Summary
Транспамохондриальные цибриды представляют собой гибридные клетки, полученные путем слияния митохондриальной ДНК (мтДНК)-истощенных клеток (rho0 клеток) с цитопластами (энуклеированными клетками), полученными от пациентов, страдающих митохондриальными нарушениями. Они позволяют определить ядерное или митохондриальное происхождение заболевания, оценить биохимическую активность и подтвердить патогенетическую роль вариантов, связанных с мтДНК.
Abstract
Дефицит комплексов митохондриальной дыхательной цепи, осуществляющих окислительное фосфорилирование (OXPHOS), является биохимическим маркером митохондриальных нарушений человека. С генетической точки зрения OXPHOS представляет собой уникальный пример, потому что он является результатом дополнения двух различных генетических систем: ядерной ДНК (нДНК) и митохондриальной ДНК (мтДНК). Таким образом, дефекты OXPHOS могут быть вызваны мутациями, влияющими на ядерные и митохондриальные кодированные гены.
Новаторская работа Кинга и Аттарди, опубликованная в 1989 году, показала, что клеточные линии человека, истощенные мтДНК (названные rho0), могут быть повторно заселены экзогенными митохондриями для получения так называемых «транспамохондриальных цибрид». Благодаря этим цибридам, содержащим митохондрии, полученные от пациентов с митохондриальными расстройствами (МД) и ядрами из клеток rho0 , можно проверить, связан ли дефект с мтДНК или нДНК. Эти цибриды также являются мощным инструментом для проверки патогенности мутации и изучения ее влияния на биохимическом уровне. В этой статье представлен подробный протокол, описывающий генерацию, отбор и характеристику цибрид.
Introduction
Митохондриальные расстройства (МД) представляют собой группу мультисистемных синдромов, вызванных нарушением митохондриальных функций из-за мутаций в ядерной (нДНК) или митохондриальной (мтДНК) ДНК1. Они являются одними из наиболее распространенных наследственных метаболических заболеваний, с распространенностью 1: 5000. мтДНК-ассоциированные заболевания следуют правилам митохондриальной генетики: материнское наследование, гетероплазма и пороговый эффект, митотическая сегрегация2. МтДНК человека представляет собой двухцепочечный круг ДНК размером 16,6 кб, который содержит короткую контрольную область с последовательностями, необходимыми для репликации и транскрипции, 13 генов, кодирующих белок (все субъединицы дыхательной цепи), 22 тРНК и 2 гена рРНК3.
У здоровых людей существует один единственный генотип мтДНК (гомоплазма), тогда как в патологических состояниях сосуществует более одного генотипа (гетероплазмы). Вредные гетероплазматические мутации должны преодолеть критический порог, чтобы нарушить OXPHOS и вызвать заболевания, которые могут поразить любой орган в любом возрасте4 лет. Двойная генетика OXPHOS диктует наследование: аутосомно-рецессивная или доминантная и X-сцепленная для мутаций нДНК, материнская для мутаций мтДНК, плюс спорадические случаи как для нДНК, так и для мтДНК.
В начале эры митохондриальной медицины знаковый эксперимент Кинга и Аттарди5 установил основу для понимания происхождения мутации, ответственной за MD, путем создания гибридных клеток, содержащих ядра из опухолевых клеточных линий, в которых мтДНК была полностью истощена (rho0 клеток) и митохондрий у пациентов с MD. Методы секвенирования следующего поколения (NGS) в то время были недоступны. и было нелегко определить, присутствует ли мутация в ядерном или митохондриальном геноме. Метод, описанный в 1989 году, затем использовался несколькими исследователями, работающими в области митохондриальной медицины 6,7,8,9; подробный протокол был недавно опубликован10, но видео еще не было сделано. Почему такой протокол должен быть актуален в настоящее время, когда NGS может точно и быстро определить, где находится мутация? Ответ заключается в том, что генерация цибрид по-прежнему является современным протоколом для понимания патогенной роли любой новой мутации мтДНК, корреляции процента гетероплазмы с тяжестью заболевания и выполнения биохимического исследования в однородной ядерной системе, в которой вклад автохтонного ядерного фона пациента отсутствует11, 12,13.
Этот протокол описывает, как получить цитопласты из сливающихся фибробластов, полученных от пациента, выращенных в 35 мм чашках Петри. Центрифугирование посуды в присутствии цитохалазина В позволяет выделить энуклеированные цитопласты, которые затем сплавляются с rho0 клетками в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ). Полученные цибриды затем культивируются в селективной среде до тех пор, пока не появятся клоны. В разделе репрезентативных результатов приведен пример молекулярной характеристики полученных цибрид, чтобы доказать, что мтДНК идентична фибробластам пациентов-доноров и что нДНК идентична ядерной ДНК опухолевой клеточной линии rho0 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование фибробластов человека может потребовать этического одобрения. Фибробласты, используемые в этом исследовании, были получены от пациентов с МД и хранились в институциональном биобанке в соответствии с этическими требованиями. На использование камер было дано информированное согласие. Выполняйте все процедуры культивирования клеток под стерильным ламинарным проточным шкафом при комнатной температуре (RT, 22-25 °C). Используйте стерильно-фильтрованные растворы, подходящие для клеточных культур и стерильного оборудования. Вырастите все клеточные линии в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO2. Тесты на микоплазму следует проводить еженедельно, чтобы обеспечить культуры без микоплазмы. Клетки 143BTK-rho0 могут быть сгенерированы, как описано ранее5.
1. Культура клеток
- Перед началом любой процедуры проверьте наличие мутации в фибробластах, полученных от пациента (пациентов) MD, и количественно оцените процент гетероплазмы или гомоплазмы с помощью полиморфизма длины фрагмента рестрикции (RFLP) и / или анализа секвенирования всей мтДНК14.
- Семена фибробластов в четырех чашках Петри по 35 мм, каждая из которых содержит 2 мл полной питательной среды (таблица 1). Дайте клеткам расти до 80% слива (48 ч).
- Вырастите 143BTK-rho0 клеток в 8 мл дополненной питательной среды (таблица 1) в чашке Петри 100 мм.
- Поддерживайте клетки в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
- Проверьте отсутствие мтДНК в клетках rho0 методом секвенирования14.
2. Энуклеация фибробластов
- Стерилизуйте четыре бутылки, подходящие для центрифуги объемом 250 мл, путем автоклавной стерилизации при 121 °C в течение 20-минутного цикла. Высушите их в лабораторной печи или в РТ.
- Предваряют центрифугу при 37 °C.
- Дважды вымойте посуду толщиной 35 мм, содержащую фибробласты, используя 2 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) без (без) кальция и магния.
- Очистить внешнюю поверхность посуды 70% этанолом и подождать, пока спирт испарится.
- Снимите крышки с посуды и завинчивающиеся крышки с бутылок. Поместите каждое блюдо без крышки вверх ногами на дно каждой бутылки центрифуги объемом 250 мл.
- Медленно добавляйте 32 мл энуклеационной среды в каждую бутылку (таблица 1), позволяя среде войти в блюдо и войти в контакт с клетками. Удалите все пузырьки с посуды с помощью длинной стеклянной пипетки Пастера, искривив кончик в пламени Бунзена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить пузырьки, чтобы позволить среде войти в блюдо и войти в контакт с клетками. - Закройте каждую бутылку винтовой крышкой и перенесите их в центрифугу.
- Центрифуга в течение 20 мин при 37 °C и 8 000 × g, ускорение макс., замедление медленное. Обратите внимание на балансировку центрифуги: противовес каждой бутылки. При необходимости отрегулируйте вес, добавив подходящий объем энуклеационной среды.
- Во время центрифугирования используйте вакуум или серологическую пипетку объемом 10 мл, чтобы аспирировать и выбросить среду из культуральных пластин 143BTK-rho0 и промыть их дважды, используя 4 мл 1x PBS без кальция и магния.
- Добавьте 2 мл трипсина, чтобы полностью покрыть клеточный монослой.
- Поместите посуду в инкубатор при температуре 37 °C на ~2 мин.
- Выньте чашки из инкубатора, наблюдайте за отслоением клеток с помощью перевернутого микроскопа для живых клеток (цели 4x или 10x) и ингибируйте активность фермента, добавляя 2 мл дополненной питательной среды.
- Аспирировать 4 мл клеточной суспензии в чашке пипеткой 10 мл и переложить ее в коническую трубку объемом 15 мл.
- Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометрической камеры Беркера или автоматизированного счетчика.
- В конце центрифугирования (стадия 2.8) аспирируйте среду из бутылок и выбросьте ее.
- Снимите посуду, перевернув флаконы на стерильной марле, предварительно опрысканной 70% этанолом. Очистите внешнюю поверхность посуды и ее крышки 70% этанолом. Подождите, пока спирт испарится, а затем закройте посуду.
- Прежде чем продолжить, проверьте образование цитопласта (призрака) с помощью инвертированного микроскопа для живых клеток (объектив 4x или 10x). Ищите чрезвычайно вытянутые фибробласты из-за экструзии их ядер, индуцированных цитохалазином B.
- К каждой посуде размером 35 мм добавляют 1 × 106 из 143BTK-rho0 клеток, повторно суспендированных в 2 мл 143BTK-rho0 питательной среды, дополненной 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS).
- Оставьте посуду на 3 ч в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 и дайте клеткам 143BTK-rho0 осесть на призраках. Не потревожите посуду.
3. Слияние энуклеированных фибробластов с rho 0 клетками
- После 3 ч инкубации аспирировать и выбросить среду из посуды.
- Дважды промыть адгезивные клетки 2 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco с высоким содержанием глюкозы без сыворотки или минимальной существенной средой (MEM).
- Аспирировать и выбросить среду.
- Добавьте к клеткам 500 мкл раствора ПЭГ (см. Таблицу материалов) и инкубируйте ровно 1 мин.
- Аспирировать и выбросить раствор ПЭГ.
- Промыть клетки три раза, используя 2 мл DMEM с высоким содержанием глюкозы без сыворотки или с MEM.
- Добавьте 2 мл термоядерной среды (таблица 1) и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
4. Выбор и расширение Cybrid
- После ночной инкубации извлекают пластины из инкубатора, трипсинизируют клетки, как описано выше (этапы 2.9-2.13), и переносят содержимое каждой 35-мм посуды в посуду диаметром 100 мм.
- Добавьте 8 мл селекционной среды (таблица 1) и поместите пластины в инкубатор при 37 °C с 5% CO2.
- Меняйте среду каждые 2-3 дня.
- Подождите ~10-15 дней отбора, пока не появятся колонии клеток.
- Заморозьте одну из четырех чашек Петри, собрав всех клонов и создав «массивную» культуру в качестве резервной копии цибрид, которая в конечном итоге может быть восстановлена и использована для дальнейших исследований.
- Попробуйте клетки в оставшихся чашках для культивирования, подсчитайте и посейте в одну или несколько чашек Петри по 50-100 клеток на чашку в дополненной культуральной среде (таблица 1) до появления клонов. Пусть они растут в течение нескольких дней.
- Гранулируют оставшиеся ячейки центрифугированием при 1,200 × г в течение 3 мин при РТ и отбрасывают супернатант.
- Извлеките ДНК из гранулы (см. Таблицу материалов).
- Выполняют генотипирование методом анализа с переменным числом тандемно повторяющихся (VNTR), как сообщалось ранее15.
- Возьмите клоны из чашки Петри с помощью цилиндров клонирования или наконечника пипетки, используя стереомикроскоп, чтобы избежать объединения различных клонов, и перенесите их на 96-луночную пластину, каждая скважина содержит 200 мкл дополненной питательной среды (таблица 1).
- Расширяйте каждый клон до тех пор, пока не будет достаточно клеток для замораживания и извлечения ДНК.
- Проверьте процент мутаций каждого клона с помощью RFLP или других методов секвенирования. В идеале, попробуйте получить как клоны с мтДНК дикого типа (мутация 0%), так и клоны с различным процентом мутаций, оба складываются в гомоплазматическую мутантную мтДНК (100% мутация). На рисунке 1 показана принципиальная схема протокола генерации cybrid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Генерация цибрид требует 3 дней лабораторных работ плюс период отбора (~2 недели) и дополнительные 1-2 недели для роста клонов. Важнейшими этапами являются качество цитопластов и период отбора. Морфология цибрид напоминает морфологию донорских клеток rho0. Назначение правильной мтДНК и нДНК в цибридах является обязательным для подтверждения идентичности клеток. Пример приведен на рисунке 2. В этом случае мы генерировали цибриды, начиная с фибробластов, полученных от пациента, несущего гетероплазматический m.3243A>G, одну из наиболее распространенных мутаций мтДНК, связанных с митохондриальной миопатией, энцефалопатией, лактоацидозом и инсультоподобными эпизодами (MELAS). Анализ VNTR показал, что цибридная нДНК идентична таковой у клеток rho0 (рисунок 2A), подтверждая замену нДНК пациента геномом 143B. RFLP и/или анализ секвенирования могут быть использованы для оценки наличия мутации мтДНК и процента гетероплазмы (рисунок 2B,C).
Рисунок 1: Принципиальная схема протокола генерации цибрид. Фибробласты, полученные от пациента, обрабатывают цитохалазином B и центрифугируют для получения цитопластов (энуклеированных клеток). Цитоплазматическое слияние цитопластов и мтДНК-обедненных клеток (143BTk-rho0) позволяет генерировать цибриды, которые могут быть выделены после отбора в соответствующей среде. Подбор и усиление одиночных клонов дает различные проценты гетероплазмы, которые теоретически могут варьироваться от 100% дикого типа до 100% мутированных. Аббревиатура: мтДНК = митохондриальная ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Молекулярная характеристика цибрид. (A) Анализ микроспутников Apo-B показывает, что нДНК, извлеченная из сгенерированных цибрид, идентична ядерной ДНК клеточной линии rho0 . (B) Карты ограничений HaeIII продукта ПЦР, охватывающие ассоциированные с MELAS m.3243A>G, используемые для количественной оценки количества WT) и видов мтДНК Mut. (C) Репрезентативные результаты анализа RFLP, показывающие уровни гетероплазмы m.3243A>G у различных клонов цибрид (c1, c2, c3). Сокращения: M = маркер; bp = пары оснований; WT = дикий тип; Мут = мутант; RFLP = полиморфизм длины рестрикционного фрагмента; MELAS = митохондриальная миопатия, энцефалопатия, лактоацидоз и инсультоподобные эпизоды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Медиа Композиция | |
| Полная культуральная среда | Окончательный конспект. |
| DMEM Высокий уровень глюкозы (без L-глутамина с пируватом натрия) | [1:1] |
| FetalClone III (Бычья сыворотка) | 10% |
| Пируват натрия 100 мМ | 1 мМ |
| Пенициллин-Стрептомицин (раствор 100x) | 1% |
| L-глютамин 200 мМ (100x) | 2 мМ |
| Дополненная культуральная среда | Окончательный конспект. |
| DMEM Высокий уровень глюкозы (без L-глутамина с пируватом натрия) | [1:1] |
| FetalClone III (Бычья сыворотка) | 10% |
| Пируват натрия 100 мМ | 1 мМ |
| Пенициллин-Стрептомицин (раствор 100x) | 1% |
| L-глютамин 200 мМ (100x) | 4 мМ |
| Уридин | 50 мкг/мл |
| Энуклеационная среда | Окончательный конспект. |
| DMEM Высокий уровень глюкозы (без L-глутамина с пируватом натрия) | [1:1] |
| FetalClone III (Бычья сыворотка) | 5% |
| Пируват натрия 100 мМ | 1 мМ |
| Пенициллин-Стрептомицин (раствор 100x) | 1% |
| L-глютамин 200 мМ (100x) | 2 мМ |
| Цитохалазин B из Drechslera dematioidea | 10 мкг/мл |
| Термоядерная среда | Окончательный конспект. |
| DMEM Высокий уровень глюкозы (без L-глутамина с пируватом натрия) | [1:1] |
| FetalClone III (Бычья сыворотка) | 5% |
| Пируват натрия 100 мМ | 1 мМ |
| Пенициллин-Стрептомицин (раствор 100x) | 1% |
| L-глютамин 200 мМ (100x) | 2 мМ |
| Селекционная среда | Окончательный конспект. |
| DMEM Высокий уровень глюкозы (без L-глутамина с пируватом натрия) | [1:1] |
| Диализированный FBS | 5% |
| Пируват натрия 100 мМ | 1 мМ |
| Пенициллин-Стрептомицин (раствор 100x) | 1% |
| L-глютамин 200 мМ (100x) | 2 мМ |
| 5-Бромо-2'-Дезоксиуридин | 100 мкг/мл |
Таблица 1: Подробная информация о средах, используемых для генерации цибрид.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
МтДНК имеет очень высокую частоту мутаций по сравнению с нДНК из-за отсутствия защитных гистонов и ее расположения близко к дыхательной цепи, что подвергает молекулу повреждающим окислительным эффектам, не эффективно противодействуемым системами репарации16. Первые патогенные мутации мтДНК были выявлены в 1988 году 17,18, и с тех пор было описано большое количество мутаций. Технология NGS является актуальным подходом для скрининга всего митохондриального генома и легкой идентификации вариантов14. Однако оценка патогенной роли никогда не описанной мутации мтДНК может быть сложной задачей и по-прежнему опирается на «старомодные» методы, такие как генерация клеток цибрид, описанных в этом протоколе 11,12,13. Поколение кибрид, описанное здесь, повторяет оригинальные методы, описанные Кингом и Аттарди5. Однако другие протоколы содержат незначительные модификации, в основном связанные с системами энуклеации клеток10. В других случаях энуклеация не нужна, например, когда полученный от пациента биологический материал состоит из тромбоцитов, которые не содержат ядра19.
Транспамохондриальные цибриды обладают несколькими важными особенностями, что делает их актуальным исследовательским инструментом, даже когда высокопроизводительные молекулярные технологии могут профилировать ДНК и РНК на уровне одной клетки. В новаторских работах цибриды использовались для установления или подтверждения генетического происхождения нарушений клинически и биохимически определяемых как митохондриальные расстройства 6,7,8,9,20. Действительно, система позволяет исключительно изучать вклад мутации мтДНК без влияния ядерных генов пробанда и в однородном ядерном фоне клеток rho0.
Кроме того, может быть выполнена количественная корреляция генотип-фенотип благодаря выделению различных клонов цибрид, несущих разный процент мутаций. Различные клоны были выбраны с использованием селекционной среды (таблица 1), дополненной диализированным FBS и не содержащей уридина и пирувата, что позволяет расти клеткам rho0 , слитым только с цитопластами. Таким образом, rho0 клетки, которые не срослись или срослись с интактными фибробластами (би- или полинуклеированными клетками), а также любые остаточные неэнуклеированные интактные фибробласты, удаляются. Действительно, клетки rho0 полностью истощают мтДНК при длительном воздействии низких концентраций бромида этидия, мощного ингибитора митохондриальной гамма-полимеразы21.
Не имея функциональной дыхательной цепи, клетки rho0 полагаются исключительно на гликолиз для своих энергетических потребностей и становятся пируват-зависимыми. Кроме того, клетки rho0 стали ауксотрофными для пиримидинов (уридин является предшественником пиримидина) из-за дефицита дигидрооротатдегидрогеназы, фермента, функционирующего в митохондриях и участвующего в биосинтезе пиримидина. В то время как клетки rho0 получены из клеток остеосаркомы человека 143B с дефицитом тимидинкиназы (TK-), фибробласты, цитопласты и полиядерные гибриды являются TK+. Поэтому клетки TK+ удаляются из-за воздействия 5-бром-2'-дезоксиуридина. Фактически, этот аналог уридина распознается по ТЗ, катализирующим фосфорилирование дезокситимидина, который затем используется в биосинтезе ДНК. Этот процесс приводит к смертельным мутациям, вызывающим гибель клеток. Еще одним преимуществом цибрид является возможность замораживания и/или повторного использования их в течение длительного времени культивирования без изменений. Более того, как и опухолевые клетки, их высокая скорость роста сокращает продолжительность экспериментального исследования.
Молекулярной предпосылкой для того, чтобы сделать эту систему полезной и надежной, является проверка правильного генетического вклада ядерной и митохондриальной ДНК и количества мтДНК в повторно заселенных цибридах. В настоящее время это может быть легко выполнено с использованием методов NGS, позволяющих анализировать всю молекулу мтДНК для определения гаплогрупп и непрерывно проверять наличие любых других нежелательных патогенных вариантов в дополнение к исследуемому варианту. В случае гетероплазматических состояний выделение клонов с различными мутационными нагрузками, в пределах в идеале от 0% до 100%, может быть использовано для корреляции процента мутаций с тяжестью митохондриального нарушения.
Возможные подводные камни, скрытые в этих процедурах генерации цибрид, связаны с опухолевым происхождением клеток rho0 , используемых в качестве ядерных доноров. Эти клетки являются анеуплоидными, и неясно, как это может в конечном итоге повлиять на функции митохондрий, а также на трансляцию и сборку различных субъединиц дыхательной цепи, кодируемых ядерной и митохондриальной ДНК соответственно. Как правило, было бы целесообразно генерировать цибрид с использованием rho0 клеток различного происхождения и убедиться, что полученные клоны демонстрируют сопоставимые фенотипы. Еще одним ограничением является то, что опухолевые клетки в основном гликолитические, в то время как митохондриальные расстройства в значительной степени зависят от OXPHOS. Поэтому влияние гликолитического ядра (rho0 клеток) на последствия мутации мтДНК должно быть тщательно установлено.
Несмотря на вышеуказанные ограничения, генерация цибрид произвела революцию в области митохондриальной медицины и до сих пор используется для установления патогенной роли новых мутаций мтДНК. Кроме того, цибридная технология используется для исследования митохондриального вклада в различные заболевания, начиная от распространенных нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Паркинсона, Альцгеймера и болезнь Хантингтона 22,23,24,25,26, до лечения рака и противоопухолевых заболеваний 27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Это исследование было проведено в Центре изучения митохондриальных педиатрических заболеваний (http://www.mitopedia.org), финансируемом Фондом Мариани. VT является членом Европейской референс-сети по редким нервно-мышечным заболеваниям (ERN EURO-NMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
- Gorman, G. S., et al.
- DiMauro, S., Davidzon, G.
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F.
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
