Este protocolo presenta una nueva técnica quirúrgica de trasplante renal de ratón centrada en una estrategia de anastomosis arterial modificada. También se presenta una técnica de sutura vascular que incluye un método de anastomosis uréter-vejiga simple y seguro. Estas modificaciones acortan el tiempo de operación y mejoran la tasa de éxito del procedimiento de trasplante de riñón en ratones.
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Artículo de método
Una técnica quirúrgica modificada para el trasplante de riñón en ratones
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Resumen
Resumen
El trasplante de riñón en ratones es un procedimiento quirúrgico complicado y desafiante. Hay muy pocas publicaciones que demuestren los pasos clave de esta operación. Por lo tanto, este artículo presenta la técnica y señala las advertencias quirúrgicas asociadas con esta operación. Además, se demuestran modificaciones importantes en comparación con el procedimiento convencional. En primer lugar, se corta y prepara un parche de la aorta abdominal para que las bifurcaciones proximales de la arteria renal, incluida la arteria ureteral, se transecten junto con el riñón del donante en bloque. Esto reduce el riesgo de una necrosis del uréter y evita el desarrollo de una oclusión del tracto urinario. En segundo lugar, se demuestra un nuevo método de anastomosis vascular que permite al operador aumentar o disminuir de manera flexible el tamaño de la anastomosis después de que ya se haya iniciado la reperfusión del trasplante renal. Esto evita el desarrollo de estenosis de los vasos y sangrado intraabdominal. En tercer lugar, se muestra una técnica que permite la anastomosis del delicado uréter donante y de la vejiga receptora que no causa un traumatismo. La adopción de este protocolo puede acortar el tiempo de operación y reducir el daño a la vejiga del receptor, lo que aumenta significativamente la tasa de éxito de la operación para los ratones receptores.
Introducción
Desde que Sakowitz et al. desarrollaron modelos de trasplante renal en 1973 por primera vez1, ha demostrado ser una importante herramienta experimental para estudiar los mecanismos de la lesión isquémica del trasplante y el rechazo aloinmune, así como para desarrollar nuevos tratamientos destinados a prolongar la supervivencia del aloinjerto y posiblemente lograr la tolerancia inmunológica. Sin embargo, la técnica quirúrgica ha demostrado ser compleja y muy exigente, a veces con complicaciones como estenosis anastomóticas vasculares que conducen a insuficiencia prerrenal no inmunológica del trasplante renal2, insuficiencia posrenal causada por isquemia y posterior necrosis del uréter trasplantado, estenosis de la anastomosis del uréter trasplantado y/o vejiga urinaria del receptor que conduce a una interrupción del flujo urinario. Todas estas son razones por las que el trasplante renal en ratones no se ha desarrollado más y, por lo tanto, no se usa ampliamente. Establecer un modelo de trasplante renal de ratón estable y efectivo a largo plazo sin complicaciones vasculares y del tracto urinario todavía tiene un significado insustituible para muchos estudios en el campo del trasplante con enfoque en las enfermedades inmunomediadas por el riñón pero también infecciosas3. Además, en comparación con otros trasplantes de órganos en modelos murinos como el trasplante de pulmón, corazón e intestino 4,5, el modelo de trasplante de riñón de ratón ofrece una oportunidad para estudiar la supervivencia a largo plazo incluso en el contexto de una gran disparidad de antígenos de histocompatibilidad 3,6. También se ha demostrado que en el mismo contexto de combinaciones de cepa donante-receptor diferentes trasplantes de órganos como corazón o riñón se caracterizan por diferentes dinámicas e inicios de rechazo del aloinjerto3. Además, desde el punto de vista nefrológico, es un modelo más adecuado para estudiar los mecanismos de regulación inmune mediados por parénquimas en el contexto de eventos de rechazo agudo y crónico que los simples experimentos de trasplante de piel.
Sobre la base de informes previos sobre la técnica quirúrgica de trasplante renal en ratones 3,7,8,9, aquí demostramos las siguientes mejoras fiables que se han aplicado con éxito durante los últimos 10 años dentro de nuestro grupo 10,11,12: En primer lugar, la arteria ureteral se conserva de forma segura a medida que la arteria renal se reseca en bloque. junto con la parte respectiva de la aorta abdominal. En segundo lugar, una técnica nueva, simple y rápida de una anastomosis vascular sin nudos en la que la puntada final de la anastomosis no se ata con el extremo de la corbata superior como el enfoque tradicional, sino que permanece libre. Esta técnica permite aumentar o disminuir el tamaño de la anastomosis después de la reperfusión renal para evitar la estenosis de los vasos y el sangrado intraabdominal. En tercer lugar, se utilizaron agujas de jeringa de 21 G y 30 G como herramienta auxiliar de guía de punción para implantar el uréter donante en la pared de la vejiga del receptor reduciendo el daño a la vejiga del receptor y facilitando la formación de anastomosis libre de estenosis.
En este informe también comparamos la técnica tradicional y ampliamente utilizada con la modificada que se establece en nuestro laboratorio y no encontramos diferencias significativas en el grado de atrofia tubular renal y fibrosis del tejido intersticial trasplantado renal. En estudios previos, además, comparamos los resultados de esta nueva técnica con el método convencional en cuanto a hemorragia local, trombosis, tiempo de realización de la anastomosis del vaso y tasa de supervivencia. Se encontraron mejoras como reducciones significativas de los eventos de trombosis local (1,1% versus 6,6%), una reducción del tiempo para el procedimiento de anastomosis y una supervivencia a largo plazo del injerto singénico renal altamente reproducible (95% versus 84% con el enfoque clásico)10.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos (Tarjeta de ética animal: Ministerio de Seguridad Alimentaria y Farmacéutica de Baja Sajonia, # 33.9-42502-04-11/0492). Realice procedimientos utilizando instrumentos quirúrgicos estériles y consumibles (autoclave) y trate de mantener el área de operación lo más estéril posible.
NOTA: Los ratones machos C57BL/6J sirvieron como donantes y receptores (modelo de trasplante singénico) mientras que los ratones Balb/c sirvieron como receptores de aloinjerto renal (modelo para estudiar el modelo de rechazo agudo de aloinjerto9). Los ratones tenían entre 8 y 12 semanas de edad, pesaban ~ 25-30 g en el trasplante y fueron alojados en condiciones estándar. Los datos reportados en este manuscrito fueron generados por cuatro cirujanos con experiencia en cirugía con ratones.
1. Pasos preparatorios
- Para la cirugía, use un conjunto de instrumentos microscópicos, que incluyen una microjera, microfórceps, un soporte de aguja, abrazaderas micro hemostáticas y una pluma electroquirúrgica. Realice suturas con monofilamento de nylon 7/0er, 10/0er o 4/0er.
- Para la anestesia, coloque el ratón en la caja para la inhalación de isoflurano (2%) durante unos 40-60 s con el fin de inducir la inconsciencia.
- Una vez que el ratón esté anestesiado, pese el ratón.
- De acuerdo con el peso del ratón, aplique una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) + xilazina (10 mg / kg) + acepromazina (2 mg / kg) para anestesiar al ratón13. Confirme que el ratón está anestesiado observando una falta de respuesta a un pellizco en el dedo del pie.
- Cuando la anestesia haya hecho efecto, recorte el pelaje abdominal. Luego, fije el mouse en la mesa de operaciones inmovilizando libremente las extremidades con una cinta adhesiva estéril.
- Desinfecte el abdomen del ratón después de colocarlo en la mesa de operaciones. Realice la desinfección utilizando un exfoliante alterno de yoduro de povidona (yodóforo) y alcohol, tres veces (use un patrón concéntrico, comience a frotar en el medio del abdomen y muévase hacia afuera), y luego cubra adecuadamente al ratón con una toalla quirúrgica fenestrada.
- Aplique ungüento para los ojos y mantenga la esterilidad durante todo el procedimiento.
NOTA: No se recomiendan antibióticos durante todo el procedimiento, ya que estas sustancias pueden influir en las respuestas inmunológicas.
2. Procedimiento de operación del donante
- Use tijeras para cortar la piel y realice una incisión abdominal cruzada de aproximadamente 3-4 cm. Cortar los músculos de la pared abdominal. Cubra y retire con precaución las vísceras con una gasa salina bebida.
- Use un hisopo de algodón para extraer suavemente los intestinos, el estómago y el bazo hacia el lado derecho (desde el punto de vista del ratón), cubra y aleje con precaución las vísceras con una gasa salina.
- Use micro fórceps para exponer el riñón izquierdo, la aorta y la vena cava inferior (IVC).
- Use un lápiz electroquirúrgico para cauterizar las venas lumbares izquierdas, incluidas sus ramas subyacentes y otros vasos pequeños junto con el vaso suprarrenal izquierdo, con cuidado.
- Use micro tijeras y fórceps para diseccionar el uréter izquierdo y movilizarlo cautelosamente del tejido circundante. Límpielo cerca de la vejiga urinaria. Movilizar la región aórtica entre las arterias renales izquierda y derecha de aproximadamente 2 mm de longitud.
- Use micro fórceps para separar la vena cava inferior infrarrenal (IVC) y la aorta, y luego use pinzas curvas para pasar por debajo de la aorta para colocar una corbata suelta de sutura de seda 7-0 alrededor de este recipiente.
- Pinza cruzada el área de la aorta por debajo de la arteria renal derecha y la vena cava inferior (IVC) utilizando dos pinzas microvasculares de 5 mm.
- Transecte la vena renal izquierda de la vena cava.
- Use una jeringa para enjuagar la aorta con 1 ml de solución salina de heparina (60 U/ml).
- Use micro pinzas para apretar la ligadura aplicada en el paso 2.5. Luego, corte la aorta debajo de la ligadura, así como debajo de la pinza proximal. Con esto, las bifurcaciones proximales de la arteria renal (tenga en cuenta que la abertura arterial debe cortarse cuidadosamente, de lo contrario afectará la anastomosis) y la arteria ureteral se incluyen y transectan en bloque. Prepárese cuidadosamente, de modo que la delicada arteria ureteral se conserve por completo.
- Use el lápiz electroquirúrgico y las fórceps para liberar completamente el riñón izquierdo y los vasos asociados cauterizando cautelosamente todo el tejido circundante del vaso. Retire el riñón y guárdelo en solución salina a 4 °C.
- Sacrificar al ratón donante anestesiado por decapitación.
3. Procedimiento de operación del destinatario
- Realice los pasos quirúrgicos iniciales (incluida la anestesia y la esterilización, consulte los pasos 1.1 a 1.7) como se describe para el ratón donante.
- Use tijeras para abrir el abdomen a través de una incisión mediana (aproximadamente 2,5 cm de longitud) y luego cubra los órganos abdominales con una gasa húmeda con solución salina.
- Conserve cuidadosamente la aorta infrarrenal y la vena cava inferior (IVC) y asegúrese de que cada rama de vaso grande esté cauterizada. Use también el cauterizado eléctrico para diseccionar el uréter izquierdo cuidadosamente en una posición proximal a la pelvis renal. Luego, retire el riñón izquierdo.
- Use micro pinzas y bastoncillos de algodón para exponer la aorta abdominal y la vena cava inferior y separarlas del tejido adiposo circundante (aproximadamente más de 4 mm de longitud).
- Use dos pinzas microvasculares y colóquelas proximal y distalmente tanto en la vena cava inferior como en la aorta abdominal simultáneamente.
- Use un soporte de microagujas para guiar una aguja de sutura de monofilamento 10/0 (hecha de fibra sintética con una superficie lisa), que se coloca a través de la pared de la aorta de manera proximal a distal.
- Lograr una arteriotomía elíptica de aproximadamente 1 mm con una suave tracción hacia arriba de la sutura, mientras se corta directamente debajo de la cara inferior de la aguja con tijeras finas y curvas.
- Utilice micro tijeras para cortar la vena cava inferior (IVC) longitudinalmente con una longitud suficiente de aproximadamente 1,5 mm. Coloque esta incisión ligeramente por debajo de su contraparte aórtica.
- Realizar la anastomosis de la aorta del donante y del receptor de forma integral. Coloque el riñón del donante en el lado derecho de la vena cava inferior del receptor alineando el manguito de la aorta abdominal del donante con la anastomosis de la aorta abdominal del receptor.
- Use un soporte de microaguja y dos suturas separadas de 10-0 para coser los extremos proximal y distal de la anastomosis.
- Después de atar, deje las dos suturas largas, incluida la aguja, en su lugar. Cose el lado izquierdo de la pared aortal de la anastomosis continuamente con dos puntos espaciados uniformemente en dirección distal-proximal.
- Después de la última puntada, guíe la sutura a través de un grosor parcial de la pared del recipiente por encima de la atadura de sutura de la estancia superior.
- Use micro pinzas para ejercer simultáneamente una tracción suave hacia el extremo corto de la corbata de sutura inferior.
NOTA: En esta nueva técnica sin nudos, la última puntada no está atada al extremo corto de la corbata superior. - Use micro fórceps para voltear el riñón trasplantado a su posición normal. Ahora cose continuamente la pared derecha de la anastomosis aortal utilizando tres puntos de sutura de manera proximal a distal.
NOTA: En comparación con la técnica quirúrgica convencional 7,8 la última sutura se fusiona con el lazo distal cercano. No lo ate al extremo de la sutura inferior, córtelo para dejar una longitud libre de 2-3 mm en su lugar. - Realice la anastomosis venosa utilizando el mismo procedimiento de sutura descrito anteriormente con la diferencia de que se necesitan de cuatro a cinco puntos de sutura para cada lado de la anastomosis. La puntada final se deja como un extremo libre de longitud similar a la anastomosis aortal descrita anteriormente.
- Después de completar ambas anastomosis, use un hisopo seco para ejercer una presión suave hacia el área suturada durante aproximadamente 10-20 s.
- Use un aplicador de clip pinzas para quitar ambas abrazaderas, primero la inferior y luego la superior. Enjuague la cavidad abdominal con cloruro de sodio al 0,9% a una temperatura de 38,0 °C.
- Observe la reperfusión del riñón trasplantado.
4. Implantación ureteral
- Use un soporte de microaguja para penetrar a través de la vejiga urinaria del receptor con una sutura de 10/0 (aguja recta) e insértela en un lumen de aguja de 21 G para obtener orientación (consulte la Figura suplementaria 1a).
- Ahora guíe la aguja de 21 G para coser un orificio en el lugar de la aplicación de la aguja anterior (Figura suplementaria 1b).
- Extraiga la aguja de 21 G (Figura suplementaria 1c).
- Use un soporte de microagujas y una sutura de 10/0 para coser (sin atar) el extremo del uréter recortado y perforar la vejiga con esta sutura de 10/0 nuevamente en el lugar de su entrada (Figura suplementaria 1d).
- Use un soporte de microaguja para remolcar el filamento 10/0 y el uréter en la vejiga de orina a través del orificio construido (Figura suplementaria 1e).
- Use un soporte de microaguja y otra sutura 10/0 para anastomosear el uréter del donante a la vejiga urinaria del receptor. Aquí, conecte la membrana externa del uréter a la membrana externa de la pared de la vejiga y realice suturas intermitentes con 3 a 4 puntos de sutura. Finalmente, extraiga la sutura de tracción (Figura suplementaria 1f).
- Use fórceps para colocar los intestinos de nuevo en la cavidad abdominal. Realice suturas de dos capas (primero los músculos abdominales seguidos de la piel) para cerrar la herida abdominal utilizando un filamento 4/0.
- Coloque a los ratones trasplantados en una cámara de oxígeno y temperatura controlada para recuperarse después de la cirugía.
- Para la analgesia postoperatoria, administre directamente Metamizol 200 mg/kg por os después de la operación.
Cuatro y 16 h después de la operación administrar Metamizol 200 mg/kg por os más Carprofeno (5mg/kg) s.c. En el seguimiento posterior, aplique Carprofeno (5 mg / kg) s.c. a los ratones trasplantados cada 24 horas durante tres días consecutivos después de la operación13. Si hay signos de una analgesia insuficiente, buprenorfina se administra adicionalmente 0,05 mg/kg cada 8 h s.c.
5. Nefrectomía contralateral y sacrificio del ratón receptor
NOTA: Realice una nefrectomía contralateral del ratón receptor 5 días después del trasplante.
- Realizar la nefrectomía contralateral del ratón trasplantado 5 días después del trasplante bajo anestesia. Ligar y cortar las arterias y venas renales derechas autólogas del receptor, extirpar el riñón derecho y cerrar la cavidad abdominal. Los cuidados postoperatorios y la analgesia son los mismos que se describieron anteriormente (ver paso 4.7).
- Eleva y registra el estado del ratón. Proporcionar al ratón trasplantado analgesia postoperatoria, alimentos y suministro de agua.
- Cuatro semanas después del trasplante, sacrifique la mitad de los ratones trasplantados y realice tinción de H&E para sus trasplantes de riñón.
- 12 semanas después del trasplante, sacrifique los ratones restantes y realice la tinción Masson Gold de estos trasplantes de riñón.
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Resultados
Cuatro semanas después del trasplante, tanto la técnica modificada como la técnica convencional mostraron signos moderados de atrofia tubular renal14,15 en comparación con los riñones contralaterales del receptor nativo (Figura 1). El grado de atrofia de los túbulos renales no demostró diferencias significativas entre las dos técnicas diferentes. La tinción tricrómica de Masson Goldneren 14,15
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Discusión
Si bien el modelo de trasplante de piel en ratones es simple y fácil de realizar para estudiar los eventos de rechazo aloinmune, las técnicas quirúrgicas para investigar más específicamente las alteraciones inflamatorias relacionadas con aloinmuno después del corazón16 y el trasplante de riñón10 han demostrado ser complejas y muy exigentes. Desde el punto de vista del nefrólogo de trasplantes, el establecimiento de un modelo de trasplante renal de ratón estable y efectivo a...
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Agradecimientos
Agradecemos al equipo del Dr. Tiantian Bai por su ayuda con la voz en off, a la señorita Mian Pao por su ayuda en la ilustración médica. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) para promover colaboraciones internacionales (HO2581/4-1 a AH) y la Fundación Nacional de Ciencias de China (NSFC; # 81760291 a FJ).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agujas 30G | Braun | 456300-acepromazina | |
| CP Pharma | Tranquisol | ||
| P-Bepanthen ungüento oftálmico | Haus-Apotheke | PZN | 01578675-Bonn |
| Micro Pinzas | FST | 11083-07-Caja | |
| para aislante y dispositivo de suministro de oxígeno | RUSKINN | INVIV-C57BL | |
| /6J ratones | Río Charles. Alemania | sin número | de catálogo-Carprofeno |
| Zoetis | Rimadyl 50 mg/ | ||
| 26G | TERUMO | Surflo-W-Clip | |
| Pinza aplicadora Estilo | FST | 18057-14-Pinza | |
| curva | WPI | 14114-G-Cutasept | |
| desinfección de la piel | VWR | BODL980365 | - |
| Deshidratador | DIAPATH | Bolígrafo | |
| electroquirúrgico | Donatello Bovie | CHANGE-A-TIP-Máquina | |
| de incrustación | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5-Ethanol | |
| Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | Plataforma | 100092683-Frozen | |
| Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5-almohadillas | de | |
| gasa, bastoncillos de algodón | Lohmann-Rauscher | 13353-Portaobjetos | de |
| vidrio | Servicebio | G6004-HE | |
| juego de soluciones de tinte | Servicebio | G1003-Esterilla | |
| calefactora | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30-esponja | |
| hemostática | CuraSpon | J1276A-solución-heparina | |
| Haus-Apotheke | PZN 03029820 | - | |
| caja de hielo | PETZ | No hay número de catálogo | disponible-Sistema de |
| imagen | Nikon | Nikon DS-U3-Dispositivo de | |
| anestesia inhalatoria | GROPPLER | BKGM 0616-isoflurano | |
| CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ | ml-ketamina | |
| Zoetis | sin catálogo | numer-Masson | |
| juego | de soluciones de coloranteServicebio | G1006-metamizole | |
| WDT | sin catálogo | numer-Micro | |
| tijeras | FST | 15000-00,15000-10-Micro | |
| Serrefine ( Abrazadera ) Angulado / 16 mm | FST | 18055-06-Microscopio | |
| Leica | |||
| LEICAMZ6-Microscopio | ligero SCHOTT | KL2500LED-Goma | |
| neutra | SCRC | 10004160-Horno | |
| Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230-Cortadora | de | |
| patología | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016-Solución | |
| salina (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| tijeras | Peha Instruments | 991083/4-Slides | |
| Servicebio | - | ||
| placa de Petri pequeña | Sarstedt | 8,33,900-pinzas | |
| rectas | WPI | 14113-G-cinta | |
| quirúrgica | BSN | 4120-Pinzas | |
| de atado de suturas - 10 cm | FST | 18025-10-Suturas | |
| (10-0) | Medtronic | N2540-Suturas | |
| (4-0) | ETHILON | V4940H | - |
| Suturas(7-0) | ETHILON | 1647H-Jeringa | |
| (0,3 mL) | BD | ||
| 324826-Jeringa (1 mL) | BD | ||
| 320801-Esparcidor de tejidos | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P-Microscopio | |
| óptico vertical | Nikon | Nikon Eclipse E100-xilacina | |
| Bayer | Rompun | - | |
| Xileno | Sinopharm Group Reactivo Químico Co. LtD | 10023418 | - |
Referencias
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