET-farvestofpar, der skal bruges36. Find mærkningsstederne i proteinområder, der er relativt forskellige fra hinanden, så stederne beskriver hjørnerne af en trekant med det formodede bindingssted placeret i midten (figur 1A-D).
    2. Indføre eller identificere cysteinrester (Cys) på mærkningssteder af interesse for et protein, der ikke har andre Cys-rester, for at forbedre mærkningseffektiviteten på det specifikke sted37,38.
    3. Indfør unaturlige aminosyrer, fx p-azidophenylalanin til mærkning med klikkemi, for effektivt at mærke et protein i to forskellige positioner med forskellige farvestoffer39,40.
    4. Test Cys-mutanterne for tab af funktion. Kontroller aktiviteten af den cysløse mutant og den unaturlige aminosyremutant ved hjælp af et passende aktivitetsassay. I dette tilfælde blev aktiviteten verificeret med et vækstassay efterfulgt af et in vitro malakitgrønt ATPase-assay 32,41,42

2. Mærkning af proteinet

  1. Rens proteinet eller proteinerne af interesse til mindst 95% renhed for nøjagtig mærkning. Rens SecA- og SecYEG-proteiner efter protokoller, der er beskrevet i reference3. Sørg for, at du har mindst 5 μg renset protein til dette trin, da noget protein vil gå tabt under mærkningsprocessen.
  2. Vælg to farvestoffer til FRET-målinger afhængigt af deres R0-værdi og de forudsagte afstande mellem mærkede steder. Estimer R0-værdier , og observer overlapningen mellem donoremission og acceptorabsorbans ved hjælp af oplysningerne fra den fluorescerende proteindatabase, som også giver spektre for almindeligt anvendte farvestoffer (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    BEMÆRK: R0 defineres som den afstand, hvor overførselseffektiviteten er 50% for et givet farvestofpar. Til kortlægningseksperimenter skal forudsagte afstande være tæt på farvestofparrets R0-værdi for at sikre, at afstande kan måles nøjagtigt.
  3. De positioner, der er angivet i trin 1.1.1, mærkes. med donor-acceptor farvestofparret.
    1. Mærk proteinet i henhold til producentens anvisninger med særlig opmærksomhed på parametre som optimal proteinkoncentration, temperatur, pH, tidslængde og buffer for de specifikke anvendte farvestoffer43,44.
    2. Proteinet fremstilles i en koncentration på 1-2 mg/ml eller ca. 10 μM i en 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) buffer. Farvestof opløses i dimethylformamid (DMF) eller dimethylsulfoxid (DMSO) til en slutkoncentration på 1 mM. Farvestoffet tilsættes dråbevis til opløsningen under omrøring for at nå et farvestof: proteinmolært forhold på 5: 1 (50 μM farvestof: 10 μM protein).
    3. Reaktionen lades fortsætte i 4 timer ved stuetemperatur (RT) i et hætteglas med let vippe eller natten over ved 4 °C. Stop reaktionen ved at tilsætte β-mercaptoethanol.
      BEMÆRK: Hvis protein ikke er kompatibelt med Tris-buffer, kan fosfat- eller HEPES-buffere anvendes. Oprethold pH i området 7,0-7,5. Hvis proteinet har disulfidbindinger, tilsættes et reduktionsmiddel som DTT eller TCEP inden mærkning. Fjern DTT ved dialyse eller gelfiltrering, inden der tilsættes farvestof.
  4. For nøjagtige FRET-målinger fjernes det frie farvestof med en centrifugalkoncentrator med en passende molekylvægtafskæring (MWCO) for at lade det frie farvestof strømme igennem, mens det mærkede protein bevares.
    1. Koncentratormembranen klargøres ved at anbringe ~ 1 ml vand i den øverste del af en 3 ml koncentrator, og centrifuger derefter vandet gennem membranen (mindst 10 min. ved 4.300 x g).
    2. Frit farvestof fjernes ved centrifugering af den mærkede prøve i koncentrator (20 min ved 4.300 x g). Gentag 3-4 gange og bortskaf strømmen igennem.
    3. Kontroller mærkningseffektiviteten af det mærkede protein ved hjælp af UV-Vis absorptionsspektroskopi.
      BEMÆRK: FRET-målinger kræver mærkningseffektivitet på 50% eller derover. Lavere mærkningseffektivitet reducerer FRET-signalet og kan føre til unøjagtigheder i målingen.
    4. Opnå et UV-Vis spektrum af det mærkede protein med et interval fra 250-700 nm for at observere både proteinabsorptionsbåndet og farvestoffets maksimale absorptionsbånd. Absorbansen måles ved absorptionstoppen af farvestof og ved 280 nm for protein.
    5. Koncentrationen af protein bestemmes, og der korrigeres for eventuelle bidrag fra farvestoffet ved hjælp af korrektionsfaktoren CF og følgende ligninger45,46:
      Equation 1
      hvor C er koncentrationen af proteinet (M), A280 er prøveabsorbansen ved 280 nm, Amax er absorbansen ved farveabsorptionsmaksimum, ε protein er udryddelseskoefficienten for proteinet ved 280 nm og CF er korrektionsfaktoren, A'280/A'max, hvor A'280 er absorbansen ved 280 nm og A'max er absorbansen ved maksimum for farvestoffet.
    6. Bestem mærkningseffektivitet ved hjælp af følgende ligning:
      Equation 2
      hvor εfarvestof er farvestoffets molære udryddelseskoefficient, C er koncentrationen af proteinet som bestemt i trin 2.4.5, og E er mærkningseffektiviteten. Gentag trin 2.4.2, indtil mærkningseffektivitetsværdien er plateauet og er mindre end 100%.

3. Bestem R 0-værdierne

  1. Mål R0-værdierne in situ. Forbered to proteinprøver ved samme koncentration af total protein, 4 μM, en med proteinet mærket med donorfarvestoffet og en med proteinet mærket med acceptorfarvestoffet kun. For SecA fungerer en proteinkoncentration på 4 μM SecA monomer godt til disse målinger.
    1. Der forberedes prøvevolumener på 2,5 ml for en kuvette på 1 cm x 1 cm, 600 μL for en kuvette på 5 mm x 5 mm eller 200 μL for en kuvette på 3 mm x 3 mm.
  2. Tænd fluorometeret, og åbn spektralopsamlings- og analyseprogrammet i fluorescenssoftwaren, hvis du bruger et spektrofluorometer. Klik på det røde M for at slutte computeren til instrumentet (figur 2A), og vælg Emissionsspektre.
    1. Angiv scanningsparametre som excitationsbølgelængde, området for emissionsscanning, temperatur og prøveskifterposition ved hjælp af menupunktet Saml eksperiment (Figur 2B).
    2. Klik på RTC og optimer instrumentindstillinger (f.eks. spektralspalter) ved at overvåge fluorescensemissionen ved toppen ved hjælp af en excitationsbølgelængde indstillet til farvestoffets absorptionsmaksimum. For SecA skal du indstille følgende indstillinger: båndpas som 1 nm; excitations- og emissionsspalter som henholdsvis 1 og 1,5 mm med temperatur ved 25 °C og omrøringshastighed ved 250 o/min.
      BEMÆRK: Overskrid ikke instrumentets kapacitet pr. sekund (cps) (typisk 2 x 106 cps).
  3. Placer den donormærkede proteinprøve i prøveholderen, og klik på Kør for at generere en emissionsscanning af proteinet, der kun er mærket med donorfarvestoffet (donorprotein) ved at spændende prøven ved farvestofabsorptionsmaksimum (f.eks. 488 nm for AF488) og scanne over emissionstoppen (505-750 nm for donor kun SecA-protein mærket med AF488).
  4. Opret en basislinje for scanningen ved at forlænge scanningen 25-50 nm forbi slutningen af toppen. Mål kvanteudbyttet af donorproteinet ved at udføre absorptions- og fluorescensmålinger på prøver af forskellige koncentrationer som beskrevet47. Oprethold de samme spalteindstillinger for disse målinger.
    1. Brug frit donorfarvestof som reference for kvanteudbyttet. Opnå mindst fire målinger af donorproteinet og det frie farvestof i forskellige koncentrationer for en nøjagtig bestemmelse.
    2. Fluorescensintensiteten eller det integrerede område afbildes i forhold til absorbansen for proteinet, der kun er donor, og det frie farvestof eller referencen. Bestem hældningerne for donorproteinet (hældningD) og referencen (hældningR).
    3. Kvanteudbytte (Φ) beregnes ved hjælp af følgende ligning:
      Equation 3
      her er ΦD kvanteudbyttet af donorproteinet, ΦR er kvanteudbyttet af det frie farvestof (dette kan normalt fås fra producenten), hældningD og hældningR er de skråninger, der bestemmes i trin 3.4.2 for henholdsvis donorproteinet og referencen og ηD og ηR repræsenterer brydningsindekset for henholdsvis donorproteinet og de referencefrie farvestofopløsninger 47.
  5. Få et absorptionsspektrum af dit acceptor-only protein ved hjælp af en 1 cm pathlength celle. Generer et udryddelseskoefficientspektrum for dit acceptor-only protein ved at dividere absorptionsspektret med farvestofkoncentrationen.
  6. Generer det spektrale overlapningsintegral, J (λ) ved hjælp af et grafisk analyseprogram. Et standard regnearksprogram (f.eks. Regneark) kan også bruges til denne proces.
    1. Multiplicer fluorescensemissionsspektret for donorproteinet (trin 3.4) med udryddelseskoefficientspektret for det protein, der kun er acceptor, for at generere overlapningsspektret.
    2. Multiplicer det resulterende overlapningsspektrum med λ4.
    3. Bestem området under kurven ved integration af overlapningsregionen. Overlapningsregionen defineres som det område, hvor donoremissionsspektret ganget med acceptorudryddelseskoefficientspektret giver positive værdier. Det spektrale overlapningsintegragral er defineret som:
      Equation 4
      hvor FD (λ) er emissionsspektret for donorproteinet (opnået i trin 3.4), og εA(λ) er udryddelseskoefficientspektret for det protein, der kun er accepteret, og har enheder af M-1 cm-1 (opnået i trin 3.5). Det resulterende spektrale overlapningsintegral skal have enheder på M-1 cm-1nm4.
    4. Normaliser spektral overlapningsintegralet. Opdel overlapningsintegralet med det integrerede område af donorproteinspektret over det samme spektralområde:
      Equation 5
    5. Beregn R0-værdien i Å ved hjælp af følgende ligning:
      Equation 6
      hvor κ2 er orienteringsfaktoren, typisk taget som 2/3 for frit roterende farvestoffer, η er brydningsindekset og kan tilnærmes som 1,33 for fortyndede vandige opløsninger, QD er donorens kvanteudbytte (trin 3.4) og J(λ) er det spektrale overlapningsintegragraler som bestemt i trin 3.6.35. BEMÆRK: Hvis farvestofferne ikke roterer frit, kan korrektioner indføres som beskrevet af Ivanov 48 og implementeret af Auclair49 og Zhang 2,3.

4. Udfør FRET-spektralmålinger

  1. Forbered proteinprøver, der kun er donor, protein, der kun er accepteret, og donoracceptorproteinprøver i samme koncentration; en koncentration på 4 μM anbefales. Brug 200 μL opløsning, hvis du bruger en 3 mm x 3 mm kuvette, 600 μL, hvis du bruger en 5 mm x 5 mm kuvette, eller 2,5 ml, hvis du bruger en 1 cm x 1 cm kuvette.
    1. Forbered donor-acceptorproteinprøven ved kun at anvende lige store molære mængder af donor- og acceptorproteinet.
    2. Oprethold den samme mængde mærket prøve kun i kontroldonor og kun acceptor proteinprøver gennem introduktion af umærket protein i lige stor molær mængde til enten donoren alene eller kun acceptorprøver. For opløsninger med samme koncentration vil hver FRET-prøve, der kun er donor, f.eks. indeholde 100 μL donorprotein og 100 μL umærket protein til et volumen på 200 μL.
  2. Generer fluorescensemissionsspektre for donoren, kun acceptor og donoracceptorprøver. Optimer signalet som beskrevet i trin 3.2. Når de er optimeret, skal du opretholde de samme indstillinger for alle prøverne.
    1. Få scanningen kun for donor som beskrevet i trin 3.3. Exciter opløsningen ved donorfarveabsorptionsmaksimum og scan over donor- og (forventede) acceptoremissionstoppe.
    2. Del enten prøven med proteinet, der kun er accepteret, eller prøvevekslerpositionen ændres til kuvetten, der indeholder proteinet, der kun er accepteret.
    3. Der foretages en emissionsscanning af proteinet, der kun er mærket med acceptorfarvestof (kun acceptorprotein) med de samme indstillinger som i trin 4.2.1. Exciter prøven ved donorens excitationsbølgelængde.
      BEMÆRK: Dette spektrum giver en korrektion for mængden af acceptor, der er exciteret ved donorbølgelængden (FA i trin 5.1.2)
    4. Ombytningsprøven med donor-acceptor-proteinprøven, eller prøveskifterpositionen ændres til kuvetten, der indeholder donoracceptormærket protein.
    5. Der foretages en emissionsscanning af donoracceptorproteinprøven med de samme indstillinger som i trin 4.2.1 og 4.2.3.
    6. For alle spektre korrigeres for baggrundsfluorescens ved at trække baggrundstællingerne målt i slutningen af scanningen.
  3. Kun donorlevetiden og donoracceptorprøverne, der er udarbejdet som beskrevet i trin 4.1.2, måles. Brug et tidskorreleret enkeltfotontællingsfluorescensinstrument, der er i stand til at måle og opløse fluorescerende henfald i nanosekundets (10-9 s) tidsinterval.
    BEMÆRK: For FRET-farvestofpar skal du matche excitationslyskilden til absorptionsmaksimum for donorfarvestoffet.
    1. Tænd for instrumentet. Åbn anskaffelsessoftwaren, brug instrumentstyringssoftwaren til dataindsamling med fluorescensspektrometeret.
    2. Til anskaffelse skal du vælge TCSPC Decay med et tidsinterval på 55 ns, en forstærkning på 1 og 4096 kanaler.
    3. Opnå en instrumentresponsfunktion (IRF) ved hjælp af en opløsning af ikke-mælkecreme eller kommerciel spredningsopløsning, og overvåg spredningen ved 490 nm. Juster spalteindstillingen, og brug neutrale densitetsfiltre efter behov for at opretholde en lav nok tællehastighed for at undgå pulsophunkning5. Klik på Acceptér og derefter på Start. Dette vil starte overtagelsen.
      BEMÆRK: En maksimal tællehastighed på 4000 cps bruges til en gentagelseshastighed på 180 kHz.
    4. Saml IRF ved 490 nm, indtil topkanalen har maksimalt 20.000 tællinger. Saml en IRF før og efter måling af hvert fluorescenshenfald.
    5. Opnå fluorescenshenfaldene fra donor- og donoracceptorprøverne ved at overvåge fluorescensemissionen ved donoremissionsbølgelængden, 520 nm.
    6. Juster spalteindstillingerne for en maksimal antalshastighed på 4000 cps eller mindre. Spalteindstillinger er typisk 15-20 nm båndpas til proteinprøver. Saml henfaldet, indtil der opnås 20.000 tællinger i topkanalen.
  4. Analyser henfaldet eller fluorescensintensiteten (I) som en funktion af tiden (t) for fluorescenslevetiden (τ). Tilpas henfaldet til en sum af eksponentieller med følgende ligning:
    Equation 7
    hvor αI er den præeksponentielle faktor for den i th komponent og τI er levetiden. Pasformen er rekoncentreret med IRF for at matche fluorescenshenfaldet. Bedømmer kvaliteten af pasformen ud fra de reducerede Χ2-parametre.

5. Analyse af FRET-data

  1. Fret-effektiviteten beregnes ud fra faldet i donorintensiteten af donoracceptorprøven i forhold til donoren kun med følgende ligning.
    Equation 8
    hvor FDA er fluorescensintensiteten af donor-acceptorprøven, og FD er fluorescensintensiteten af donorprøven, der kun er på toppen af donorfluorescensen. Brug de integrerede områder af toppe, hvis dataene er støjende.
    1. Korrigere for eventuelle forskelle i mærkning mellem donor- og donoracceptorprøver. Beregn korrektioner baseret på donorgraden af mærkning som følger.
      Equation 9
      hvor fDA er donormærkningseffektiviteten i donoracceptorprøven, og fD er mærkningseffektiviteten i donorprøven.
    2. Korrigeres for eventuelle bidrag fra acceptorfluorescensen til det donor-exciterede spektrum gennem subtraktion af proteinspektret, der kun er accepteret (trin 4.2) fra donor-acceptorproteinspektret.
      Equation 14
    3. Korrigeres for forskellene i mærkningseffektiviteten af acceptorproteinet i forhold til donoracceptorproteinprøven, hvilket giver følgende ligning til beregning af effektivitet:
      Equation 10
      hvor fA angiver den brøkdel af acceptormærkning. Denne ligning inkluderer alle korrektioner på grund af farvestofmærkning og acceptorfluorescens.
    4. Beregn FRET-afstande fra effektivitetsgevinsterne ved hjælp af følgende ligning:
      Equation 11
      ved anvendelse af R0-værdien opnået i trin 3.6.5.
    5. Fret-effektiviteten beregnes udelukkende ved hjælp af fluorescenslevetider for donoren og donoracceptorprøver målt i trin 4.3.3-4.3.5:
      Equation 12
    6. Brug den amplitudevægtede levetid til at beregne FRET-effektivitet og sammenligne med steady state-resultater5.
      Equation 13
    7. Afstanden som i trin 5.1.4 beregnes ud fra de effektivitetsgevinster, der bestemmes af fluorescensens levetid. Sammenlign steady state- og tidsopløste værdier for FRET-effektivitet og afstande, og sørg for, at de er inden for fejl fra hinanden.

6. Kortlægning af afstande

  1. Brug de beregnede afstande til at kortlægge bindingsstedet på den tredimensionelle struktur. Afstande og fejl for alle undersøgte farvestofpar og -steder beregnes ved hjælp af ligningen i trin 5.1.4 og R0-værdier opnået i trin 3.6.5 for hvert FRET-par.
    1. Brug et 3D grafisk visningsprogram som PyMOL50 til at kortlægge afstandene til strukturen (script givet i supplerende fil). Kommandoer fra scriptet kan indtastes direkte i kommandovinduet med de relevante afstandsoplysninger.
    2. Der genereres en skal for hver målt afstand og den tilhørende fejl (figur 3, figur 4, supplerende figur 1-3).
    3. Kortlæg positionen gennem krydset mellem de forskellige skaller (supplerende figur 1-3). Signalpeptidbindingsstedet blev kortlagt gennem de tre forskellige placeringer på SecA og SecYEG og fire forskellige placeringer på signalpeptidet (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne undersøgelse fokuserede på at bestemme placeringen af præproteinbindingsstedet på SecA inden indsættelse af præproteinet i SecYEG-kanalen. For at kortlægge bindingsstedet blev FRET-eksperimenter udført mellem forskellige regioner af præproteinet og tre forskellige steder på SecA- og SecYEG-proteinerne (figur 1A-D). Fra de opnåede afstande og tredimensionelle strukturer af SecA, SecYEG og preproteinet blev placeringen af præproteinbindingsstedet forudsagt. I stedet for at anvende tre separate enheder (SecA, SecYEG og preprotein) til at udføre disse målinger, blev PhoA-signalsekvensen knyttet til SecA gennem genetisk modifikation efter inkorporering af en Gly-Ser-linker 2,3. Til letkøbt mærkning med farvestoffer blev Cys-rester eller ravmutationer introduceret ved rest 2, 22, 35 og 45 i PhoA-præproteinet (figur 1E).

Identifikation af steder og mærkning
Et formodet bindingssted for signalsekvensen var tidligere blevet identificeret ved hjælp af lignende FRET-kortlægningsmetoder 2,32. Disse og andre undersøgelser havde identificeret to-helixfingeren (THF) og præprotein-tværbindingsdomænet som mulige bindingssteder for signalpeptidet med en foreslået orientering i en parallel position til THF 33,51,52,53,54 (figur 1F). Således blev identifikation af potentielle mærkningssteder på SecA- og SecYEG-proteinerne udført baseret på placeringen af det formodede bindingssted i SecA- og SecYEG-krystalstrukturen (vist med grønt i figur 1A-D). Tre steder blev valgt til at triangulere placeringen af det formodede bindingssted, hvor de tre steder i det væsentlige danner en trekant omkring det formodede bindingssted. Som vist i figur 1 lå de tre steder inden for FRET-området på bindingsstedet (50-70 Å). Farvestofparret Alexa Fluor 488 (AF488) og Alexa Fluor 647 (AF647) blev valgt, da R0-værdien på 55,7 Å36 svarer godt til de forventede afstande mellem de mærkede steder og det formodede bindingssted, der sikrer målenøjagtighed.

De tre steder, der er valgt til mærkning, SecA37, SecA321 og SecY292 (vist som magenta-, violet- og cyankugler i figur 1A-D) er placeret i hele proteinkomplekset og danner en trekant omkring det formodede bindingssted. De tre steder blev separat muteret til Cys-rester i en Cys-mindre mutant for at sikre, at kun den korrekte position blev mærket 2,37. Til SecY292-eksperimenterne blev PhoA-præproteinstederne mærket med AF647, og SecY-rest 292 blev mærket med AF488 ved anvendelse af maleimidkemi. I det kimære protein blev steder SecA37 og SecA321 mærket med AF647, og præproteinet blev mærket med AF488. I det kimære protein SecA-PhoA blev resterne 2, 22, 37 og 45 af PhoA-præproteinsegmentet hver muteret til et ravkodon i individuelle proteiner. De ravfarvede codonmutationer tillod introduktion af unaturlig aminosyre, p-azidophenylalanin, på disse positioner, som efterfølgende blev mærket med AF488 ved hjælp af klikkemi39,40. Hver mutation blev genereret og mærket uafhængigt for at sikre korrekt, differentiel mærkning af proteinkomponenterne. Graden af mærkning blev bestemt for alle proteiner og skulle generelt være 50% eller bedre for at fortsætte med prøven.

Bestemmelse af overførselseffektivitet og afstande
Forud for udførelsen af energioverførselsmålingerne blev donorkvanteudbyttet, overlapningsintegralet og R0-værdierne bestemt (trin 3.4-3.6). Donorkvanteudbyttet blev målt i forhold til farvestoffet fluorescein, som har et kvanteudbytte på 0,79 i 0,1 M NaOH47. Absorptions- og fluorescensemissionsspektre blev opnået ved en række koncentrationer for at generere et lineært absorptionsdiagram i forhold til fluorescensemissionsintensiteten for at bestemme kvanteudbyttet. I disse målinger er det afgørende at måle absorptionen i det lineære område (0,1-1,0), og alle emissionsmålinger skal genereres med de samme spalteindstillinger. Da disse værdier anvendes til at bestemme overlappende integraler og R0-værdier , bør de måles under FRET-betingelser. Protein lokalmiljø påvirker farvestofemission dybt, og derfor bør donorkvanteudbyttet måles for hvert af de undersøgte steder. Vi bemærker, at steder på SecA og SecYEG påvirker R0-værdierne stærkere end dem på PhoA-delen af kimæren. For farvestofpar med samme SecA- eller SecYEG-sted er R0-værdierne typisk inden for 5 Å fra hinanden; der henviser til, at R0-værdierne kan variere med så meget som 20 Å for de to forskellige SecA-placeringer (rest 37 vs. 321), hvilket understreger vigtigheden af at bestemme R0-værdier for hvert farvestofpar (tabel 1).

Beregningen af R0 forudsætter, at donor- og acceptorfarvestofferne roterer frit, og i hvilken grad farvestofferne ikke roterer, bidrager til den samlede usikkerhed i målingen. For passende at tage hensyn til farvestoffernes relative bevægelse og deres orienteringer blev der udført steady state fluorescens-anisotropimålinger på alle donor- og acceptorfarvestoffer i de forskellige mærkningspositioner. Disse værdier, som lå i intervallet 0,10-0,21, blev brugt til at beregne fejlen i forbindelse med afstandsmålingerne 2,3,48. De relativt høje anisotropiværdier, der observeres for både donor- og acceptorfarvestoffer, svarer til en reduktion i farvestofrotation, hvilket er uforeneligt med antagelsen om fri rotation. Manglen på fri rotation genererer en fejl på 19% -25% i afstandsberegningerne. Som det fremgår af tabel 1, medførte dette en gennemsnitlig usikkerhed i de målte afstande på højst ± 15 Å. Ved kortlægning af FRET-distancerne er disse usikkerheder i afstandsmålingerne en vigtig overvejelse, som diskuteret nedenfor.

Den beregnede afstand mellem donor-acceptorpar er baseret på forholdet mellem effektivitet og afstand, hvor en højere effektivitet er tegn på donor-acceptorpar adskilt af en kortere afstand. For at bestemme FRET-effektivitet opnås fluorescensemissionsspektre, der er exciteret ved donor-excitationsbølgelængden (488 nm), på donor-only og donor-acceptorprøver. Typisk betyder en reduktion i donoremissionsintensiteten tilstedeværelsen af energioverførsel (trin 5.1). Figur 1G viser donor-acceptor-spektrene for SecA 37-restproduktet med enten rest 2 eller 22 af PhoA-kimæren. SecA37-restproduktet er mærket med AF647 eller acceptorfarvestoffet, og PhoA-resterne er mærket med AF488 eller donorfarvestoffet. Ved begge positioner reduceres donorfluorescensen, og en lille stigning i acceptorfluorescensintensiteten kan ses i donoracceptorprøverne. Da excitation udføres ved donor excitationsbølgelængden på 488 nm, hvilket ikke direkte ophidser acceptoren, er enhver acceptorfluorescens observeret fra energioverførsel. Faldet i donorintensitet og samtidig stigning i acceptorintensitet skyldes således energioverførsel mellem de to farvestoffer. Signifikant er donorfluorescensintensiteten højere for PhoA2-positionen (blå) i forhold til PhoA22-positionen (gul) i nærværelse af acceptoren. Denne relative forskel i donorintensitetsfaldet indikerer, at energioverførslen mellem PhoA2-resterne og SecA37-resterne er svagere end overførslen mellem PhoA22- og SecA37-resterne, hvilket indebærer, at PhoA2-resterne er placeret længere væk fra SecA37 end PhoA22. Afstande bestemmes ud fra forholdet mellem effektivitets- og R0-værdier (trin 5.1.4).

Da steady state fluorescensmålingerne kunne repræsentere et gennemsnit på to eller flere afstande, udførte vi også tidsopløste fluorescensmålinger. Til disse forsøg måles donorfarvestoffets levetid i nærvær og fravær af acceptoren (figur 1G). Hvis der var to forskellige energioverførselsprocesser, der bidrog til den målte steady state fluorescenseffektivitet, ville de blive observeret som diskrete levetider, forudsat at de kunne opløses inden for instrumentets tidsopløsning. For at forbedre evnen til at løse levetiderne skal der indsamles 10.000 tællinger eller mere på toppen; Tællingerne af tophøjde eller spidskanal skal dog afbalanceres med tidspunktet for erhvervelsen og potentiel skade på prøven. Tidsopløste målinger gav enkelte levetider for hvert donor-acceptorpar i overensstemmelse med kun en orientering eller afstand mellem farvestofferne. Vi bemærker, at små forskelle i afstanden som observeret i de områder, der afsløres af vores FRET-kortlægningsteknik, ikke ville føre til løselige levetider i vores system. Desuden var effektivitetsgevinsterne som bestemt af de tidsopløste fluorescensmålinger i god overensstemmelse med dem, der blev bestemt ud fra steady state-målingerne, hvilket yderligere understøtter, at de målte effektiviteter kun stammer fra en afstand mellem farvestofparrene3.

Kortlægning af FRET-afstandene på den 3-dimensionelle struktur
Resonansenergioverførselsmålingerne giver tilstrækkelig afstandsinformation til at identificere bindingsstedet og orienteringen af signalsekvensen på SecA. De tre placeringer på SecA og SecYEG sammen med de fire positioner på PhoA-regionen i SecA-PhoA-kimæren giver de 12 forskellige afstande, der bruges til at kortlægge bindingsstedet (tabel 1). De tolv afstande blev kortlagt på den tredimensionelle røntgenkokrystalstruktur i Thermotoga maritima SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN) for at identificere bindingsstedet for signalsekvensen33. Strukturen af SecA-SecYEG-komplekset svarer til den, der blev observeret i E. coli , som det fremgår af en in vivo photocrosslinking-undersøgelse55.

Vi bruger begyndelses- (PhoA2) og slutrester (PhoA22) af PhoA-signalsekvensen i SecA-PhoA-kimæren til at illustrere, hvordan restplaceringer blev identificeret på SecA-SecYEG-komplekset. Da energioverførsel kan forekomme i alle retninger, beskriver FRET-afstandene og tilhørende fejl en sfærisk skal, hvor en af farvestofplaceringerne fra donor-acceptorparret er udpeget som centrum. I denne undersøgelse danner resterne SecA37, SecA321 og SecY292 centrene for tre sfæriske skaller, der beskriver placeringen af PhoA2-resterne af signalsekvensen. Visualisering af de overlappende regioner, der stammer fra de tre separate placeringer, SecA37 (magenta), SecA321 (lilla) og SecY292 (cyan) er vist i figur 3. Kun en del af hver FRET-skal skærer med proteinstrukturen, og resterne og rygraden, der falder inden for denne skal, fremhæves. Således er proteinområderne inden for skallen defineret af SecA37-PhoA2-afstanden vist i magenta (figur 3A,E), mens regionerne defineret af SecA321-PhoA2 og SecY292-PhoA2 skaller er vist i henholdsvis lilla (figur 3B,F) og cyan (figur 3C,G). Det formodede bindingssted, der hovedsageligt består af to-helixfingeren, er vist i grønt.

Som vist i figur 3 definerer hver af disse FRET-skaller en relativt stor del af proteinkomplekset. For alle tre steder skærer FRET-skallen med det formodede bindingssted; For eksempel for SecA321-resterne er det krydsede område mindre og ligger mod enderne af fingrene med betydelig overlapning med det spiralformede stilladsdomæne. Skæringspunktet eller det fælles område for alle tre FRET-skaller (figur 3D, H) definerer placeringen af PhoA2-resterne. Dette område er betydeligt mindre end hver FRET-skal og omfatter kun en lille del af THF med et stort bidrag fra det spiralformede stillads. De scripts, der bruges til at generere FRET-skallerne og de krydsede områder til molekylær visualiseringsprogrammet, PyMOL, er angivet i supplerende information. Dele af skallerne visualiseres som lyserøde prikker på SecA-SecYEG-komplekset i supplerende figur 1-3.

En lignende strategi blev brugt til at identificere placeringen af PhoA22-restproduktet. FRET-skallerne defineret af PhoA22 FRET-afstande (figur 4A-C, E-G) beskriver et mindre område i forhold til PhoA2-resterne (figur 4D, Hvs. figur 3D, H). Vi fortolker denne forskel for at antyde, at PhoA2-resterne og den tilknyttede region er mere fleksible og labile end PhoA22. Det er signifikant, at det område, der tilskrives PhoA22-resterne, er placeret tættere på spidsen af THF og mundingen af SecYEG-kanalen, med regioner af SecY identificeret i det fælles område (figur 3D, H). Alle tre farvestofparringer identificerer regioner sammen med det formodede bindingssted; de krydsede fællesarealer centrerer imidlertid PhoA22-placeringen (figur 4D, H) i den modsatte ende af THF i forhold til PhoA2-placeringen (figur 3D, H). Disse resultater tyder på, at signalsekvensen af præproteinet, der strækker sig fra rester 2-22, ligger langs THF i en relativt ustruktureret tilstand. Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der tyder på, at signalsekvensen binder til proteinet langs THF i en udvidet tilstand, og at den C-terminale ende af SecA i B. subtilis krystalstrukturen i det væsentlige modellerer signalpeptidets struktur og indtager samme placering (vist i rødt Figur 1F)2,26 . Vi anvendte en lignende tilgang til at identificere to steder i den tidlige modne region (rest 37 og 45) af SecA-PhoA preprotein kimæren for yderligere at definere bindingen og orienteringen af signalsekvensen og den tidlige modne region som diskuteret nedenfor. I andre undersøgelser er FRET-afstande blevet brugt effektivt til at forfine en eksisterende struktur eller molekylær dynamik simiulationsafledt model 18,19,56; vi var ikke i stand til at gøre dette, da der ikke findes nogen struktur for signalsekvensen bundet til SecA.  

Figure 1
Figur 1: Mærkningssteder i SecA-SecYEG-kompleks med repræsentative FRET-spektre. (A-D) Fire forskellige visninger af SecA-SecYEG-co-krystalstrukturen (PDBID: 3DIN)33, hvor mærkningsstederne for SecA37, SecA321 og SecY292 er vist som henholdsvis magenta-, violet- og cyankugler. A-C er sidevisninger af komplekset, og D er en topvisning. SecA er vist i lysegrå, SecYEG er vist i mørkegrå og det formodede bindingssted, THF, er vist med grønt. (E) Skematisk af SecA-PhoA-kimærkonstruktionen, som forbinder SecA-proteinet med PhoA-præproteinet gennem en Ser-Gly-linker (ikke tegnet til skala). Mærkningsstederne på PhoA-delen af kimæren er angivet i blå, grøn, gul og rød, svarende til resterne 2, 22, 37 og 45. (F) Bånddiagram over krystalstrukturen af B. subtilis SecA-protein (PDBID: 1M6N) farvet efter domæne, hvor nukleotidbindende domæner 1 og 2 er vist i henholdsvis blå og lyseblå, preprotein-tværbindingsdomænet er vist i guld, den centrale helix i grønt, to-helixfingeren i cyan, det spiralformede vingedomæne i mørkegrøn og C-terminallinkeren i rød26 . Den ustrukturerede C-endestation fungerer som en model af det bundne PhoA-signalpeptid baseret på en tidligere FRET-kortlægningsundersøgelse2. (G) Steady state fluorescensspektre fra donoren alene og donoracceptorprøver af SecA37-AF647 og PhoA2-AF488 FRET-parret og SecA37-AF647 og PhoA22-AF488 FRET-parret. Reduktionen i donorintensiteten for donor-acceptorprøven er tegn på energioverførsel. Større energioverførsel sker fra PhoA22 i forhold til PhoA2-stedet baseret på faldet i donorintensitet. (H) Kun tidsopløst fluorescensdonor (magenta) og donoracceptor (let magenta) henfaldsspektre af secA37-AF647 og PhoA22-AF488 FRET-parret. Instrumentresponsfunktionen vises med gråt. Donor-acceptorkomplekset giver et kortere henfald og dermed en hurtigere levetid i overensstemmelse med energioverførsel. Alle molekylære strukturer blev genereret med den angivne PDB-fil og PyMOL50. Figur 1E-H er blevet ændret fra Zhang et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Brugergrænseflade til FluorEssence-programmet. (A) Åbningsvinduet vises med en cirkel omkring det røde M. Dette skal klikkes for at forbinde programmet med fluorometeret. (B) Vinduet til opsætning af eksperimentet illustrerer de forskellige områder (monos, detektorer, tilbehør), hvor scanningsrelevante parametre indtastes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: FRET-afstandsskaller bestemt for SecA-PhoA2-positionen. FRET-afstandsskaller konstrueret ud fra FRET-afstande og de tilhørende usikkerheder (tabel 1) er afbildet på SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN). (A-C) FRET-afstandskaller til PhoA2-placeringen konstrueret med henholdsvis SecA37 (magenta), SecA321 (violet) og SecY292 (cyan) i midterpositionen. Skallerne er farvet i henhold til centerresten. (D) Skæringspunktet mellem de tre FRET-skaller definerer placeringen af PhoA2, vist med blåt. (E-H) Udsigterne roteres ca. 180° fra A-D. Alle molekylære strukturer blev genereret med den angivne PDB-fil og PyMOL50. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: FRET-afstandsskaller bestemt for SecA-PhoA22-positionen. FRET-afstandsskaller konstrueret ud fra FRET-afstande og tilhørende usikkerheder (tabel 1) er afbildet på SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN). (A-C) FRET-afstandskaller til PhoA22-placeringen konstrueret med henholdsvis SecA37 (magenta), SecA321 (violet) og SecY292 (cyan) i midterpositionen. Skallerne er farvet i henhold til centerresten. (D) Skæringspunktet mellem de tre FRET-skaller definerer placeringen af PhoA22, vist med gult. (E-H) Udsigterne roteres ca. 180° fra A-D. Alle molekylære strukturer blev genereret med den angivne PDB-fil og PyMOL50. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: FRET-kortlagte placeringer af PhoA2, PhoA22, PhoA37 og PhoA45 projiceret på B. subtilis SecA -Geobacillus thermodenitrificans SecYE cocrystal structure (PDBID: 5EUL). (A) Farvning af SecA-SecYE som i figur 1. OmpA-peptidsubstratet indsat i slutningen af THF er vist i pink. FRET-kortlagte regioner blev genereret i nærværelse af ATP-γS, med PhoA2 vist i blåt, PhoA22 i grønt, PhoA37 i gult og PhoA45 i rødt. Overlappende regioner er vist i oliven (PhoA22 og PhoA37) og orange (PhoA37 og PhoA45). Peptidsubstratet (rester 749-791, cyan) blev udskåret fra den oprindelige struktur og modelleret i det formodede bindingsområde uden ændringer i strukturen (cirklet i rødt). (B) Forstørret billede af det modellerede peptidsubstrat. Rester 2 (Lys), 22 (Tyr) og 37 (Gly) af OmpA-peptidsubstratet er afbildet i pindform i henholdsvis blå, grøn og gul. Disse rester i de modellerede peptider udviser fremragende overensstemmelse med de forudsagte FRET-kortlagte placeringer. For klarhedens skyld er nanolegemet i den oprindelige struktur udeladt. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.

mærket websted på SecA-PhoA-SecYEG-kompleks Mærket sted på PhoA peptid del af SecA-PhoA Chimera
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 PhoA37-AF488 PhoA45-AF488
Afsnit 37-AF467-PhoA
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
FRET effektivitet 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
afstand 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SekA321-AF647-PhoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
FRET effektivitet 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
afstand 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 PhoA22-AF647 PhoA37-AF647 PhoA45-AF647
SekY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
FRET effektivitet 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
afstand 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
tilpasset fra reference 3.
R0-værdier angivet i angstroms blev beregnet som beskrevet i teksten
FRET-effektiviteten blev beregnet ud fra faldet i donorfluorescensintensitet i nærvær af acceptoren som beskrevet. Fejlen rapporteres som SD fra tre uafhængige målinger.
Donor-acceptor afstande (R) er angivet i angstroms og beregnet som beskrevet i teksten. Den rapporterede fejl skyldes en overvejelse af den eksperimentelle fejl og den, der skyldes farvestoffernes orientering.  Farvestoforientering estimeres ud fra steady state fluorescens anisotropi

Tabel 1: Overførselseffektivitet og afstande bestemt for SecA-PhoA-SecYEG-komplekset. FRET-effektivitet, afstande og R0-værdier er angivet for de 12 afstande, der bruges til kortlægning af præproteinbindingsstedet.

Supplerende figur 1: FRET-afstandskal, vist med lyserøde prikker, bestemt for SecA37-resterne og PhoA 37-resterne på SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN). Sec A er vist i lysegrå, SecYEG er vist i mørkegrå og SecA37-resterne er vist i magenta. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: FRET-afstandskal, vist i lyserøde prikker, bestemt for SecA321-resterne og PhoA 37-resterne på SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN). Sec A er vist i lysegrå, SecYEG er vist i mørkegrå og SecA321 rest er vist i violet. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: FRET-afstandskal, vist med lyserøde prikker, bestemt for SecY292-resten og PhoA 37-resterne på SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN). Sec A er vist i lysegrå, SecYEG er vist i mørkegrå og SecY292-resterne er vist i cyan. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved hjælp af FRET-kortlægningsmetoden identificerede vi signalsekvensbindingsstedet på SecA-proteinet. Det er vigtigt, at tilstedeværelsen af en 3-D krystalstruktur af komplekset i høj grad lettede vores undersøgelse. Styrken ved denne kortlægningsmetode ligger i evnen til at bruge en eksisterende struktur til at identificere steder til mærkning. Denne metode kan ikke bruges til at bestemme en 3D-struktur; bestemmelse af strukturelle elementer56, forfining af en eksisterende struktur49, bestemmelse af en bindingsstedsplacering 2,32 eller belysning af dynamisk bevægelse57 er imidlertid alle mulige anvendelser af denne metode.

I SecYEG-SecA-PhoA-komplekset danner de tre mærkningssteder en trekant omkring det formodede bindingssted (figur 1). Anvendelsen af flere afstandsmålinger fra hjørnerne af denne trekant til den samme rest forfiner placeringsoplysningerne svarende til GPS-navigationsmetoder. Tre steder, SecA37, SecA341 og SecY292, blev identificeret på SecA og SecY sammen med fire steder, PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 i signalsekvensen og det tidlige modne område af præproteinet for at give i alt 12 afstande til kortlægning af signalpeptidets placering (tabel 1). Det er vigtigt at forbedre nøjagtigheden af afstandsmålingerne, at mærkningssteder skal placeres i relativt statiske områder af proteinet, såsom i sekundære strukturelementer snarere end sløjfer. Desuden bør steder også være på steder, der er relativt tilgængelige for opløsningsmiddel for at lette og øge effektiviteten af mærkning. Inden for SecA-PhoA-SecYEG-komplekset var udførelsen af afstandsmålinger fra trekantstederne eller hjørnerne til rester i bindingssubstratet tilstrækkelig til at lokalisere resterne i bindingssubstratet til et relativt lille område (figur 3D, H og figur 4D, H). Identifikation af det krydsede område fra målingerne af flere afstande afgrænser placeringen væsentligt fra placeringen af enkeltafstandsmåling, som vist i figur 3 og figur 4. Når du bruger denne metode, anbefales det således kraftigt at måle flere afstande. Selvom denne metode kan identificere regioner af molekyler, der er involveret i binding, giver den for eksempel ikke præcise strukturelle oplysninger; sådanne oplysninger opnås bedst fra andre strukturelle metoder såsom røntgen, NMR og cryo-EM. FRET-afstande kan bruges til effektivt at forfine en eksisterende struktur18,19 eller model, i dette tilfælde var det ikke muligt, da der ikke findes nogen model af signalsekvensen bundet til SecA.

For at sikre, at farvestofmærkning kun forekommer på ønskede steder, og FRET-afstandsmålinger er nøjagtige, foretrækkes brugen af mutagenese til mærkning. Generering af en Cys-mindre mutant kræver relativt konservativ mutation af Cys-rester til Ser eller lignende rester i det ellers vildtypeprotein ved hjælp af stedstyrede mutagenesemetoder. I den nuværende undersøgelse blev Cys-mutationer introduceret i Cys-fri versioner af SecA og SecYEG til mærkningaf 37. Aktiviteten af det mutante protein blev verificeret med et vækstassay efterfulgt af et in vitro malakitgrønt ATPase-assay41,42. Relevante aktivitetsassays afhænger af proteinets funktion, for eksempel for DNA-bindende proteiner, ville et DNA-bindende assay være passende58. Manglende sikring af mærkning på kun ét sted kan føre til mærkning af mere end et sted med det samme farvestof, hvilket betydeligt komplicerer afstandsbestemmelsen. Indførelsen af en anden etiket på det samme protein kan således ske ved inkorporering af unaturlig aminosyre ved stedstyret mutagenese. Vi anvendte denne metode til at mærke SecA-PhoA-kimæren på steder, der adskiller sig fra Cys-rester ved at introducere den unaturlige aminosyre, p-azidophenylalanin og mærkning med klikkemi39,40.

En yderligere vigtig overvejelse af denne metode er valget af anvendte farvestoffer og den tilhørende R0-værdi . Efter identifikation af de potentielle mærkningssteder kan de afstande, der skal måles, estimeres ud fra 3D-strukturen. Med disse oplysninger kan efterforskere vælge farvestoffer par med R0-værdier , der spænder over det ønskede interval af forventede afstande. For eksempel har farveparret AF488-AF647 en beregnet R0 på 55,7 Å, hvilket giver et godt interval for mærkningssteder, der ligger anslået 40-75 Å væk fra det formodede bindingssted. Selvom R0-værdierne beregnet i trin 2.2 er nyttige til at vælge, hvilket farvestofpar der skal bruges til dit system, kan fastgørelse af farvestofferne til proteinet ændre deres egenskaber betydeligt. For større nøjagtighed skal R0-værdier beregnes ud fra in situ-forsøg udført med mærket protein (trin 3.1 - 3.6.5).

Måling af overførselseffektivitet kan udføres enten ved at overvåge steady-state fluorescensemission og observere enten et fald i donoremission eller en stigning i acceptoremission. Selv om det er ønskeligt at observere begge virkninger, kan effektiviteten beregnes ud fra begge som beskrevet 5,8. Effektiviteten kan også beregnes ud fra faldet i donorlevetiden i donor-acceptorprøven i forhold til donorprøven. Det anbefales at bestemme effektiviteten ved hjælp af mere end én metode, navnlig anvendelse af tidsopløste metoder til bestemmelse af den relative homogenitet af de målte effektivitetsgevinster.

Kortlægningsmetoden tillod os også at bestemme den relative orientering af signalsekvensen og de tidlige modne regioner af PhoA-præproteinet i forhold til SecA og det formodede bindingssted. En SecA-SecYEG røntgenkrystalstruktur og efterfølgende cryo-EM-undersøgelse gav klarhed med hensyn til signalsekvensens struktur og det tidlige modne område af præproteinet med hensyn til kanalen og SecA34,35. I røntgenstrukturen blev rester 1-41 af OmpA-præproteinet fastgjort til spidsen af to-helixfingeren og visualiseret i en hårnålstruktur i kanalen (vist i lyserød, figur 5). Placeringen af de fire PhoA-rester i SecA-PhoA-kimæren blev kortlagt på denne struktur ved hjælp af den samme protokol som beskrevet ovenfor. Som vist i figur 5 er placeringen af PhoA37- og PhoA45-resterne (gul, orange, rød) mellem PhoA2 og PhoA22, med PhoA45 tættere på PhoA2. Disse resultater, især placeringen af PhoA45, antydede, at PhoA-præproteinet dannede en hårnålstruktur.

For yderligere at validere vores FRET-identificerede bindingssted udførte vi en sammenligning af vores kortlagte placeringer med OmpA-præproteinet ved at excisere 41-restpræproteinstrukturen fra kanalen og modellere den til de regioner, der er defineret ved FRET-kortlægning (figur 5, cyan). Uden nogen ændring af præprotein røntgenstrukturen finder vi, at placeringen af rester 2, 22 og 37 (vist i blå, grøn og gul) på OmpA preprotein fragment udskåret struktur stemmer bemærkelsesværdigt godt overens med de FRET-kortlagte placeringer (figur 5B) og antyder, at hårnålen dannes før kanalindgang. OmpA-præproteinet ender ved rest 41 i røntgenkrystalstrukturen; C-terminalen i SecY, som er ustruktureret, giver imidlertid en indikation af den mulige placering af PhoA45. I vores modellerede struktur sidder hårnålestroppen ved kanalens munding og er klar til at lette translokationen af præproteinet over membranen. I dette eksempel forbedrer FRET-kortlægningsmetoden således eksisterende information om den statiske SecA-SecYEG-struktur ved at give et antydning af den dynamiske bevægelse, der er nødvendig for proteintranslokation over membranen. Selvom det ikke er egnet til de novo-strukturbestemmelser , hvis 3-dimensionel strukturel information er tilgængelig, kan FRET-kortlægningsmetoden fremme den nuværende forståelse af struktur-funktionsforhold gennem belysning af bindingssteder og dynamiske bevægelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health grant R15GM135904 (tildelt IM) og National Institutes of Health Grant GM110552 (tildelt DBO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Biokemi udgave 181 fluorescens energioverførsel SecA proteintranslokation FRET-kortlægning
Förster Resonans Energy Transfer Mapping: En ny metode til at belyse globale strukturelle træk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter