Summary
ここでは、動物組織中の非ヘム鉄含有量を測定するためのプロトコルが、ほとんどの実験室で容易に実施できる単純で十分に確立された比色アッセイを使用して提供される。
Abstract
鉄は必須の微量栄養素です。鉄の過負荷と欠乏の両方がヒトにとって非常に有害であり、組織の鉄レベルは細かく調節されている。鉄過負荷または欠乏症の実験動物モデルの使用は、鉄恒常性の全身および細胞調節に関与するメカニズムの知識を進歩させるのに役立ってきた。動物組織における総鉄レベルの測定は、一般に、原子吸光分光法または非ヘム鉄とバソフェナントロリン試薬との反応に基づく比色アッセイを用いて行われる。長年にわたり、比色アッセイは、広範囲の動物組織における非ヘム鉄含有量の測定に使用されてきた。原子吸光分光法とは異なり、赤血球に含まれるヘモグロビンに由来するヘム鉄の寄与を除外する。さらに、高度な分析スキルや高価な機器を必要としないため、ほとんどのラボで簡単に実装できます。最後に、比色アッセイはキュベットベースにすることも、マイクロプレート形式に適合させることもできるため、サンプルスループットが向上します。本研究は、鉄過負荷または鉄欠乏症の様々な実験動物モデルにおける組織鉄レベルの変化の検出に適した十分に確立されたプロトコールを提供する。
Introduction
鉄は必須微量栄養素であり、酸素輸送、エネルギー生産、DNA合成などの重要な生物学的プロセスに関与するタンパク質の機能に必要です。重要なことに、鉄の過剰と鉄欠乏の両方が人間の健康に非常に有害であり、組織の鉄レベルは細かく調節されています。異常な食事による鉄吸収、鉄欠乏食、反復輸血、慢性炎症は、世界中の何十億人もの人々に影響を与える鉄関連疾患の一般的な原因です1,2,3。
鉄の過負荷または欠乏症の実験動物モデルは、鉄の恒常性の全身および細胞調節に関与するメカニズムに関する我々の知識を進歩させるのに役立ってきた4。過去20年間に達成された実質的な進歩にもかかわらず、多くの重要な側面は依然としてとらえどころのないままです。今後数年間で、動物組織中の総鉄濃度の正確な測定は、鉄生物学分野の研究を進めるための重要なステップであり続けるでしょう。
ほとんどの研究室では、原子吸光分析法(AAS)、誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)、または非ヘム鉄とバソフェナントロリン試薬との反応に基づく比色アッセイのいずれかを使用して組織鉄を定量しています。後者は、50年以上前にトーランスとボスウェルによって記述された元の方法に基づいています5,6。この方法の変形は、その後、バソフェナントロリン7の代替としてフェロジンを使用して開発されたが、後者は文献の中で最も広く引用された発色試薬のままである。
選択方法は、多くの場合、利用可能な専門知識とインフラストラクチャによって異なります。AASおよびICP-MSはより感度が高いが、比色アッセイは、以下の重要な利点を提示するため、広く使用されている:i)赤血球に含まれるヘモグロビンに由来するヘム鉄の寄与を除外する。ii)高度な分析スキルや非常に高価な機器を必要としない。iii)元のキュベットベースのアッセイをマイクロプレート形式に適合させることができ、より高いサンプルスループットを可能にする。この研究で提示された比色法は、げっ歯類から魚やショウジョウバエまで、鉄過負荷または鉄欠乏症の様々な実験動物モデルにおける組織非ヘム鉄レベルの変化を定量化するために日常的に使用されている。ここでは、動物組織中の非ヘム鉄含有量を測定するためのプロトコルが、ほとんどの研究室が実装しやすいと感じるべき、シンプルで十分に確立された比色アッセイを使用して提供されています。
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Protocol
C57BL/6マウスは商業的に購入され、C57BL/6バックグラウンド8のヘプシジンヌル(Hamp1−/−)マウスはソフィー・ヴォーロン(フランス、コーチン研究所)からの親切な贈り物でした。動物は、特定の病原体のない条件下で、温度および光制御された環境下、標準的なげっ歯類のチャウおよび水への自由なアクセスで、i3S動物施設で飼育された。ヨーロッパのスズキ(Dicentrarchus labrax)は、商業養魚場から購入され、ICBAS動物施設で温度と光が制御された環境で飼育され、標準的なスズキ飼料を毎日自由に摂取しました。脊椎動物を含むすべての手順は、i3S動物倫理委員会と国家当局であるDireção-Geral de Alimentação e Veterinária(DGAV)によって承認されました。市販の試薬、機器、および動物に関する情報は、材料表に記載されています。
1. 溶液調製
メモ:すべての試薬と溶液を鉄を含まないガラス製品または使い捨てプラスチック製品で取り扱い、準備してください。金属実験材料(ステンレス製のヘラなど)は、鉄汚染の危険性があるため、試薬や溶液と接触させないでください。再利用可能なガラス製品に鉄がないことを確認してください。材料を適切な実験室用洗剤で30〜60分間洗浄し、脱イオン水ですすぎ、脱イオン水で1:3に希釈した37%硝酸溶液に一晩浸し、脱イオン水で再度すすぎ、乾燥させる。
- 酸混合物:ガラス瓶の37%塩酸82.2mLにトリクロロ酢酸10gを加え、十分に溶解し、脱イオン水で最終体積を100mLに調整する。使用前に振ってください。あるいは、組織消化のために37%塩酸のみを使用してください。
注:この溶液は、暗褐色のガラス試薬ボトルに保管した場合、少なくとも2ヶ月間安定しています。
警告: 塩酸およびトリクロロ酢酸は腐食性であり、濃縮された形態は有毒な酸性蒸気を放出します。酸を取り扱うときは、常に保護服、耐薬品性手袋、化学薬品飛沫ゴーグルを着用してください。それらを吸い込まないようにし、ヒュームフードの下で常に酸を処理してください。 - 飽和酢酸ナトリウム:ガラス瓶の脱イオン水400mLに無水酢酸ナトリウム228gを加え、室温で一晩撹拌する。溶液を休ませて1日沈殿させる。沈殿が起こらない場合は、少量の酢酸ナトリウムを加え続けます。溶液をガラス瓶に保管する。
- 色原体試薬:1mLの色原体試薬を調製するために、500μLのイオン交換水および10μLの濃縮(100%)チオグリコール酸に1mgの4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリンジスルホン酸二ナトリウム塩を加え、十分に溶解する。脱イオン水で最終容量を1mLにします。
注:色原体試薬は必要なだけ準備してください。この溶液は、光から保護されると1ヶ月間安定しています。 - 作業色原体試薬(WCR):5倍量の飽和酢酸ナトリウムおよび5倍量の脱イオン水に1倍量の色原体試薬を加える。
注:この溶液は、使用日に新しく調製する必要があります。 - ストック鉄標準溶液:20 mMストック鉄溶液を調製するには、5,480 μLの37%塩酸を含む250 mLメスフラスコに111.5 mgのカルボニル鉄粉を入れます。室温で一晩溶解させる(または沸騰水浴中でインキュベートする)。次いで、脱イオン水で溶液を最終容量100mLにする。
注:標準ソリューションは、密閉された容器に保管すると無期限に保管できます。 - 作業鉄標準液(WISS):500 μLの脱イオン水に13.5 μLの37%塩酸を加えます。10 μLのストック鉄標準溶液を加え、脱イオン水(11.169 μgのFe/mL、200 μM、AASで測定)で最終容量を1 mLにします。
注:作業溶液は、使用日に新しく準備する必要があります。
2. サンプル乾燥
- メスの刃で10〜100mgの重さの組織のサンプルを切断する。パラフィルムの小さな部分(フレッシュウェイト)の上に分析的/精密なバランスで正確に計量してください。
- プラスチックピンセットを使用して、組織片を24ウェルプレート(水分蒸発を可能にするために蓋を外した状態)に入れ、65°Cの標準インキュベーター上で48時間乾燥させます。
- あるいは、組織サンプルを乾燥させるために実験室用電子レンジ消化オーブンを使用する。プラスチックピンセットを使用して、計量したティッシュ片を鉄を含まないテフロンカップに入れ、電子レンジで乾燥させます。機器の取扱説明書に従って動作パラメータを設定します。
注:参考として、特定の消化オーブン( 材料表を参照)を使用して肝臓サンプルを乾燥させるための運転パラメータを 表1に示す。 - プラスチックピンセットを使用して、乾燥した各組織片を分析/精密天秤内のパラフィルムの小さな部分の上に置き、正確に計量します(乾燥重量)。
3. サンプル酸性消化
- プラスチックピンセットを使用して、各乾燥組織片を1.5mLの微量遠心チューブに移す。
- 1mLの酸混合物を加え、微量遠心管を閉じる。組織を省略する以外は同じ方法で酸ブランクを作製する。
警告: 酸混合物は腐食性があり、有毒な蒸気を放出します。酸混合物を取り扱うときは、保護服、耐薬品性手袋、化学薬品飛沫ゴーグルを着用してください。それを吸い込まないようにし、煙のフードの下で常にそれを処理してください。 - 微量遠心チューブをインキュベーター内で65°Cで20時間インキュベートすることによって組織を消化する。
- 室温まで冷却した後、プラスチックチップを取り付けたマイクロピペットを使用して、透明(黄色)酸抽出物(上清)500 μLを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。透明な上清を得ることができない場合は、短い遠心分離スピンを行う。
警告: 上清は酸性度が高いです。上清を取り扱うときは、保護服、耐薬品性手袋、化学薬品飛沫ゴーグルを着用してください。常にヒュームフードの下でそれらを処理してください。
注:この時点で、酸抽出物は、比色アッセイに直ちに使用することも、後で使用するために-20°Cで凍結することもできます。凍結したサンプルを室温まで完全に解凍し、使用前に渦巻きます。
4. 発色
- 表 2 に示すように、1.5 mL マイクロ遠心チューブで色原体反応を調製するか、より高いスループットのために、平底の 96 ウェルの透明な未処理ポリスチレンマイクロプレートに直接準備します。すべての反応(酸ブランク、標準、およびサンプル)を少なくとも重複して調製する。
- 室温で15分間インキュベートする。
5. 吸光度読み取り
- サンプルの吸光度を分光光度計またはプレートリーダーで、脱イオン水基準に対して波長535nmで測定します。プレートは、蓋を開けて読み取ることも、ふたをして読むこともできます。蓋付きのケースでは、吸光度測定値との干渉を避けるために、測定の直前に蓋から酸蒸気が放出されたために発生した結露をすべて取り除きます。
注:脱イオン水(基準)に対して読み取られた酸ブランクの光学吸光度は0.015未満でなければなりません。標準およびサンプルの光学吸光度は、0.100〜1.000の間でなければなりません。鉄含有量が非常に高いまたは非常に低いサンプルの場合、酸抽出物(上清)およびdiH2Oの体積を調整する必要があるかもしれません(表2):吸光度が1.0より大きい場合は、より少ないサンプル(上清)容量を使用してください。吸光度が0.1より低い場合は、より多くの量の上清を使用してください。サンプル量(Vsmp)は、各サンプルの組織鉄含有量を計算する際に考慮されます(ステップ6を参照)。
6. 組織鉄含有量の計算
- 非ヘム組織鉄含有量を次の式で計算します。
組織鉄(μg/g乾燥組織)=
AT = 被験試料の吸光度
AB = 酸ブランクの吸光度
AS = 標準時の吸光度
Fes = WISS の鉄濃度 (μg Fe/mL)
W = 乾燥組織の重量(g)
Vsmp=サンプル容量(表2の上清の可変容量をmLに換算)
Vf = 65°Cで一晩インキュベートした後の酸混合物の最終体積(酸体積+乾燥組織体積(mL単位)に相当;サンプル重量が有意に異ならない場合は、1mL≈一定体積と仮定する)
Vstd=鉄標準容量(表2のWISSの体積をmLに換算)
Vrv=最終反応量(表2中の全体積をmLに換算)
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Representative Results
キュベットと96ウェルマイクロプレートの比較
トーランスおよびBothwell5,6によって最初に記載されたバソフェナントロリン試薬との反応による組織非ヘム鉄の測定は、吸光度読み取りのための分光光度計の使用に依存している。したがって、色原体反応に使用される体積は、通常の分光光度計キュベットのサイズと互換性があります。本研究は、マイクロプレートリーダーでの吸光度測定のために、色原体反応を96ウェルマイクロプレート中で直接調製し、より少ない試薬量を必要とし、より高いスループットを可能にする方法適応を記載する。
両方のアプローチの感度を比較するために、最初に作動鉄標準溶液(WISS)の段階希釈液を調製し、表2に示すように、色原体反応を1.5mLチューブまたは96ウェルプレートのいずれかで組み立てた。吸光度は、分光光度計(キュベット付き)またはマイクロプレートリーダーでそれぞれ測定した。2つのアプローチで生成された代表的な標準曲線を図1Aに示します。どちらの場合も、直線性は試験した鉄濃度全体で非常に高い(マイクロプレートおよびキュベットでそれぞれr2 = 0.9996およびr2 = 0.9997)。
注目すべきは、11.169μgのFe/mLを含むWISSが使用されたことである。現在のデータは、より低い鉄濃度が標準物質を調製するために使用され得ることを示している。ただし、鉄濃度の高いWISSを使用すると、吸光度値が分光光度計の線形ダイナミックレンジを超えて検出され、標準曲線がプラトーになる可能性があるため、推奨されません。
キュベットおよびマイクロプレートベースのアッセイをさらに比較するために、非ヘム鉄含有量を、合計55匹のマウス組織サンプル(肝臓、脾臓、心臓、肺、骨髄)において測定した。2つの方法論の間に非常に高い相関関係が観察され(r = 0.999、p<0.0001)、マイクロプレートベースの方法が元のキュベットベースの方法の有効な代替法であることを示している(図1B)。
最後に、マウス組織における非ヘム鉄レベルを、塩酸およびトリクロロ酢酸の混合物(元の方法の説明に従って)または塩酸のみのいずれかを用いて同じ組織に由来する試料を酸性消化した後、マイクロプレートベースの方法で定量した。非常に高い相関が観察され(r=0.999、p<0.0001、 図1C)、トリクロロ酢酸が酸消化から省略できることを示している。
以下に含まれる代表的な結果は、96ウェルプレートでサンプル吸光度を測定することによって得られた。
遺伝的ヘモクロマトーシスのマウスモデルにおける組織非ヘム鉄レベルの測定
バソフェナントロリンベースの比色アッセイを用いて、一般的に使用されるマウス株C57BL/6およびヘプシジンノックアウト(Hamp1-/-)マウス(C57BL/6遺伝的背景)の様々な組織(肝臓、脾臓、心臓、および膵臓)における非ヘム鉄含有量を決定した。代表的な鉄レベルを 図2に示します。ヘプシジンは鉄代謝の重要な調節因子であり、その破壊はヘモクロマトーシス様の鉄沈着表現型をもたらし、重度の肝臓、膵臓、心臓の鉄蓄積、および脾臓鉄の枯渇をもたらす8。
実験的鉄変調後のスズキ肝臓における非ヘム鉄レベルの測定
バソフェナントロリンベースの比色アッセイを用いて、健康な肝臓(対照)、鉄処理(腹腔内経路 を介して 投与された2mgの鉄デキストラン)および貧血(尾血管から採取された血液の2%v/w)のヨーロッパのスズキ(Dicentrarchus labrax)の肝臓における非ヘム鉄レベルを決定した。予想通り、肝鉄レベルは鉄処理動物で大幅に増加したが、貧血は肝臓鉄貯蔵の軽度の減少を引き起こした(図3)。
ショウジョウバエメラノガスター全体の非ヘム鉄レベルの測定
現在の方法は、個々の ショウジョウバエ の体重が小さいため(平均体重は雄と雌でそれぞれ0.6mgと0.8mgである)9、個々のショウジョウバエの非ヘム鉄レベルを測定するのには適切ではありませんが、プールされたハエでうまく使用できます。 図4 は、野生型オレゴン-Rまたはマルボリオ(Mvl)ノックアウトのいずれかの20匹のオスハエのグループに対する代表的な非ヘム鉄レベルを示しています。Mvlは哺乳類SLC11A2遺伝子のホモログであり、2価金属トランスポーター1(DMT1)と呼ばれるタンパク質をコードするもので、その遺伝的破壊は鉄欠乏症につながります10。予想通り、Mlvハエは野生型と比較して非ヘム鉄含有量が実質的に低い体を示した。
| 電力650W(%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| 圧力 (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 時間(分): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| 加圧時間(タップ): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 扇： | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
表1:ここで使用した電子レンジ消化オーブンでの肝臓乾燥のための動作パラメータ。
| WCR (μL) | 酸混合物(μL) | 上清(μL) | ウィス (μL) | ジH2O (μL) | 総容量(μL) | ||
| 1.5 mL チューブ | アシッドブランク | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| 標準 | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| 見本 | 1000 | 変数 | 変数 | 1300 | |||
| 96穴マイクロプレート | アシッドブランク | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| 標準 | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| 見本 | 150 | 変数 | 変数 | 195 |
表2:1.5mLチューブまたは96ウェルプレートのいずれかにおける色原体反応の調製。
図1:キュベットまたは96ウェルマイクロプレートベースの比色アッセイによる非ヘム鉄の測定。 (A)マイクロプレートベース(白四角
)アッセイおよびキュベットベース(開三角形Δ)アッセイの標準曲線。(B)肝臓(実線の円)、脾臓(白
丸)、心臓(実線の
三角形)、肺(アスタリスク
)、および骨髄(ダイヤモンド
)を含む、生後6ヶ月の雄性C57BL/6マウスからの55の
組織サンプルにおけるキュベットベースおよびマイクロプレートベースの非ヘム鉄レベル間の相関。(c)生後6ヶ月齢の雄マウス由来の組織のサブセットにおける非ヘム鉄レベル(肝臓、実丸;脾臓、白丸)を、塩酸とトリクロロ酢酸(HCl+C2HCl3O2)または塩酸単独(HCl)の混合物によるサンプルの酸性消化後に96ウェルマイクロプレートベースのアッセイで測定する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:バソフェナントロリンベースの比色アッセイによって様々な組織において決定された非ヘム鉄含有量。 C57BL/6遺伝的背景(白四角)上の雄C57BL/6野生型マウス(白丸)および雄性ヘプシジン欠損Hamp1-/-マウスの肝臓、脾臓、心臓、および膵臓における非ヘム鉄レベルを、8週齢で、バソフェナントロリンベースの比色アッセイで測定した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:実験的鉄変調後の幼い雌のヨーロッパスズキにおける肝臓非ヘム鉄レベル。 鉄過負荷は、2mgの鉄デキストランの腹腔内投与によって達成されたが、貧血は尾血管からの血液の2%v/wの離脱によって誘発された。肝臓は、鉄処理または採血後4日目に採取した。対照動物は健康で未処理のスズキであった。非ヘム鉄レベルは、バソフェナントロリンベースの比色アッセイで測定した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:1ヶ月齢 のショウジョウバエにおける非ヘム鉄レベルを、バソフェナントロリンベースの比色アッセイで測定する。 結果は、(A)20匹のハエの各プールにおける非ヘム鉄含有量、または(B)0.64mg/フライの平均重量を考慮した個々のハエの推定鉄含有量を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
動物組織中の非ヘム鉄含有量の測定のためのプロトコルが、トーランスおよびBothwell5,6によって最初に記載されたバソフェナントロリンベースの比色アッセイの適応を用いて提供される。この方法の重要なステップは、組織サンプルの乾燥である。酸加水分解によるタンパク質変性および無機鉄の放出;還元剤チオグリコール酸の存在下での第二鉄(Fe3+)鉄の第一鉄状態(Fe2+)への還元、およびバソフェナントロリン試薬との反応(色原体反応);得られた鉄イオン/バソフェナントロリンピンク複合体の吸光度読み取り;組織鉄含有量の計算。
本研究は、アッセイ感度を損なうことなく、元のキュベットベースのプロトコルを96ウェルベースのフォーマットに適合させて、より高いスループットを実現する方法を示しています。特に、この適応は、1)マルチチャンネルピペットを使用して96ウェルプレートでより多くの色原体反応を同時に調製することができるため、大幅な時間の節約を可能にします。2)吸光度測定値は、分光光度計を使用する場合よりもプレートリーダーで劇的に高速です。マイクロプレートベースのアッセイの別の重要な利点は、色原体反応量の調整であり、これは試薬(特にバソフェナントロリン試薬)によるコストを実質的に低減する。プロトコル全体は4日で完了することができます。サンプル乾燥(65°Cのオーブンで行うと最大48時間かかることがあります)と酸性消化(20時間一晩行うのが便利)は、最も時間のかかる2つのステップです。サンプル乾燥は、幅広い材料の消化、溶解、加水分解、または乾燥における実験室使用のために設計された電子レンジ消化オーブンを使用して加速することができます。ほとんどの組織サンプルを2.5時間未満で乾燥させることができるため、わずか2日でプロトコル全体を実行できます。しかし、電子レンジの容量は収まるテフロン(登録商標)カップの数に制限されており、また、使用するたびにカップを洗浄および除染する必要があるため、多数のサンプルを取り扱う場合は、65°Cで24ウェルプレートでサンプルを乾燥させる方が便利であることがわかります。組織を乾燥させるのに必要な時間は、65°Cを超える温度を使用することによって依然として短縮され得る。ただし、プラスチック材料は溶融の危険性があるため避ける必要があります。
以前、Grundy et al.11 は、サンプル乾燥工程を含まずに、アッセイ全体を96ウェルプレートで実施する方法の適応を開発していた。しかし、乾燥重量の代わりに湿重量を使用して組織中の金属を測定することは、新鮮な組織サンプルと凍結組織サンプルの両方での風乾による重量減少の変動量によって大きく影響を受けます12。したがって、組織の乾燥重量に対して鉄含有量を正常化することが推奨される。組織乾燥が実行可能な選択肢でない場合(例えば、脂肪組織)、新鮮な重量の正確な決定が貯蔵アーチファクトによって有意に影響されないように、アッセイはサンプル収集時に迅速に行われることが推奨される。
酸溶液の組成も取り組んだ。元のプロトコル5,6に従って、組織は塩酸とトリクロロ酢酸からなる酸混合物で消化される。しかし、今回の研究は、少なくとも肝臓および脾臓サンプルを消化するために、37%塩酸単独でも同様に効率的であることを実証する。
原鉄標準液は、安価で高純度の鉄粉であるカルボニル鉄粉を用いて調製される。本明細書に記載のアプローチに従って、1.1169mgのFe/mL(20mM)を含むストック鉄標準溶液を調製し、その後AASによって決定した。鉄の他の供給源(例えば、硫酸鉄、ニトリロ三酢酸鉄)または市販の標準溶液を使用して、ストック鉄標準溶液を生成することができ、ただし、実際の鉄濃度が決定され、アッセイの直線性は、標準曲線を実行することによって確認される。
現在の方法を用いて、種々の動物組織の非ヘム鉄含有量を測定することに成功した。げっ歯類組織(肝臓、脾臓、心臓、および膵臓)、スズキ肝臓、およびショウジョウバエ全体を用いて得られた代表的な結果が含まれる。この方法は、洗練された分析ツールや高価なインフラストラクチャを必要としないため、ほとんどのラボで簡単に実装できます。要約すると、本明細書に記載の方法は、鉄過負荷または欠乏症の実験動物モデルを用いた鉄恒常性および鉄関連障害の研究において広く適用することができる。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、プロジェクトUIDB/04293/2020の下で、FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.を通じて国家基金によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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