Summary
Transmitochondriale Cybride sind Hybridzellen, die durch Verschmelzung von mitochondrialen DNA (mtDNA)-deplementierten Zellen (rho0-Zellen ) mit Zytoplasten (enukleierten Zellen) von Patienten mit mitochondrialen Störungen erhalten werden. Sie ermöglichen die Bestimmung des nuklearen oder mitochondrialen Ursprungs der Krankheit, die Bewertung der biochemischen Aktivität und die Bestätigung der pathogenetischen Rolle von mtDNA-bezogenen Varianten.
Abstract
Der Mangel an den mitochondrialen Atmungskettenkomplexen, die eine oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) durchführen, ist der biochemische Marker für mitochondriale Erkrankungen beim Menschen. Aus genetischer Sicht stellt der OXPHOS ein einzigartiges Beispiel dar, da er aus der Komplementarität zweier unterschiedlicher genetischer Systeme resultiert: Kern-DNA (nDNA) und mitochondrialer DNA (mtDNA). Daher können OXPHOS-Defekte auf Mutationen zurückzuführen sein, die nukleäre und mitochondriale kodierte Gene betreffen.
Die bahnbrechende Arbeit von King und Attardi, die 1989 veröffentlicht wurde, zeigte, dass menschliche Zelllinien, die von mtDNA (genannt Rho0) erschöpft waren, von exogenen Mitochondrien wieder besiedelt werden konnten, um die sogenannten "transmitochondrialen Cybrids" zu erhalten. Dank dieser Cybriden, die Mitochondrien enthalten, die von Patienten mit mitochondrialen Störungen (MDs) und Kernen ausRho-0-Zellen stammen, kann überprüft werden, ob ein Defekt mtDNA- oder nDNA-bezogen ist. Diese Cybriden sind auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Pathogenität einer Mutation zu validieren und ihre Auswirkungen auf biochemischer Ebene zu untersuchen. Dieses Dokument enthält ein detailliertes Protokoll, das die Generierung, Auswahl und Charakterisierung von Cybrid beschreibt.
Introduction
Mitochondriale Störungen (MDs) sind eine Gruppe von Multisystemsyndromen, die durch eine Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktionen aufgrund von Mutationen entweder in der Kern- (nDNA) oder der mitochondrialen (mtDNA) DNA1 verursacht werden. Sie gehören mit einer Prävalenz von 1:5.000 zu den häufigsten vererbten Stoffwechselerkrankungen. mtDNA-assoziierte Erkrankungen folgen den Regeln der mitochondrialen Genetik: mütterliche Vererbung, Heteroplasmie und Schwelleneffekt sowie mitotische Segregation2. Human mtDNA ist ein doppelsträngiger DNA-Kreis von 16,6 kb, der eine kurze Kontrollregion mit Sequenzen enthält, die für die Replikation und Transkription benötigt werden, 13 proteinkodierende Gene (alle Untereinheiten der Atmungskette), 22 tRNA und 2 rRNA-Gene3.
Bei gesunden Personen gibt es einen einzigen mtDNA-Genotyp (Homoplasmatik), während mehr als ein Genotyp unter pathologischen Zuständen koexistiert (Heteroplasmie). Schädliche heteroplasmatische Mutationen müssen eine kritische Schwelle überwinden, um OXPHOS zu stören und Krankheiten zu verursachen, die jedes Organ in jedem Alterbetreffen können 4. Die duale Genetik von OXPHOS diktiert die Vererbung: autosomal-rezessiv oder dominant und X-chromosomal für nDNA-Mutationen, mütterlich für mtDNA-Mutationen sowie sporadische Fälle sowohl für nDNA als auch für mtDNA.
Zu Beginn der Ära der mitochondrialen Medizin schuf ein bahnbrechendes Experiment von King und Attardi5 die Grundlage, um den Ursprung einer Mutation zu verstehen, die für einen MD verantwortlich ist, indem Hybridzellen geschaffen wurden, die Kerne aus Tumorzelllinien enthielten, in denen mtDNA vollständig erschöpft war (rho 0-Zellen) und Mitochondrien von Patienten mit MDs. Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) waren zu diesem Zeitpunkt noch nicht verfügbar. Und es war nicht einfach festzustellen, ob eine Mutation im nuklearen oder mitochondrialen Genom vorhanden war. Die 1989 beschriebene Methode wurde dann von mehreren Forschern verwendet, die auf dem Gebiet der mitochondrialen Medizin arbeiteten 6,7,8,9; Ein detailliertes Protokoll wurde kürzlichveröffentlicht 10, aber es wurde noch kein Video gemacht. Warum sollte ein solches Protokoll heutzutage relevant sein, wenn NGS genau und schnell identifizieren könnte, wo sich eine Mutation befindet? Die Antwort ist, dass die Cybrid-Erzeugung immer noch das State-of-the-Art-Protokoll ist, um die pathogene Rolle jeder neuartigen mtDNA-Mutation zu verstehen, den Prozentsatz der Heteroplasmie mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren und eine biochemische Untersuchung in einem homogenen Kernsystem durchzuführen, in dem der Beitrag des autochthonen nuklearen Hintergrunds des Patienten fehlt11, 12,13
Dieses Protokoll beschreibt, wie man Zytoplasten aus konfluierenden, von Patienten abgeleiteten Fibroblasten erhält, die in 35-mm-Petrischalen gezüchtet werden. Die Zentrifugation der Schalen in Gegenwart von Cytochalasin B ermöglicht die Isolierung von enukleierten Zytoplasten, die dann in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG) mit Rho-0-Zellen verschmolzen werden. Die resultierenden Cybriden werden dann in selektivem Medium kultiviert, bis Klone entstehen. Der Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" zeigt ein Beispiel für die molekulare Charakterisierung der resultierenden Cybrids, um zu beweisen, dass die mtDNA mit der der Fibroblasten der Spenderpatienten identisch ist und dass die nDNA mit der Kern-DNA der tumoralenRho-0-Zelllinie identisch ist.
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Protocol
HINWEIS: Die Verwendung menschlicher Fibroblasten kann eine ethische Genehmigung erfordern. Die in dieser Studie verwendeten Fibroblasten wurden von MD-Patienten abgeleitet und in der institutionellen Biobank in Übereinstimmung mit ethischen Anforderungen gespeichert. Für die Nutzung der Zellen wurde eine Einwilligung nach Aufklärung erteilt. Führen Sie alle Zellkulturverfahren unter einem sterilen Laminar-Flow-Schrank bei Raumtemperatur (RT, 22-25 °C) durch. Verwenden Sie steril gefilterte Lösungen, die für Zellkultur- und Sterilanlagen geeignet sind. Züchten Sie alle Zelllinien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2. Mykoplasmentests sollten wöchentlich durchgeführt werden, um mykoplasmenfreie Kulturen zu gewährleisten. 143BTK- rho0 Zellen können wie zuvor beschriebenerzeugt werden 5.
1. Kultur von Zellen
- Bevor Sie mit einem Verfahren beginnen, überprüfen Sie das Vorhandensein der Mutation in Fibroblasten, die von MD-Patienten abgeleitet wurden, und quantifizieren Sie den Prozentsatz der Heteroplasmie oder Homoplasmie durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) und / oder ganze mtDNA-Sequenzierungsanalysen14.
- Samenfibroblasten in vier 35-mm-Petrischalen mit jeweils 2 ml Complete Culture Medium (Tabelle 1). Lassen Sie die Zellen wachsen, bis 80% konfluent (48 h).
- Züchten Sie143BTK- rho 0 Zellen in 8 ml Supplementiertem Kulturmedium (Tabelle 1) in einer 100 mm Petrischale.
- Die Zellen werden in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 gehalten.
- Überprüfen Sie das Fehlen von mtDNA in rho0-Zellen durch Sequenzierungstechniken14.
2. Enukleation von Fibroblasten
- Sterilisieren Sie vier zentrifugentaugliche 250-ml-Flaschen durch Autoklav-Sterilisation bei 121 °C für einen 20-minütigen Zyklus. Trocknen Sie sie im Laborofen oder bei RT.
- Die Zentrifuge bei 37 °C vorwärmen.
- Waschen Sie das 35-mm-Geschirr, das die Fibroblasten enthält, zweimal mit 2 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne (ohne Kalzium und Magnesium).
- Reinigen Sie die Außenfläche des Geschirrs mit 70% Ethanol und warten Sie, bis der Alkohol verdunstet.
- Entfernen Sie die Deckel vom Geschirr und die Schraubverschlüsse von den Flaschen. Stellen Sie jedes Gericht ohne Deckel kopfüber auf den Boden jeder 250 ml Zentrifugenflasche.
- Geben Sie langsam 32 ml Enukleationsmedium in jede Flasche (Tabelle 1), so dass das Medium in die Schale eindringen und mit den Zellen in Kontakt kommen kann. Entfernen Sie alle Blasen aus dem Geschirr mit einer langen Pasteur-Pipette aus Glas und krümmen Sie die Spitze in einer Bunsenflamme.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Blasen zu entfernen, damit das Medium in die Schale eindringen und mit den Zellen in Kontakt kommen kann. - Verschließen Sie jede Flasche mit dem Schraubverschluss und geben Sie sie in die Zentrifuge.
- Zentrifuge für 20 min bei 37 °C und 8.000 × g, Max. Beschleunigung, Verzögerung langsam. Achten Sie darauf, die Zentrifuge auszugleichen: Gegengewicht jeder Flasche. Falls erforderlich, passen Sie das Gewicht an, indem Sie ein geeignetes Volumen Enukleationsmedium hinzufügen.
- Verwenden Sie während der Zentrifugation Vakuum oder eine serologische 10-ml-Pipette, um das Medium aus den 143BTK-rho 0-Kulturplatten abzusaugen und zu entsorgen und sie zweimal mit 4 ml 1x PBS ohne Kalzium und Magnesium zu waschen.
- Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu, um die Zell-Monoschicht vollständig abzudecken.
- Das Geschirr für ~2 min in einen 37 °C Inkubator geben.
- Entfernen Sie die Schalen aus dem Inkubator, beobachten Sie die Zellablösung mit einem inversen Mikroskop für lebende Zellen (Ziele 4x oder 10x) und hemmen Sie die Enzymaktivität durch Zugabe von 2 ml Supplementiertem Kulturmedium.
- Die 4 ml der Zellsuspension in der Schale mit einer 10 ml Pipette absaugen und in ein 15 mL konisches Rohr geben.
- Zählen Sie die Zellen mit einer Burker Hämozytometerkammer oder einem automatisierten Zähler.
- Am Ende der Zentrifugation (Schritt 2.8) wird das Medium aus den Flaschen abgesaugt und entsorgt.
- Entfernen Sie das Geschirr, indem Sie die Flaschen auf einer sterilen Gaze umdrehen, die zuvor mit 70% Ethanol besprüht wurde. Reinigen Sie die äußere Oberfläche des Geschirrs und seiner Deckel mit 70% Ethanol. Warten Sie, bis der Alkohol verdunstet ist, und schließen Sie dann das Geschirr.
- Bevor Sie fortfahren, überprüfen Sie die Cytoplast (Geister-) Bildung mit einem inversen Mikroskop für lebende Zellen (Ziel 4x oder 10x). Suchen Sie nach extrem länglichen Fibroblasten aufgrund der Extrusion ihrer Kerne, die durch Cytochalasin B induziert werden.
- Zu jeder 35-mm-Schale fügen Sie 1 × 10 6 von 143BTK- rho 0-Zellen hinzu, die in 2 ml 143BTK- rho 0-Kulturmedium resuspendiert sind, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS).
- Das Geschirr 3 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 stehen lassen und die 143BTK- rho 0 Zellen auf den Geistern absetzen lassen. Stören Sie das Geschirr nicht.
3. Fusion der enukleierten Fibroblasten mit Rho-0-Zellen
- Nach 3 Stunden Inkubation das Medium absaugen und aus dem Geschirr entsorgen.
- Waschen Sie die adhärenten Zellen zweimal mit 2 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit hoher Glukose ohne Serum oder mit Minimum Essential Medium (MEM).
- Saugen Sie das Medium ab und verwerfen Sie es.
- Geben Sie 500 μL PEG-Lösung (siehe Materialtabelle) in die Zellen und inkubieren Sie für genau 1 min.
- Saugen Sie die PEG-Lösung an, und verwerfen Sie sie.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit 2 ml DMEM-hoher Glukose ohne Serum oder mit MEM.
- 2 ml Fusionsmedium zugeben (Tabelle 1) und über Nacht im Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 inkubieren.
4. Cybrid-Auswahl und -Erweiterung
- Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht die Platten aus dem Inkubator, trypsinisieren Sie die Zellen wie oben beschrieben (Schritte 2.9-2.13) und übertragen Sie den Inhalt jeder 35-mm-Schale in eine 100-mm-Schale.
- 8 ml Auswahlmedium hinzufügen (Tabelle 1) und die Platten bei 37 °C mit 5 % CO2 in den Inkubator stellen.
- Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
- Warten Sie ~ 10-15 Tage der Selektion, bis Kolonien von Zellen erscheinen.
- Frieren Sie eine der vier Petrischalen ein, indem Sie alle Klone sammeln und eine "massive" Kultur als Backup der Cybriden erzeugen, die schließlich neu geklont und für weitere Untersuchungen verwendet werden kann.
- Trypsinisieren Sie die Zellen in den verbleibenden Kulturschalen, zählen und säen Sie sie in eine oder mehrere Petrischalen bei 50-100 Zellen / Schale im ergänzten Kulturmedium (Tabelle 1), bis Klone erscheinen. Lassen Sie sie für einige Tage wachsen.
- Pelletieren Sie die verbleibenden Zellen durch Zentrifugation bei 1.200 × g für 3 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand.
- Extrahieren Sie DNA aus dem Pellet (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie eine Genotypisierung nach variabler Anzahl der parallel wiederholten (VNTR) Analysen durch, wie zuvor berichtet15.
- Nehmen Sie Klone aus der Petrischale mit Klonierungszylindern oder einer Pipettenspitze auf, indem Sie ein Stereomikroskop verwenden, um das Pooling verschiedener Klone zu vermeiden, und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-Platte, die jeweils 200 μL ergänztes Kulturmedium enthält (Tabelle 1).
- Erweitern Sie jeden Klon, bis genügend Zellen zum Einfrieren und Extrahieren von DNA vorhanden sind.
- Überprüfen Sie den Mutationsprozentsatz jedes Klons durch RFLP oder andere Sequenzierungsmethoden. Versuchen Sie idealerweise, sowohl Klone mit Wildtyp-mtDNA (0% Mutation) als auch Klone mit unterschiedlichen Mutationsprozentsätzen zu erhalten, die sich beide zu homoplasmatischer mutierter mtDNA (100% Mutation) addieren. In Abbildung 1 finden Sie ein schematisches Diagramm des Cybrid-Generierungsprotokolls.
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Representative Results
Die Erzeugung von Cybriden erfordert 3 Tage Laborarbeit plus eine Selektionszeit (~ 2 Wochen) und zusätzliche 1-2 Wochen für das Wachstum von Klonen. Die kritischen Schritte sind die Qualität der Zytoplasten und der Selektionszeitraum. Die Morphologie der Cybriden ähnelt der derrho-0-Spenderzellen. Die Zuordnung der korrekten mtDNA und nDNA in den Cybriden ist zwingend erforderlich, um die Identität der Zellen zu bestätigen. Ein Beispiel ist in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Fall erzeugten wir Cybrids ausgehend von Fibroblasten, die von einem Patienten stammten, der das heteroplasmatische m.3243A>G trug, eine der häufigsten mtDNA-Mutationen, die mit mitochondrialer Myopathie, Enzephalopathie, Laktatazidose und Schlaganfall-ähnlichen Episoden (MELAS) assoziiert sind. Die Analyse von VNTR zeigte, dass Cybrid-nDNA mit der der Rho-0-Zellen identisch ist (Abbildung 2A), was den Ersatz der nDNA des Patienten durch das 143B-Genom bestätigt. RFLP- und/oder Sequenzierungsanalysen können verwendet werden, um das Vorhandensein der mtDNA-Mutation und den Heteroplasmieprozentsatz zu beurteilen (Abbildung 2B, C).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Cybrid-Generierungsprotokolls. Patientenabgeleitete Fibroblasten werden mit Cytochalasin B behandelt und zentrifugiert, um Zytoplasten (enukleierte Zellen) zu erhalten. Die zytoplasmatische Fusion von Zytoplasten und mtDNA-dehydrierten Zellen (143BTk- rho0) ermöglicht die Erzeugung von Cybriden, die nach Selektion im entsprechenden Medium isoliert werden können. Die Aufnahme und Amplifikation einzelner Klone ergibt unterschiedliche Heteroplasmie-Prozentsätze, die theoretisch von 100% Wildtyp bis 100% mutiert variieren können. Abkürzung: mtDNA = mitochondriale DNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Molekulare Charakterisierung von Cybrids. (A) Die Analyse von Apo-B-Mikrosatelliten zeigt, dass die aus den erzeugten Cybriden extrahierte nDNA identisch ist mit der Kern-DNA der rho-0-Zelllinie. (B) HaeIII-Restriktionskarten des PCR-Produkts, die die MELAS-assoziierten m.3243A>G-Spezies umfassen und zur Quantifizierung der Menge an WT) und Mut mtDNA-Spezies verwendet werden. (C) Repräsentative Ergebnisse der RFLP-Analyse, die m.3243A>G-Heteroplasmaspiegel in verschiedenen Cybrid-Klonen (c1, c2, c3) zeigen. Abkürzungen: M = Marker; bp = Basenpaare; WT = Wildtyp; Mut = Mutant; RFLP = Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus; MELAS = mitochondriale Myopathie, Enzephalopathie, Laktatazidose und schlaganfallähnliche Episoden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Medienkomposition | |
| Komplettes Kulturmedium | Abschließende Konk. |
| DMEM-hohe Glucose (ohne L-Glutamin mit Natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (Rinderserumprodukt) | 10% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (Lösung 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Ergänztes Kulturmedium | Abschließende Konk. |
| DMEM-hohe Glucose (ohne L-Glutamin mit Natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (Rinderserumprodukt) | 10% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (Lösung 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 4 mM |
| Uridin | 50 μg/ml |
| Enukleationsmedium | Abschließende Konk. |
| DMEM-hohe Glucose (ohne L-Glutamin mit Natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (Rinderserumprodukt) | 5% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (Lösung 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Cytochalasin B von Drechslera dematioidea | 10 μg/ml |
| Fusionsmedium | Abschließende Konk. |
| DMEM-hohe Glucose (ohne L-Glutamin mit Natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (Rinderserumprodukt) | 5% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (Lösung 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Auswahlmedium | Abschließende Konk. |
| DMEM-hohe Glucose (ohne L-Glutamin mit Natriumpyruvat) | [1:1] |
| Dialysierte FBS | 5% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (Lösung 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| 5-Bromo-2'-Desoxyuridin | 100 μg/ml |
Tabelle 1: Angaben zu den für die Cybrid-Erzeugung verwendeten Medien.
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Discussion
Die mtDNA hat eine sehr hohe Mutationsrate im Vergleich zu nDNA aufgrund des Mangels an schützenden Histonen und ihrer Lage in der Nähe der Atmungskette, die das Molekül schädlichen oxidativen Effekten aussetzt, denen die Reparatursysteme nicht wirksam entgegenwirken16. Die ersten pathogenen mtDNA-Mutationen wurden1988 identifiziert 17,18, und seitdem wurde eine große Anzahl von Mutationen beschrieben. Die NGS-Technologie ist ein relevanter Ansatz, um das gesamte mitochondriale Genom zu screenen und Varianten leicht zu identifizieren14. Die Beurteilung der pathogenen Rolle einer nie beschriebenen mtDNA-Mutation kann jedoch eine Herausforderung darstellen und stützt sich immer noch auf "altmodische" Methoden wie die Erzeugung von Cybrid-Zellen, die in diesem Protokoll11,12,13 beschrieben sind. Die hier beschriebene Cybrid-Generation rekapituliert die von King und Attardi5 beschriebenen Originalmethoden. Andere Protokolle enthalten jedoch geringfügige Änderungen, die sich hauptsächlich auf Systeme zur Zellenukleationbeziehen 10. In anderen Fällen ist eine Enukleation unnötig, z. B. wenn das vom Patienten stammende biologische Material aus Blutplättchen besteht, die keinen Kern19 enthalten.
Transmitochondriale Cybride besitzen mehrere wichtige Eigenschaften, was sie zu einem relevanten Forschungsinstrument macht, auch wenn molekulare Hochdurchsatztechnologien DNA und RNA auf Einzelzellebene profilieren können. In Pionierarbeiten wurden Cybriden verwendet, um den genetischen Ursprung von Erkrankungen klinisch und biochemisch definiert als mitochondrialeStörungen 6,7,8,9,20 festzustellen oder zu bestätigen. Tatsächlich erlaubt das System ausschließlich die Untersuchung des Beitrags der mtDNA-Mutation ohne den Einfluss der Kerngene des Probanden und in einem homogenen Kernhintergrund derRho-0-Zellen.
Darüber hinaus kann eine quantitative Korrelation von Genotyp zu Phänotyp durchgeführt werden, dank der Isolierung verschiedener Cybrid-Klone, die unterschiedliche Prozentsätze der Mutationen tragen. Die verschiedenen Klone wurden mit Selektionsmedium (Tabelle 1) ausgewählt, das mit dialysiertem FBS ergänzt wurde und kein Uridin und Pyruvat enthielt, so dass das Wachstum von Rho0-Zellen ermöglichtwurde , die nur mit Zytoplasten verschmolzen waren. So werden rho0-Zellen , die nicht mit intakten Fibroblasten (bi- oder polykernhaltigen Zellen) verschmolzen waren, sowie alle verbleibenden nicht enukleierten intakten Fibroblasten eliminiert. Tatsächlich sindRho-0-Zellen durch langfristige Exposition gegenüber niedrigen Konzentrationen von Ethidiumbromid, einem starken Inhibitor der mitochondrialen Gamma-Polymerase21, vollständig von mtDNA erschöpft.
Ohne eine funktionelle Atmungskette verlassen sich rho0-Zellen ausschließlich auf Glykolyse für ihren Energiebedarf und werden pyruvatabhängig. Darüber hinaus sind Rho-0-Zellen für Pyrimidine (Uridin ist eine Pyrimidin-Vorstufe) aufgrund des Mangels an Dihydroorotat-Dehydrogenase, einem Enzym, das in Mitochondrien funktioniert und an derPyrimidin-Biosynthese beteiligt ist, auxotroph geworden. Während Rho-0-Zellen aus humanen Osteosarkom-143B-Thymidinkinase-defizienten (TK-) Zellen gewonnen werden, sind Fibroblasten, Zytoplasten und polynukleäre Hybride TK +. Daher werden TK+-Zellen aufgrund der Exposition gegenüber 5-Brom-2'-desoxyuridin entfernt. Tatsächlich wird dieses Uridinanalogon erkannt, indem TK die Phosphorylierung von Desoxythymidin katalysiert, das dann in der DNA-Biosynthese verwendet wird. Dieser Prozess führt zu tödlichen Mutationen, die den Zelltod verursachen. Ein weiterer Vorteil von Cybriden ist die Möglichkeit, sie für lange Kulturzeiten ohne Änderungen einzufrieren und/oder wiederzuverwenden. Darüber hinaus reduziert ihre hohe Wachstumsrate wie bei Tumorzellen die experimentelle Studiendauer.
Die molekulare Voraussetzung, um dieses System nützlich und zuverlässig zu machen, besteht darin, den korrekten genetischen Beitrag der nuklearen und mitochondrialen DNA und der mtDNA-Menge in den wiederbesiedelten Cybriden zu überprüfen. Heutzutage kann dies leicht mit NGS-Techniken durchgeführt werden, die die Analyse des gesamten mtDNA-Moleküls zur Definition von Haplogruppen ermöglichen und das Vorhandensein anderer unerwünschter pathogener Varianten zusätzlich zu der untersuchten Variante kontinuierlich überprüfen. Bei heteroplasmatischen Zuständen kann die Isolierung von Klonen mit unterschiedlichen Mutationslasten, idealerweise von 0% bis 100%, genutzt werden, um den Mutationsprozentsatz mit der Schwere der mitochondrialen Beeinträchtigung zu korrelieren.
Mögliche Fallstricke, die sich in diesen Cybrid-Erzeugungsverfahren verbergen, sind mit dem Tumorursprung derRho-0-Zellen verbunden, die als Kernspender verwendet werden. Diese Zellen sind aneuploide, und es ist nicht klar, wie sich dies letztendlich auf die mitochondrialen Funktionen und die Translation und den Zusammenbau der verschiedenen Untereinheiten der Atmungskette auswirken könnte, die von der Kern- bzw. Mitochondrien-DNA kodiert werden. Im Allgemeinen wäre es ratsam, Cybrids mitRho-0-Zellen unterschiedlicher Herkunft zu erzeugen und zu überprüfen, ob die erhaltenen Klone vergleichbare Phänotypen aufweisen. Eine weitere Einschränkung ist, dass Tumorzellen hauptsächlich glykolytisch sind, während mitochondriale Störungen massiv auf OXPHOS angewiesen sind. Daher muss der Einfluss eines glykolytischen Kerns (Rho-0-Zellen ) auf die Folgen einer mtDNA-Mutation sorgfältig ermittelt werden.
Trotz der oben genannten Einschränkungen hat die Erzeugung von Cybriden das Gebiet der mitochondrialen Medizin revolutioniert und wird immer noch verwendet, um die pathogene Rolle neuartiger mtDNA-Mutationen zu etablieren. Darüber hinaus wird die Cybrid-Technologie verwendet, um den mitochondrialen Beitrag zu verschiedenen Krankheiten zu untersuchen, die von häufigen neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson, Alzheimer und der Huntington-Krankheit 22,23,24,25,26 bis hin zur Krebs- und Krebsbehandlung27,28 reichen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde im Center for the Study of Mitochondrial Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org) durchgeführt, das von der Mariani Foundation finanziert wird. VT ist Mitglied des European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
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