Method Article

Célula única reutilizable para análisis epigenómicos iterativos

DOI:

10.3791/63456

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February 11th, 2022

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1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo describe un método de una sola célula para análisis epigenómicos iterativos utilizando una sola célula reutilizable. La célula única reutilizable permite el análisis de múltiples marcas epigenéticas en la misma célula única y la validación estadística de los resultados.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los análisis actuales del epigenoma unicelular están diseñados para un solo uso. La célula se descarta después de un solo uso, evitando el análisis de múltiples marcas epigenéticas en una sola célula y requiriendo datos de otras células para distinguir la señal del ruido de fondo experimental en una sola célula. Este artículo describe un método para reutilizar la misma célula individual para análisis epigenómicos iterativos.

En este método experimental, las proteínas celulares se anclan primero a un polímero de poliacrilamida en lugar de entrecruzarlas a proteínas y ADN, aliviando el sesgo estructural. Este paso crítico permite repetir experimentos con la misma célula. A continuación, un cebador aleatorio con una secuencia de andamio para la ligadura de proximidad se recoce al ADN genómico, y la secuencia genómica se agrega al cebador por extensión utilizando una ADN polimerasa. Posteriormente, un anticuerpo contra un marcador epigenético y control IgG, cada uno marcado con diferentes sondas de ADN, se unen a los respectivos objetivos en la misma célula individual.

La ligadura de proximidad se induce entre el cebador aleatorio y el anticuerpo mediante la adición de un ADN conector con secuencias complementarias a la secuencia de andamio del cebador aleatorio y la sonda de anticuerpo-ADN. Este enfoque integra información de anticuerpos y secuencias genómicas cercanas en un solo producto de ADN de ligadura de proximidad. Al permitir experimentos repetidos con la misma célula única, este método permite un aumento en la densidad de datos de una célula rara y un análisis estadístico utilizando solo datos de IgG y anticuerpos de la misma célula. Las células individuales reutilizables preparadas por este método pueden almacenarse durante al menos unos meses y reutilizarse más tarde para ampliar la caracterización epigenética y aumentar la densidad de datos. Este método proporciona flexibilidad a los investigadores y sus proyectos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tecnología unicelular está entrando en la era de la multiómica unicelular, que integra tecnologías ómicas unicelulares individuales1. Recientemente, la transcriptómica unicelular se ha combinado con métodos para detectar la accesibilidad a la cromatina (scNMT-seq2 y SHARE-seq3) o modificaciones de histonas (Paired-seq4 y Paired-Tag5). Más recientemente, la transcriptómica y la proteómica unicelular se integraron con la accesibilidad a la cromatina (DOGMA-seq6). Estos métodos utilizan el etiquetado basado en transposasa para detectar la accesibilidad de la cromatina o las modificaciones de histonas.

Los enfoques basados en transposasa escinden el ADN genómico y agregan un código de barras de ADN al final del fragmento de ADN genómico. Cada fragmento genómico escindido solo puede aceptar hasta dos códigos de barras de ADN (= una marca epigenética por sitio de escisión), y el ADN genómico en el sitio de escisión se pierde. Por lo tanto, los enfoques basados en la escisión tienen una compensación entre el número de marcas epigenéticas probadas y la densidad de la señal. Esto dificulta el análisis de múltiples marcas epigenéticas en la misma célula. Para superar este problemase desarrolló un método epigenómico unicelular que no escinde el ADN genómico 7,8.

Además del problema derivado de la escisión mencionado anteriormente, los enfoques basados en la transposasa tienen otras limitaciones. En el análisis del epigenoma unicelular, es fundamental conocer la ubicación de las histonas y las proteínas asociadas al ADN en el genoma. En los enfoques actuales, esto se logra mediante el uso de células individuales no fijadas y la retención de interacciones proteína-ADN y proteína-proteína. Sin embargo, esto genera un fuerte sesgo a las regiones de cromatina accesibles, incluso en el análisis de modificaciones de histonas 9. La ubicación de las histonas y las proteínas asociadas al genoma en el genoma se puede preservar sin reticulación proteína-ADN y proteína-proteína, utilizando un andamio de poliacrilamida 7,8. Este enfoque reduce el sesgo estructural observado en los enfoques actuales que dependen de las interacciones proteína-ADN y proteína-proteína.

Los enfoques basados en transposasa pueden adquirir señales solo una vez de una sola célula. Por lo tanto, es difícil delinear el epigenoma completo de una sola célula debido a la caída de las señales. Las células individuales reutilizables se han desarrollado para superar las limitaciones actuales al permitir el análisis epigenómico iterativo en la misma célula individual.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: En la figura 1 se muestra una representación esquemática del método.

figure-protocol-1
Figura 1: Representación esquemática del flujo de trabajo del protocolo. Los pasos 7.2-13 se explican a través de representaciones esquemáticas. Cada fila indica un paso en el protocolo. Una proteína celular coloreada en verde es un nucleosoma humano generado en base a una estructura cristalina (PDB: 6M4G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Equilibrio de las columnas de desalinización

NOTA: Las columnas de centrifugado de desalinización están equilibradas como se describe en los pasos siguientes. Las columnas de desalinización equilibradas se utilizan en los pasos 2.1, 3.4 y 4.6.

  1. Retire el cierre inferior de una columna de desalinización (corte de 7 kDa, volumen de perlas de resina de 0,5 ml, consulte la Tabla de materiales) y afloje la tapa en la parte superior de la columna de desalinización.
  2. Coloque la columna en un tubo de baja unión de proteína de 1,5 ml (un tubo de recolección, consulte la Tabla de materiales) y centrifugar a 1.500 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente para eliminar la solución de almacenamiento en la columna.
    NOTA: Utilice una centrífuga de rotor oscilante para aplanar la parte superior del lecho de cuentas.
  3. Retire el flujo en el tubo de 1,5 ml y agregue 300 μL de tampón fosfato de NaCl/100 mM de 150 mM, pH 8,0 (ver Tabla 1), encima del lecho de resina.
  4. Centrifugar a 1.500 × g durante 1 min a temperatura ambiente y retirar el flujo en el tubo de recogida.
  5. Repita los pasos 1.3-1.4 tres veces más.
  6. Deseche el tampón del tubo de recolección y coloque la columna en un nuevo tubo de recolección.
  7. Utilice la columna de desalinización equilibrada de los pasos 2.1, 3.4 y 4.4.

2. Intercambio amortiguador de anticuerpos

NOTA: Elimine el glicerol, la arginina y la azida sódica de anti-H3K27ac 10, anti-H3K27me3 10, anti-Med111 y anti-Pol II10 (ver composición tampón que se muestra en la Tabla 1). Todos los siguientes procedimientos se realizan bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 1 h

  1. Aplicar la solución de anticuerpos (100 μL, ver tabla 2) a una columna de desalinización equilibrada preparada después de la etapa 1.
  2. Centrifugar a 1.500 × g durante 2 min a 4 °C y transferir el flujo desde el tubo de recolección a un tubo de baja unión de proteína de 1,5 ml.
  3. Mida la concentración de IgG usando absorbancia a 280 nm12 (use un espectrofotómetro de microvolumen).
  4. Transfiera la solución de anticuerpos a un casete de ultrafiltración (límite de peso molecular 100 kDa, 0,5 ml, consulte la tabla de materiales) y centrifugar a 12.000 × g durante 5 min a 4 °C.
  5. Mida la concentración de IgG utilizando la absorbancia a 280 nm.
  6. Repita los pasos 2.4-2.5 hasta que la concentración de IgG alcance 1 mg/ml.

3. Activación de anticuerpos

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 2.5 h

  1. Disuelva 1 mg de succinimidil 6-hidrazinonicotinato acetona hidrazona (S-HyNic, consulte la Tabla de materiales) con 100 μL de N,N-dimetilformamida anhidra (DMF, consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: El DMF es un disolvente orgánico inflamable y una potente toxina hepática absorbida a través de la piel. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  2. Añadir 0,6 μL de S-HyNic/DMF a 100 μL de la solución de anticuerpos (1 mg/ml en 150 mM NaCl/100 mM fosfato sódico, pH 8,0. Ver Tabla 2 para los anticuerpos utilizados y el control de IgG.
  3. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h (protegiendo de la luz).
  4. Aplicar 100 μL de anticuerpo reaccionado por S-HyNic en la parte superior de la columna de desalinización equilibrada (ver paso 1) y centrifugar a 1.500 × g durante 2 min a 4 °C para recoger la muestra.
  5. Deseche la columna de desalinización después de su uso.
    NOTA: La estabilidad de los grupos HyNic en proteínas y otras biomoléculas varía. Se recomienda conjugar biomoléculas modificadas con HyNic inmediatamente.

4. Activación de la sonda de ADN

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 2.5 h

  1. Disuelva una bolita de una sonda de ADN modificada con amina para anticuerpos o control IgG (sonda de anticuerpos, Tabla 3) con 20 μL de tampón de fosfato de sodio de 150 mM NaCl/100 mM, pH 8.0.
    NOTA: Busque un pellet/película delgada y transparente en la parte inferior del tubo. Aplicar el tampón directamente al pellet. Si el pellet no es visible, el pellet puede haberse desprendido y adherido a la pared o a la tapa. En este caso, centrifuga el tubo y busca un pellet en el fondo del tubo.
  2. Disuelva 1 mg de 4-formilbenzoato de succinimidil (S-4FB, consulte la Tabla de materiales) con 50 μL de DMF anhidro y agregue 10 μL de DMF a la sonda de anticuerpos disuelta.
  3. Añadir 4 μL de S-4FB/DMF preparado en el paso 4.2, mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 2 h (protegiendo de la luz).
  4. Aplique 34 μL de sonda de anticuerpos reaccionada por S-4FB en la parte superior de la columna de desalinización equilibrada (consulte el paso 1).
  5. Aplicar 15 μL de tampón fosfato sódico de 150 mM, pH 8,0, en la parte superior del lecho de gel después de que la muestra se haya absorbido completamente, y centrifugar a 1.500 × g durante 2 min a 4 °C para recoger la sonda de anticuerpos modificada con S-4FB.
  6. Utilice el flujo para la conjugación posterior; medir la absorbancia a 260 nm; y calcular la tasa de recuperación de la sonda de anticuerpos.

5. Conjugación del anticuerpo modificado con S-HyNic y la sonda de anticuerpos modificados con S-4FB

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 2 h

  1. Mezcle el anticuerpo modificado con S-HyNic y la sonda de anticuerpos modificada con S-4FB, y pipete la solución hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
  2. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente (protegiendo de la luz).
  3. Para apagar la reacción, agregue 478.8 μL de solución de enfriamiento y almacenamiento (ver Tabla 1).
  4. Transfiera la solución de anticuerpos conjugada con la sonda de anticuerpos a un casete de ultrafiltración (límite de peso molecular de 100 kDa).
  5. Centrifugar durante 5 min a 12.000 × g, 4 °C.
  6. Compruebe el volumen de la solución dentro del casete pipeteando.
  7. Repita los pasos 5.5-5.6 hasta que el volumen alcance los 100 μL y guárdelo a -20 °C.
    NOTA: La concentración de IgG se mide mediante el ELISA sándwich13,14,15 utilizando un estándar de IgG.

6. Preparación de perlas magnéticas de núcleo

NOTA: En este método, una sola célula se incrusta en una cuenta de acrilamida bicapa (ver Figura 2). El núcleo es una perla magnética de poliacrilamida. La capa externa es poliacrilamida sola. Las perlas magnéticas centrales se generan en esta sección. Esta sección no es esencial para el experimento. Tiempo: 3 h

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Figura 2: Estructura de un cordón de poliacrilamida bicapa para visibilidad y fácil manejo en experimentos REpi-seq . (A) Nanopartículas magnéticas del paso 6.6 después de la centrifugación. Las nanopartículas magnéticas se modifican con acrilamida monomérica y se integran en el cordón magnético de poliacrilamida que se muestra en B. (B) Representación esquemática de una sola celda reutilizable con una perla magnética de poliacrilamida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Mezclar 50 μL de tampón de bicarbonato de sodio 1 M, pH 8,5, y 450 μL de solución de acrilamida al 40%.
    NOTA: La acrilamida es una neurotoxina. Use guantes, un protector ocular y una bata de laboratorio. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  2. Suspender 1 g de polvo de óxido de hierro funcionalizado con éster NHS (consulte la Tabla de materiales) en el tampón acrilamida/bicarbonato de sodio e incubar a 4 °C durante la noche.
    NOTA: Debido a que las perlas de acrilamida son transparentes, puede ser difícil ver y manipular la posición de las perlas. La inclusión de un cordón de núcleo hecho de óxido de hierro mejora la visibilidad y facilita la manipulación porque la posición de las perlas se puede controlar con un imán. Sin embargo, si los usuarios están familiarizados con los experimentos REpi-seq, se puede omitir el uso de las perlas de poliacrilamida magnética central.
  3. Transfiera la suspensión de nanoperlas a 2 tubos (1,5 ml), centrifugar a 21.300 × g durante 1 h (use un rotor en ángulo) a 4 °C y retire el sobrenadante.
  4. Suspenda la suspensión inferior con 1 ml de acrilamida/bis-acrilamida al 40% (19:1, consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: La bis-acrilamida es una neurotoxina. Use guantes y una bata de laboratorio. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  5. Centrífuga a 21.300 × g durante 1 h (utilizar un rotor en ángulo) a 4 °C.
  6. Centrífuga a 5.000 × g durante 30 min (utilice un rotor de giro sin freno) a 4 °C.
  7. Retire el sobrenadante con una pipeta P1000 con aspiración a baja velocidad.
  8. Ajuste el volumen a 400 μL de acrilamida/bis-acrilamida al 40% (19:1, véase la Tabla de materiales).
  9. Añadir 25 μL de solución de persulfato de amonio al 10% (ver Tabla 1).
    NOTA: El persulfato de amonio es un agente oxidante fuerte. El polvo en el aire que contiene persulfato de amonio puede irritar los ojos, la nariz, la garganta, los pulmones y la piel al contacto. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  10. Para generar perlas de poliacrilamida magnética central, transfiera 0,5 μL de la suspensión de óxido de hierro modificada con acrilamida a un tubo de PCR.
  11. Añadir 50 μL de N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina/aceite mineral al 4% (TEMED, ver Tabla 1) e incubar durante la noche a temperatura ambiente.
    NOTA: TEMED es un disolvente inflamable. Trabaja bajo una capucha. No inhale. Manténgase alejado de llamas abiertas, superficies calientes y fuentes de ignición. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.

7. Modificación del grupo amino de proteínas celulares con acrilamida monómera

NOTA: REpi-seq fue diseñado para analizar el epigenoma de células de ratón y humanas a nivel de una sola célula. Cada paso debe optimizarse cuando se utiliza este método en células de especies distintas del ratón o el ser humano.

  1. Cosechando las células
    NOTA: Tiempo: 30 min
    1. Mida la concentración y viabilidad de la celda usando un contador de celdas (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: La viabilidad de las celdas en este paso afecta a cuántas células son células vivas en el análisis de datos.
    2. Ajustar la concentración celular a 1 × 105 células/ml con medio de cultivo (*) que contenga un 10% de suero fetal bovino.
      NOTA: *El medio de cultivo es un medio de cultivo óptimo para las células de interés.
    3. Transfiera 1 ml de la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml.
    4. Centrifugar la suspensión celular a 240 × g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.
    5. Añadir 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), mezclar las células mediante un pipeteo suave y centrifugar la suspensión celular a 240 × g durante 5 min a 4 °C.
    6. Retire el sobrenadante.
      NOTA: Todos los pasos anteriores deben realizarse en una campana de limpieza de flujo laminar para evitar la contaminación.
  2. Modificación del grupo amino de proteínas celulares con acrilamida monomérica
    NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 1.5 h
    1. Agregue 1 ml de solución de modificación de grupos amino (ver Tabla 1) a la gránula celular y suspenda la gránula celular con un pipeteo suave.
    2. Incubar el tubo en hielo durante 1 h y centrifugar la suspensión celular a 240 × g durante 5 min a 4 °C.
    3. Retire el sobrenadante y resuspenda las células con 100 ml de acrilamida/1 mM EDTA/PBS al 4% que contenga un colorante intercalador para el ADN (ver Tabla 1, 1 célula/μL).

8. Preparación de células individuales reutilizables

  1. Preparación de celdas individuales reutilizables (versión manual)
    NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 9 h/96 celdas
    1. Mezclar 1 ml de la suspensión celular (1 célula/μL) y 199 ml de 1 mM EDTA/PBS que contenga un colorante intercalador para ADN (ver Tabla 1).
    2. Transfiera 200 μL de la suspensión celular a cada pocillo de placas de fondo plano de 96 pocillos (total 10 placas, consulte la Tabla de materiales).
    3. Coloque la cubierta en la placa de 96 pocillos y escanee las 10 placas con un microscopio de barrido (consulte la Tabla de materiales) para identificar pozos que contengan una sola celda.
    4. Transfiera el contenido del pozo que contiene una sola célula a un tubo de PCR.
      1. Incline la placa (hacia el operador) y espere unos minutos hasta que la celda individual se haya hundido en el borde inferior del pozo.
      2. Coloque la punta de la pipeta en la esquina inferior y transfiera la célula individual y el tampón (aspirar 210 μL/pocillo = 200 μL de tampón + 10 μL de aire) a un tubo de PCR.
        NOTA: Asegúrese de utilizar una punta de baja retención P200.
      3. Verifique el pozo con un microscopio de fluorescencia para confirmar la transferencia.
      4. Si todavía hay una sola célula en el pozo, agregue 200 μL/pocillo de 1 mM EDTA/PBS que contenga un colorante intercalador para el ADN.
      5. Luego, repita la transferencia.
    5. Centrifugar el tubo de PCR a 240 × g durante 5 min a 4 °C utilizando un rotor de giro sin freno.
      NOTA: El frenado provoca un flujo arremolinado de agua en el tubo, lo que interrumpe la precipitación de la celda individual. Al centrifugar con un rotor oscilante sin freno, la celda única siempre se hundirá hasta el fondo del tubo. Sin embargo, si se utiliza un rotor en ángulo, la celda única se une a la pared lateral del tubo de PCR y podría perderse.
    6. Eliminar 195 μL del sobrenadante con una velocidad de pipeteo muy lenta.
    7. Añadir 195 μL/tubo de solución de acrilamida/bis-acrilamida/APS (ver tabla 1).
    8. Centrifugar el tubo de PCR a 240 × g durante 5 min a 4 °C utilizando un rotor de giro sin freno.
    9. Eliminar 195 μL del sobrenadante con una velocidad de pipeteo muy lenta.
    10. Transfiera los 3 μL inferiores al tubo de PCR que contiene un 4% de TEMED/aceite mineral y un cordón magnético de poliacrilamida (generado en el paso 6).
      NOTA: Asegúrese de utilizar una punta de baja retención P10. Dispense la celda cerca de la perla magnética de poliacrilamida. En el aceite mineral, el líquido que contiene la célula única se adhiere a la superficie del cordón de poliacrilamida magnética por tensión superficial.
    11. Incubar durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: Este proceso genera una perla de gel de acrilamida bicapa. El núcleo es una cuenta de gel magnética. La capa externa es un gel de poliacrilamida que contiene una sola célula. La célula individual está incrustada en la capa externa del gel. Punto de parada seguro: Después de lavar las células individuales reutilizables con 50% de glicerol/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% de tampón BSA/TBS, las células individuales reutilizables se pueden almacenar a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
  2. Preparación de celdas individuales reutilizables (versión semiautomatizada)
    NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 3 h/96 celdas
    1. Mezclar 1 ml de suspensión celular (1 célula/μL) y 199 ml de 1 mM EDTA/PBS que contenga un colorante intercalador para ADN (ver Tabla 1).
    2. Transfiera 200 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de nanopocillos de 4 nL (consulte la Figura 3 y la Tabla de materiales) y coloque la placa de nanopocillos de 4 nL en un robot automatizado de recolección de células individuales (consulte la Tabla de materiales).
    3. Coloque una placa de PCR de 96 pocillos como placa de destino en el robot automatizado de recolección de células individuales. Asegúrese de que cada pocillo contenga 200 μL/pocillo de solución de acrilamida/bis-acrilamida/APS (ver Tabla 1).
    4. Transfiera una sola célula de un nanopocillo de 4 nL a un pocillo de la placa de PCR de 96 pocillos (consulte el video suplementario S1).
    5. Coloque una tapa encima de la placa de PCR de 96 pocillos y centrifugar la placa de 96 pocillos a 240 × g durante 5 minutos a 4 °C utilizando un rotor de giro sin freno.
    6. Coloque la placa de PCR de 96 pocillos en la plataforma de un robot automático de manejo de líquidos (consulte la Tabla de materiales, Figura 4 y el Código suplementario 1).
    7. Arrastre y suelte el Código suplementario 1 en la ventana del software (consulte la Tabla de materiales) del robot de manipulación de líquidos.
    8. Ejecute el programa en el robot automático de manipulación de líquidos (consulte el vídeo suplementario S2 y el vídeo suplementario S3).
      1. Eliminar 195 μL del sobrenadante con una velocidad de pipeteo muy lenta.
      2. Añadir 50 μL de TEMED/aceite mineral al 4%.
        NOTA: Los pasos 8.2.8.1-8.2.8.2 se pueden realizar mediante pipeteo manual.
    9. Incubar durante la noche a temperatura ambiente (Figura 5). Punto de parada seguro: Después de lavar las células individuales reutilizables con 50% de glicerol/1 mM EDTA/0,05% de tween 20/0,5% de tampón BSA/TBS, guarde las células individuales reutilizables a -20 °C durante un máximo de 6 meses.

figure-protocol-3
Figura 3: Selección automática de células individuales y transferencia a una placa de PCR de 96 pocillos en el paso 8.2 . (A) Descripción general de un sistema de recolección de células únicas. Un solo robot de recolección de células está en una campana de limpieza de flujo laminar para evitar la contaminación. (B) Una placa de 24 pocillos con 4 nL nanopocillos dentro del pozo. (C) Distribución de celdas en un pozo de la placa de 24 pocillos. Los puntos verdes son células identificadas como una sola célula en cada nanopocillo de 4 nL. Los puntos magenta son células identificadas como dobletes o multipletes de células. (D) Imagen de campo claro del pozo en la placa de 24 pocillos. Un cuadrado verde es un nanopozo de 4 nL que contiene una sola célula. Un cuadrado magenta es un nanopozo de 4 nL que contiene múltiples células. (E) Campo magnificado de unos nanopocillos de 4 nL. Los puntos brillantes son células individuales en nanopocillos de 4 nL. El sistema de selección de células individuales identifica nanopozos que contienen una sola célula mediante la adquisición de imágenes de campo claro y fluorescencia de células con tinción DAPI. Las células individuales identificadas se transfieren del nanopocillo de 4 nL a un pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Barras de escala = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Abreviatura = DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-4
Figura 4: Generación de celdas individuales reutilizables utilizando un robot de manejo de líquidos. (A) Una cubierta del robot de manejo de líquidos. La plataforma tiene 11 ranuras para bastidores de punta de pipeta (punta P300: ranuras 1-3, punta P20: ranuras 5-6), placa de 96 pocillos de pozo profundo de 2 ml (ranura 4), dos placas de PCR de 96 pocillos que contienen una sola celda por pocillo (ranuras 7 y 10) y dos placas de fondo plano de 96 pocillos para residuos líquidos (ranuras 8 y 11). (B) La cubierta después de colocar los artículos de laboratorio. (C) Representación esquemática del pipeteo robótico en el paso 8.8.1. El programa elimina el sobrenadante sin aspirar una sola célula de la parte inferior de la placa de PCR de 96 pocillos. (D) Celdas individuales reutilizables generadas utilizando el Código Suplementario 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

9. Recocido y extensión aleatorios de cebador

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Los asteriscos (*) en los pasos siguientes indican que se puede utilizar un separador magnético para controlar la posición de las perlas de poliacrilamida que contienen una sola celda reutilizable en el tubo. Sin embargo, el uso del separador magnético no es esencial. Al bajar lentamente la punta de la pipeta a lo largo de la pared del tubo, las perlas se empujan hacia arriba para el lavado o el intercambio de tampón. Tiempo: 9 h

  1. Eliminar el aceite mineral por pipeteo (*) y lavar (*) 5 veces con 200 μL de tampón 1x TP Mg(-) (diluir 10x TP Mg(-) tampón a 1x tampón con agua ultrapura, ver Tabla 1).
  2. Retirar el sobrenadante (*) y añadir 15 μL de tampón recocido (véase la tabla 1).
  3. Incubar durante 1 h en hielo.
    NOTA: El propósito de esta incubación es permeabilizar las membranas plasmáticas y nucleares y entregar el cebador aleatorio al núcleo celular.
  4. Coloque los tubos de PCR en un termociclador y caliente a 94 °C durante 3 min.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 20 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.
  5. Transfiera los tubos a un bloque de metal refrigerado por hielo e incube durante 2 minutos.
  6. Añadir 4 μL de mezcla de MgSO4/NaCl/dNTP (ver Tabla 1) y mezclar con un mezclador de vórtice a velocidad media.
  7. Añadir 1 μL de Bst polimerasa, fragmento grande (ver la Tabla de materiales) y mezclar utilizando un mezclador de vórtice a velocidad media.
  8. Incubar durante 4 h en una agitadora (600 rpm a 4 °C).
    NOTA: El propósito de esta incubación es entregar la polimerasa Bst al núcleo celular.
  9. Coloque el tubo de PCR en un termociclador y ejecute uno de los siguientes programas.
    1. Ejecute un programa de 4 h: 10 °C durante 30 min, 20 °C durante 30 min y 25 °C durante 180 min.
    2. Alternativamente, ejecute un programa nocturno: 4 ° C durante 4 h, 10 ° C durante 2 h, 20 ° C durante 2 h, 25 ° C durante 4 h y mantener a 4 ° C.
      NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 25 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C. Punto de parada seguro: Detenga el experimento aquí hasta 1 día almacenando las celdas individuales reutilizables a 4 °C.

10. Unión de anticuerpos

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 1.5 h

  1. Añadir 1,625 μL de solución de NaCl/EDTA/BSA (ver Tabla 1) y mezclar por vórtice a baja velocidad.
    NOTA: Este paso tiene como objetivo 1) facilitar la quelación de Mg2+ por EDTA, 2) estabilizar la unión del1er cebador aleatorio extendido por 300 mM NaCl, y 3) bloquear la unión inespecífica de anticuerpos utilizando albúmina sérica bovina (BSA) en la reacción posterior.
  2. Incubar durante 1 h en hielo y añadir 0,1 μg/ml de cada uno de anticuerpos y control de IgG conjugada con la sonda de anticuerpos (preparada en el paso 5).
  3. Incubar durante la noche en hielo con una suave agitación en una coctelera.

11. Ligadura de proximidad de la sonda de anticuerpos y cebador aleatorio extendido proximalmente

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Los asteriscos (*) en los pasos siguientes indican dónde se puede utilizar un separador magnético para controlar la posición de las perlas de poliacrilamida que contienen una sola celda reutilizable en el tubo. Sin embargo, el uso del separador magnético no es esencial. Al bajar lentamente la punta de la pipeta a lo largo de la pared del tubo, las perlas se pueden empujar hacia arriba para el lavado o el intercambio de tampón. Tiempo: 6 h

  1. Lavar (*) dos veces con 200 μL de 1x tampón TPM-T (20 min de incubación en cada lavado) sobre hielo. Diluir 10x TPM-T tampón (Tris-HCl/cloruro de potasio/sulfato de magnesio/Triton X-100) a 1x con agua ultrapura).
  2. Retire (*) el sobrenadante y lave (*) una vez con 1x tampón de ADN ligasa T4 (consulte la Tabla de materiales).
  3. Retire (*) el sobrenadante y añada 19 μL de solución adaptadora para ligaduras (ver Tabla 1).
  4. Incubar durante 1 h a 25 °C.
  5. Agregue 1 μL de ADN ligasa T4 (consulte la Tabla de materiales) y mezcle el tubo en un mezclador de vórtice a velocidad media.
  6. Coloque el tubo en un termociclador y ejecute el siguiente programa: programa de ligadura de proximidad, 4 h a 16 °C y 30 min a 25 °C.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 25 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es la temperatura ambiente.
  7. Lavar (*) dos veces brevemente con 200 μL de 1x tampón Bst Mg(-) EDTA(+) (ver Tabla 1; preparar 1x tampón a partir de 10x tampón madre) y conservar la celda a 4 °C, durante toda la noche. Punto de parada seguro: Detenga el experimento aquí hasta 1 día almacenando las celdas individuales reutilizables a 4 °C.

12. Extensión completa del 1er cebador aleatorio

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 4.5 h

  1. Lavar dos veces con 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-) tampón (ver Tabla 1, preparar 1x tampón de 10x tampón madre), quitar el sobrenadante y añadir 20 μL de mezcla Bst/dNTPs/MgSO4 (ver Tabla 1).
  2. Mezclar con un mezclador de vórtice a velocidad media e incubar durante 4 h en un agitador orbital (a 6 °C y 500 rpm).
  3. Coloque el tubo en un termociclador y ejecute el siguiente programa: programa de extensión completa: 10 °C durante 1 h, 20 °C durante 1 h, 30 °C durante 1 h, 40 °C durante 1 h, 50 °C durante 1 h, 65 °C durante 1 h, 94 °C durante 10 min, y mantener a 4 °C.
    NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener aquí hasta 1 día almacenando las celdas individuales reutilizables a 4 °C.

13. Amplificación de desplazamiento múltiple

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 2.5 h (pasos 13.1-13.2) + 15 min (pasos 13.3-13.4) + 1 día (pasos 13.5-13.10)

  1. Añadir 0,4 μL de 100 μM2º cebador aleatorio (ver Tabla 3) y mezclar con un mezclador de vórtice a velocidad media.
  2. Incubar durante 2 h a 6 °C y 500 rpm en un agitador orbital, colocar el tubo en un termociclador y calentar a 94 °C durante 3 min.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 25,4 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.
  3. Coloque los tubos en un bloque de metal refrigerado por hielo y agregue 1 μL/tubo de ADN polimerasa Bst.
  4. Vortex a baja velocidad, coloque los tubos en un termociclador y ejecute el siguiente programa:
    4 °C durante 4 h, 10 °C durante 30 min, 20 °C durante 30 min, 30 °C durante 30 min, 40 °C durante 30 min, 50 °C durante 30 min, 65 °C durante 60 min, 94 °C durante 3 min, y mantener a 4 °C.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 26,4 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C. Punto de parada seguro: Detenga el experimento aquí hasta 1 día almacenando las celdas individuales reutilizables a 4 °C.
  5. Recoja el sobrenadante (aproximadamente 20 μL) y transfiéralo a un tubo de PCR.
  6. Conservar el sobrenadante recogido a -80 °C.
  7. Añadir 20 μL/tubo de tampón Tween 20/0,1x TE al 0,05% a un tubo de PCR que contenga la célula individual reutilizable (ver Tabla 1) e incubar la célula individual reutilizable a 4 °C, durante la noche. Punto de parada seguro: Detenga el experimento aquí durante unos días extendiendo el tiempo de incubación.
  8. Recoger el sobrenadante y combinarlo con la muestra recogida en el paso 13.5.
  9. Repita los pasos 13.7-13.8 una vez más. Remoje la célula individual reutilizable en un tampón 50% de glicerol/5 mM EDTA/0,5% BSA/0,05% Tween20/TBS e incubarlo durante 30 min en un agitador orbital (4 °C, 600 rpm). Almacene la celda individual reutilizable a -20 °C hasta el siguiente experimento.
  10. Añadir 40 μL de mezcla Exo-master (ver Tabla 1) y colocar el tubo en un termociclador y ejecutar el siguiente programa: i) 95 °C durante 5 min, ii) 95 °C durante 30 s, iii) 60 °C 30 s, iv) 72 °C durante 30 s, v) repetir los pasos ii-iv 19 veces, vi) 72 °C durante 5 min, vii) mantener a 4 °C.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 45 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C. Punto de parada seguro: El experimento puede detenerse aquí durante al menos unos días almacenando la muestra a -80 °C.

14. Purificación de fenol-cloroformo y precipitación de polietilenglicol

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 1.5 h

  1. Transfiera el producto a un tubo de baja unión de ADN de 0,5 ml y agregue 100 μL de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico.
    NOTA: Fenol: Cloroformo: Alcohol isoamílico causa irritación y posiblemente quemaduras por contacto. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Use solo con ventilación adecuada o use un respirador apropiado. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  2. Agitar durante 30 s a mano y centrifugar a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C.
  3. Recolectar la fase acuosa (80 μL) en un tubo de baja unión de ADN de 0,5 ml y añadir 40,84 μL/tubo de mezcla lineal de acrilamida/MgCl2 (ver Tabla 1).
  4. Añadir 47,06 μL/tubo de PEG8000 al 50% (p/v) (sin RNasa) y mezclar por pipeteo.
  5. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente y centrifugar a 240 × g durante 10 min a temperatura ambiente.
  6. Retire el sobrenadante y agregue 400 μL/tubo de etanol al 80% (EtOH).
  7. Lave con EtOH al 80%, retire el sobrenadante con un aspirador y seque al aire el pellet.
  8. Suspender el pellet con 20 μL de 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, tampón pH 7.4, y almacenar la solución a -80 °C.
    NOTA: Mida la concentración de ADN utilizando un tinte intercalador específico de ADN bicatenario (consulte la Tabla de materiales). Punto de parada seguro: El experimento se puede detener aquí de forma segura durante al menos una semana.

15. Transcripción in vitro

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa y RNasa. Tiempo: 5 h

  1. Descongelar el ADN de productos derivados de una sola célula (a partir del paso 14) y preparar una biblioteca mixta de productos derivados de una sola célula mezclando 2 μL/célula de los productos de ADN (volumen total 20 μL).
  2. Añadir 26 μL de mezcla maestra de transcripción in vitro (véase la Tabla de materiales y el protocolo del fabricante) y mezclar por pipeteo.
  3. Colocar el tubo de PCR en un termociclador e incubar durante 4 h a 37 °C.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de 46 μL. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.
  4. Agregue 5 μL de tampón 10x DNasa I (consulte la Tabla de materiales) y agregue 4 μL de DNasa I (libre de RNasa, 4 U, consulte la Tabla de materiales).
  5. Mezclar e incubar durante 15 min a 37 °C, y transferir la muestra a un tubo de 0,5 ml.
  6. Añadir 300 μL/tubo de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio (véase la tabla de materiales) y mezclar mediante un vórtice suave.
    NOTA: El tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio puede provocar quemaduras químicas graves por contacto. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Use solo con ventilación adecuada o use un respirador apropiado. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  7. Incubar durante 5 minutos en R.T. en un agitador y luego almacenar muestras a -80 °C durante un máximo de 3 días.
    NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener de forma segura aquí hasta por 3 días.

16. Purificación de ARN

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa y RNasa. Tiempo: 2 h

  1. Añadir 80 μL/tubo de cloroformo a la muestra del paso 15.7 y agitar vigorosamente el tubo a mano durante 15 s.
  2. Incubar durante 2-15 min a temperatura ambiente y centrifugar la muestra a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C.
  3. Recoger y transferir la fase acuosa de la muestra (~200 μL) a un nuevo tubo de 1,5 ml.
  4. Añadir 600 μL/tubo de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio y transferir la muestra a un tubo de 1,5 ml.
  5. Añadir 180 μL/tubo de cloroformo y agitar el tubo vigorosamente a mano durante 15 s.
  6. Centrifugar la muestra a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C.
  7. Recoger y transferir la fase acuosa de la muestra (~450 μL) a un tubo de 1,5 ml.
  8. Añadir 60 μL/tubo de acrilamida lineal (5 μg/μL) y añadir 400 μL/tubo de isopropanol al 100% a la fase acuosa.
  9. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 10 min y centrifugarlo a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C.
  10. Retire el sobrenadante con cuidado.
  11. Lave el pellet de ARN 3 veces con 200 μL de etanol al 75% (agua libre de EtOH/RNasa), retire el sobrenadante y seque al aire el pellet de ARN.
    NOTA: No permita que el ARN se seque completamente porque el pellet puede perder solubilidad.
  12. Resuspender el pellet de ARN en 20 μL de agua libre de RNasa que contenga un inhibidor de la ARNasa (1 μL/20 μL) y disolver el pellet por pipeteo.
  13. Mida la absorbancia a 260 nm.

17. Transcripción inversa

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 1 h

  1. Añadir 7 μL/tubo de cebador de transcripción inversa + mezcla de dNTP (ver Tabla 1 y Tabla 3) y colocar los tubos en un termociclador.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de 27 μL. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.
  2. Calentar a 65 °C durante 5 min y colocar los tubos sobre hielo durante al menos 1 min.
  3. Añadir 14 μL/tubo de mezcla maestra de transcriptasa inversa (ver Tabla 1) y mezclar por pipeteo.
  4. Colocar los tubos en un termociclador e incubarlos a 55 °C durante 10 min y luego a 80 °C durante 10 min.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de 60 μL. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.

18. Síntesis de la segunda cadena

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 2.5 h

  1. Añadir 40 μL/tubo de agua ultrapura y dividir la solución de 100 μL en dos tubos de PCR de 0,2 ml (50 μL/tubo).
  2. Añadir 60 μL/tubo de mezcla de síntesis de segunda hebra (ver Tabla 1) y colocar los tubos en un termociclador y ejecutar el siguiente programa: i) 95 °C durante 5 min, ii) 95 °C durante 30 s, iii) 60 °C durante 30 s, iv) 72 °C durante 30 s, v) repetir los pasos ii-iv 20 veces, y vi) mantener a 4 °C.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de 110 μL. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.
  3. Añadir 4,4 μL/tubo de EDTA 0,5 M (20 mM finales) y conservar a -80 °C, durante toda la noche.
    NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener de forma segura aquí hasta por unos pocos días.
  4. Purificar el ADN mediante purificación de fenol-cloroformo y precipitación de polietilenglicol (descrito en el paso 14).
    NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener de forma segura aquí durante al menos una semana.

19. Digestión de enzimas de restricción y selección de tamaño

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 3 h (pasos 19.1-19.7)

  1. Mida la concentración de ADN del ADN purificado (a partir del paso 18.4) midiendo la absorbancia a 260 nm.
  2. Transfiera 6 μg de ADN a un tubo de PCR, agregue 30 μL de tampón de digestión 10x y ajuste el volumen a 294 μL con agua ultrapura.
  3. Añadir 6 μL de enzima de restricción BciVI e incubar a 37 °C durante 1 h.
  4. Realizar precipitación de EtOH con poliacrilamida lineal.
    1. Añadir 60 μL/tubo de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) y añadir a continuación 40 μL/tubo de acrilamida lineal (5 mg/ml, ver la tabla de materiales).
    2. Añadir 400 μL/tubo de EtOH e incubar durante la noche a -20 °C.
      NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener aquí de forma segura por un día.
    3. Centrifugar 12.000 × g durante 10 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.
    4. Lave el pellet dos veces con 80% de EtOH y séquelo.
    5. Disuelva el pellet con 20 μL de tampón 1xTE y agregue 4 μL/tubo de tampón de carga de gel 6x fresco.
  5. Cargue la muestra en un gel de agarosa al 5% / tampón TAE 0.5x y realice la electroforesis (50 V durante 40 min).
  6. Corte y recoja el gel a más de 50 pb (ver Figura 6) y extraiga el ADN usando un kit de extracción en gel.
    NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener de forma segura aquí durante al menos una semana.
  7. Construir la biblioteca de secuenciación utilizando un kit de preparación de bibliotecas de ADN (ver la Tabla de Materiales)16,17.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las celdas individuales K562 se generaron utilizando el protocolo descrito en el paso 8 (consulte la figura 5). Las células individuales se incrustaron en la capa externa de la perla de poliacrilamida. El ADN celular se tiñó y visualizó utilizando un tinte intercalador para la tinción del ADN.

figure-results-1
Figura 5: Células...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe el protocolo paso a paso para el análisis multiepigenómico unicelular recientemente reportado utilizando células individuales reutilizables7. En los párrafos siguientes, discutimos puntos críticos, enfatizando las posibles limitaciones en el protocolo.

Uno de los puntos críticos a lo largo del protocolo (de los pasos 7.2-13) es evitar la contaminación por DNasa. Una sola célula solo tiene dos copias de ADN genómico. Por lo tanto, el ADN genómico ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ohnuki y Tosato son coinventores de una patente titulada "Métodos para preparar una sola célula reutilizable y métodos para analizar el epigenoma, el transcriptoma y el genoma de una sola célula" (EP3619307 y US20200102604). La solicitud de patente se presentó en parte sobre la base de los resultados preliminares relacionados con la tecnología descrita en el manuscrito actual. La invención o invenciones descritas y reivindicadas en esta solicitud de patente se realizaron mientras los inventores eran empleados a tiempo completo del Gobierno de los Estados Unidos. Por lo tanto, bajo 45 Código de Regulaciones Federales Parte 7, todos los derechos, títulos e intereses de esta solicitud de patente han sido o deben ser asignados por ley al Gobierno de los Estados Unidos. El Gobierno de los Estados Unidos transfiere una parte de las regalías que recibe a sus empleados inventores en virtud del artículo 3710c del Código de los Estados Unidos.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a los doctores David Sánchez-Martin y Christopher B. Buck por sus comentarios durante la etapa de conceptualización del proyecto. También agradecemos al Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health por su ayuda en experimentos preliminares, y al Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH por su asesoramiento en análisis computacional. Anna Word por ayudar con la optimización de las ADN polimerasas utilizadas en el método. Este trabajo utilizó los recursos computacionales del clúster Biowulf (http://hpc.nih.gov) de NIHHPC. Este proyecto es apoyado por el Programa Intramuros del Centro de Investigación del Cáncer, el Instituto Nacional del Cáncer, los Institutos Nacionales de Salud, el Premio a la Innovación del Director del NCI (#397172) y fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer bajo el Contrato No. HHSN261200800001E. Agradecemos a los doctores Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy y a todos los miembros del Laboratorio de Oncología Celular por sus comentarios productivos.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Tampón CutSmartNew England BioLabsB600410x Tampón de digestión
Etanol de 200 gradosWarner-Graham CompanyAnticuerpo
monoclonal de etanol 5-hidroximetilcitosina (5-hmC) de etanol de 200 pruebas [HMC/4D9]EpigentekA-1018-100Anti-5hmC
Tinción de naranja/yoduro de propidinaLogosBiosystems F23001Contador de células
Solución de acrilamida, 40% en H2O, para biología molecularMilliporeSigma01697-500MLSolución de acrilamida al 40%
Microscopio de fluorescencia todo en uno BZ-X710KeyenceBZ-X710Microscopio de barrido
Amicon Ultra-0.5 Unidad de filtro centrífugoMilliporeSigmaUFC510024Casete de ultrafiltración
Persulfato de amonio para biologíamolecularMilliporeSigmaA3678-100GPolvo de persulfato de amonio
DMF anhidroLaboratoriosS-4001-005N,N-dimetilformamida anhidra (DMF)
Anti-ARN polimerasa II CTD repetición YSPTSPS (fosfo S5) anticuerpo [4H8]Abcamab5408Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (fosfo T1457)anticuerpo Abcamab60950Anti-Med1
BciVINew England BioLabsR0596LBciVI
Solución de albúmina sérica bovina, 20 mg/ml en H2O, baja biocarga, sin proteasa, para biología molecularMilliporeSigmaB8667-5ML20% BSA (Tabla 7)
Bst ADN polimerasa, fragmento grandeNew England BioLabsM0275LBst ADN polimerasa
BT10 Serie 10 y micro; l Punta de barreraNEPTUNEBT10P10 punta de baja retención
CellCelectorAutomated Lab SolutionsN/ARobot automatizado de selección de una sola célula
CellCelector 4 nl placas de nanopocillos para clonación de una sola célula, placa S200-100 100K, 24 pocillos,ULAAutomated Lab SolutionsCC00794 nL placa de nanopocillos
ChloroformMilliporeSigmaChloroform
Corning Costar de 96 pocillos, tratado con cultivo celular, microplaca de fondo planoCorning3596Placas de fondo plano de 96 pocillos
Deep Vent (exo-) ADN polimerasaNew England BioLabsM0259LExo- ADN polimerasa
Tubos LoBind de ADN, 0,5 mLEppendorf301080350,5 mL Tubo de baja unión
ADN Oligo, 1ª cebadora aleatoriaTecnologías de ADN integradasN/ A, ver Tabla 31º cebador aleatorio
ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#01Integrated DNA TechnologiesN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#02Integrated DNA TechnologiesN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#03Integrated DNA TechnologiesN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#04Tecnologías de ADN integradasN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#05Tecnologías de ADN integradasN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#06Tecnologías de ADN integradasN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#07Integrated DNA TechnologiesN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#08Integrated DNA TechnologiesN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#09Integrated DNA TechnologiesN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#10Tecnologías de ADN IntegradasN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#11Tecnologías de ADN integradasN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#12Tecnologías de ADN integradasN/A, ver Tabla 32º cebador aleatorio
ADN Oligo, 2º cebador de síntesisTecnologías de ADN integradasN/A, ver Tabla 32º cebador
de síntesisDNA Oligo, Adaptador de LigaduraIntegrated DNA TechnologiesN/A, ver Tabla 3Adaptador de Ligadura
DNA Oligo, Clonación Inversa IntegratedDNA TechnologiesN/A, ver Tabla 3Clonación Inversa Imprimación
DNasa I (sin RNasa)New England BioLabsM0303LDNasa I (sin RNasa, 4 U).
Tampón de reacción de DNasa INew England BioLabsB0303S10x Tampón de DNasa I (NEB)
Mezcla dNTP (10 mM cada uno)Thermo FisherR019210 mM dNTPs
Suero fetal bovino, origen de EE. UU.,MilliporeSigmaF4135-500MLSuero fetal bovino
HiScribe T7 Kit de síntesis de ARN de alto rendimientoNew England BioLabsE2040SMezcla maestra de transcripción in vitro
Anticuerpo de histona H3K27acMotivo activo39133Anti-H3K27ac
Anticuerpo de histona H3K27me3Motivo activo39155Anti-H3K27me3
IgG de suero de conejoMillipore SigmaI5006-10MGControl IgG Nanopolvo
magnético de óxido de hierro (II,III), tamaño medio de la pieza de 30 nm (TEM), éster NHS funcionalizadoMilliporeSigma747467-1GPolvo de óxido de hierro funcionalizado con éster NHS de 30 nm
K-562Colección de cultivos tipo americano (ATCC)Células CCL-243
Acrilamida lineal (5 mg/mL)Thermo FisherAM9520Acrilamida lineal
LUNA-FL Contador de células de fluorescencia dualLogosBiosystems L20001Contador
de células LUNA Portaobjetos de recuento de células, 50 portaobjetos LogosBiosystemsL12001Contador de células
Aceite mineral, BioReactivo, para biología molecular, aceite ligeroMilliporeSigmaM5904-500MLAceite mineral
N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiamina para biología molecularMilliporeSigmaT7024-100MLN,N,N′,N′-Tetrametiletilendiamina
NaCl (5 M), sin RNasaThermo FisherAM9760G5M NaCl
NanoDrop LiteThermo Fisher2516  espectrofotómetro de microvolumen
NEST 2 mL Placa de pocillos profundos de 96 pocillos,OpentronsN/A2 mL de pocillo profundo Placa de 96
pocillos sin faldón Placa de PCR de 96 pocillosGenesee Scientific27-405Placa de PCR de 96 pocillos
NuSive GTG AgaroseLonza50081
Acrilamida OmniPur de Agarose: Bis-acrilamida 19:1, solución al 40%MilliporeSigma1300-500ML40%Acrilamida/Bis-acrilamida
Robot de laboratorio OT-2OpentronsOT2Robot automatizado de manipulación de líquidos
Paraformaldehído, grado EM, purificado, solución acuosa al 20%Microscopía electrónica Ciencias 1571320% Pararmadrenehído
PBS (10x), pH 7.4Thermo Fisher7001104410x PBS
PIPETMAN Classic P1000Pipeta GILSONF123602A P1000
Tubos LoBind de proteínas, 1,5 mLEppendorf9250000901,5 mL Tubo de baja unión a proteínas
QIAgen Kit de extracción de gelQiagen28706A P1000 pipeta
Quant-iT PicoGreen dsDNA AssayThermo FisherP11495  Colorante intercalador específico de dsDNA
Kit de ligadura rápidaNew England BioLabsM2200LT4 ADN ligasa (NEB)
RNaseOUT Inhibidor recombinante de la ribonucleasaThermo Fisher10777019Inhibidor de la ARNasa
S-4FB Reticulante (soluble en DMF)Laboratorios de vectoresS-1004-105Succinimidyl 4-formilbenzoato (S-4FB)
S-HyNicLaboratorios de vectoresS-1002-105Succinimidyl 6-hidrazinonicotinato acetona hidrazona (S-HyNic)
Acetato de sodio, 3 M, pH 5.2, grado de biología molecularMilliporeSigma567422-100ML3M acetato de sodio (pH 5.2)
Bicarbonato de sodio, 1M tampón soln., pH 8.5Alfa AesarJ604081M tampón de bicarbonato de sodio, pH 8.5
Fosfato de sodio dibásico para biología molecularMilliporeSigmaS3264-250GNa2HPO4
Fosfato de sodio monobásico para biología molecularMilliporeSigmaS3139-250GNaH2PO4
SuperScript IV transcriptasa inversaThermo Fisher18090050Transcriptasa inversa
SYBR Gold Tinción de gel de ácido nucleico (concentrado 10,000x en DMSO)Thermo FisherS11494Un colorante intercalador para ADN
T4 Tampón de reacción de ADN ligasaNew England BioLabsB0202S10x Tampón de reacción de ADN ligasa T4
Paquete de tampón de reacción ThermoPolEngland BioLabsB9004S10x tampón TPM-T (Tris-HCl/Cloruro de potasio/Sulfato de magnesio/Triton X-100)
Reactivo TRIzol LSThermo Fisher10296-028Extracción de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio
Kit de preparación de la biblioteca de ADN TruSeq NanoIllumina20015965 Un kit de preparación de la biblioteca de ADN (consulte también las instrucciones del fabricante)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005Integrated DNA TechnologiesN/A, consulte la Tabla 3Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002Integrated DNA TechnologiesN/A, consulte la Tabla 3Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos
Oligo de ADN Ultramer, Anti-H3K27me3_Ab#003 Tecnologías deADN IntegradasN/A, ver Tabla 3Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004Integrated DNA TechnologiesN/A, ver Tabla 3Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006Integrated DNA TechnologiesN/A, ver Tabla 3Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos
Oligonucleótidos de ADN ultramero, control IgG_Ab#001Tecnologías integradas de ADNN/A, ver Tabla 3Una sonda de ADN modificada con aminas para el control IgG
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher155750200,5M EDTA, pH 8,0
Agua destilada UltraPure DNasa/sin RNasaThermo Fisher10977023Agua ultrapura
Zeba Splin Columnas de desalinización, 7K MWCO, 0,5 mLThermo Fisher89882Columna de desalinización
vectoriales al de fondo en V New

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