Summary
DNA-gardin, en high-throughput enkeltmolekylær bildebehandlingsteknikk, gir en plattform for sanntidsvisualisering av ulike protein-DNA-interaksjoner. Den nåværende protokollen benytter DNA-gardinteknikken for å undersøke den biologiske rollen og molekylære mekanismen til Abo1, en Schizosaccharomyces pombe bromdomene som inneholder AAA + ATPase.
Abstract
Kromatin er en høyere ordens struktur som pakker eukaryot DNA. Kromatin gjennomgår dynamiske endringer i henhold til cellesyklusfasen og som respons på miljøstimuli. Disse endringene er avgjørende for genomisk integritet, epigenetisk regulering og DNA-metabolske reaksjoner som replikasjon, transkripsjon og reparasjon. Kromatinmontering er avgjørende for kromatindynamikk og katalyseres av histonchaperoner. Til tross for omfattende studier er mekanismene som histonchaperoner muliggjør kromatinmontering fortsatt unnvikende. Videre er de globale egenskapene til nukleosomer organisert av histonchaperoner dårlig forstått. For å løse disse problemene beskriver dette arbeidet en unik enkeltmolekylavbildningsteknikk kalt DNA-gardin, noe som letter undersøkelsen av molekylære detaljer om nukleosommontering av histonchaperoner. DNA-gardin er en hybridteknikk som kombinerer lipidfluiditet, mikrofluidikk og total intern refleksjonsfluorescensmikroskopi (TIRFM) for å gi en universell plattform for sanntidsavbildning av forskjellige protein-DNA-interaksjoner. Ved hjelp av DNA-gardin undersøkes histonchaperonfunksjonen til Abo1, Schizosaccharomyces pombe bromdomeneholdig AAA + ATPase, og den molekylære mekanismen som ligger til grunn for histonmontering av Abo1 avsløres. DNA-gardin gir en unik tilnærming for å studere kromatindynamikk.
Introduction
Eukaryot DNA er pakket inn i en høyere ordens struktur kjent som kromatin 1,2. Nukleosom er den grunnleggende enheten av kromatin, som består av ca. 147 bp DNA pakket rundt de oktameriske kjernehistonene 3,4. Kromatin spiller en kritisk rolle i eukaryote celler; For eksempel beskytter den kompakte strukturen DNA mot endogene faktorer og eksogene trusler5. Kromatinstrukturen endres dynamisk i henhold til cellesyklusfasen og miljøstimuli, og disse endringene kontrollerer proteintilgang under DNA-transaksjoner som replikasjon, transkripsjon og reparasjon6. Kromatindynamikk er også viktig for genomisk stabilitet og epigenetisk informasjon.
Kromatin reguleres dynamisk av ulike faktorer, inkludert histonhalemodifikasjoner og kromatinarrangører som kromatinremodellerere, polykamgruppeproteiner og histonchaperoner7. Histonchaperoner koordinerer montering og demontering av nukleosomer via avsetning eller løsrivelse av kjernehistoner 8,9. Defekter i histonchaperoner induserer genomstabilitet og forårsaker utviklingsforstyrrelser og kreft 9,10. Ulike histonchaperoner trenger ikke kjemisk energiforbruk som ATP-hydrolyse for å montere eller demontere nukleosomer 9,11,12,13. Nylig rapporterte forskere at bromdomeneholdige AAA + (ATPase assosiert med ulike cellulære aktiviteter) ATPaser spiller en rolle i kromatindynamikk som histonchaperoner 14,15,16,17. Human ATAD2 (ATPase-familien AAA-domeneholdig protein 2) fremmer kromatintilgjengelighet for å forbedre genuttrykk18. Som transkripsjonell medregulator regulerer ATAD2 kromatinet av onkogene transkripsjonsfaktorer14, og overekspresjonen av ATAD2 er relatert til dårlig prognose ved mange typer kreft19. Yta7, Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) homolog av ATAD2, reduserer nukleosomtettheten i kromatin15. I motsetning til dette øker Abo1, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homolog av ATAD2, nukleosomtettheten16. Ved hjelp av en unik enkeltmolekylær avbildningsteknikk, DNA-gardin, om Abo1 bidrar til nukleosommontering eller demontering, er adressert17,20.
Tradisjonelt har de biokjemiske egenskapene til biomolekyler blitt undersøkt ved bulkeksperimenter som elektroforetisk mobilitetsskiftanalyse (EMSA) eller co-immunoprecipitation (co-IP), hvor et stort antall molekyler undersøkes, og deres gjennomsnittlige egenskaper karakteriseres21,22. I bulkeksperimenter blir molekylære subtilstander tilslørt av ensemble-gjennomsnittseffekten, og probing biomolekylære interaksjoner er begrenset. I motsetning til dette omgår enkeltmolekylteknikker begrensningene i bulkeksperimenter og muliggjør detaljert karakterisering av biomolekylære interaksjoner. Spesielt har enkeltmolekylære bildebehandlingsteknikker blitt mye brukt til å studere DNA-protein og protein-protein-interaksjoner23. En slik teknikk er DNA-gardin, en unik enkeltmolekylær avbildningsteknikk basert på mikrofluidikk og total intern refleksjonsfluorescensmikroskopi (TIRFM)24,25. I et DNA-gardin er hundrevis av individuelle DNA-molekyler forankret til lipid-dobbeltlaget, noe som tillater todimensjonal bevegelse av DNA-molekyler på grunn av lipidfluiditet. Når hydrodynamisk strømning påføres, beveger DNA-molekyler seg langs strømmen på dobbeltlaget og sitter fast ved en diffusjonsbarriere, hvor de justeres og strekkes. Mens DNA er farget med interkaleringsmidler, injiseres fluorescerende merkede proteiner, og TIRFM brukes til å visualisere protein-DNA-interaksjoner i sanntid på et enkeltmolekylnivå23. DNA-gardinplattformen letter observasjonen av proteinbevegelser som diffusjon, translokasjon og kollisjon 26,27,28. Videre kan DNA-gardin brukes til proteinkartlegging på DNA med definerte posisjoner, orienteringer og topologier eller brukes til studiet av faseseparasjon av protein og nukleinsyrer 29,30,31.
I dette arbeidet brukes DNA-gardinteknikken til å gi bevis for funksjonen til chaperoner gjennom direkte visualisering av spesifikke proteiner. Videre, fordi DNA-gardin er en plattform med høy gjennomstrømning, letter den en grad av datainnsamling som er tilstrekkelig for statistisk pålitelighet. Her er det beskrevet hvordan man utfører DNA-gardinanalysen i detalj for å undersøke den molekylære rollen til S. pombe bromdomeneholdig AAA + ATPase Abo1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av strømningscellen
- Forbered et renset smeltet silikaglass som inneholder nano-grøftmønstre etter tidligere publisert rapport25.
- Bor to hull med en diameter på 1 mm i et renset, smeltet silikaglass (figur 1A) ved hjelp av et diamantbelagt bor (se materialfortegnelse).
- Sett 250 nm tykk aluminium (Al) på lysbildet ved hjelp av DC sputter32 (se materialfortegnelse) med 10 mTorr argongass.
- Spinnbelegg et 310 nm tykt lag med 4% 950K poly (metylmetakrylat) (PMMA) (se materialfortegnelse) ved 4,000 o / min i 1 min og stek på en kokeplate ved 180 ° C i 3 minutter.
- Tegn nanogrøftmønstrene på PMMA-laget mellom de to hullene ved hjelp av elektronstråle (ebeam) litografi33 med 0,724 nA strøm ved 80 kV.
MERK: Arkitekturen og dimensjonene til nano-grøftmønstrene er vist i figur 1A. - Fjern den ebeam-eksponerte PMMA ved å bløtlegge lysbildene i utviklingsløsningen (1: 3-forhold mellom metylisobutylketon og isopropanol, se materialtabell) i 2 minutter.
- Etse Al-lag med induktivt koblet plasmareaktiv ionetsing (ICP-RIE) ved bruk av klor (Cl2) og bortriklorid (BCl3) gasser.
MERK: Disse to gassene kan fjerne Al fra ebeam-eksponerte områder. - Skjær nano-grøfter på lysbildene ved hjelp av svoveltetrafluorid (SF4), tetrafluormetan (CF4) og oksygen (O2) gasser (se materialtabell).
- Fjern det gjenværende Al-laget ved å bløtlegge lysbildene i Al etchant (AZ 300 MIF-utvikler, se Materialfortegnelse) i 10 minutter.
- Etter fabrikasjon, skyll lysbildene med avionisert vann og sonicate i aceton i 30 minutter ved hjelp av en bad-type sonikator.
- Rengjør lysbildene i 2% Hellmanex III-oppløsning (se materialfortegnelse) i minst 1 dag med magnetisk omrøring.
- Sonikere lysbildene i aceton i 30 min og 1 M NaOH i 30 min suksessivt.
- Skyll lysbildene med avionisert vann og tørk med en nitrogen (N2) gass.
- Legg et rent papir (5 mm x 35 mm) på midten av dobbeltsidig tape. Fest tapen over lysbildet for å dekke de to hullene og nanomønstrene med papiret.
- Skjær papiret med et rent blad (figur 1A).
- Sett et glassdeksel på toppen av dobbeltsidig tape og gni dekselet med en pipettespiss for å danne et mikrofluidisk kammer (figur 1A).
- Plasser den sammensatte flytcellen mellom to lysbildene i mikroskopet, og klipp dem.
- Stek flytcellen i en vakuumovn på 120 °C i 45 minutter.
- Fest væskekontakten (Nanoport) for de chipbaserte analysene (se Materialfortegnelse) til hvert åpent hull ved hjelp av en varm limpistol og koble de to linjene med Luer-låseslange.
- Koble til en Luer låssprøyte inneholdende 3 ml avionisert vann og vask kammeret.
- Vask kammeret med 3 ml lipidbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 og 100 mM NaCl) via drop-by-drop-tilkoblingen.
MERK: Drop-by-drop-tilkobling kobler alle sprøyter til strømningscellen for å unngå å injisere luftbobler inn i kammeret. - Injiser 1 ml 0,04x biotinylert lipid i lipidbuffer i kammeret i to skudd med 5 min inkubasjon per skudd.
MERK: Fremstilling av 1x biotinylert lipidstamme er beskrevet i en tidligere publisert rapport34. - Vask kammeret med 3 ml lipidbuffer og inkuber i 20 minutter for at lipid-dobbeltlaget skal modnes på glideflaten.
- Tilsett 1 ml BSA-buffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2 og 0,2 mg/ml BSA) og inkuber i 5 minutter for å passivisere glideflaten.
MERK: Dette trinnet kan redusere den uspesifikke bindingen av proteiner til glideoverflaten. - Injiser 0,025 mg/ml streptavidin i 1 ml BSA-buffer med to skudd og 10 min inkubasjon per skudd.
- Vask ut reststreptavidin med 3 ml BSA-buffer.
- Injiser ~300 pM (30 μL) biotinylert lambdafag-DNA i 1 ml BSA-buffer i kammeret med to skudd og 10 min inkubasjon per skudd.
MERK: Fremstilling av biotinylert lambda-DNA er beskrevet i en tidligere publisert rapport34.
2. Koble flytcelle til det mikrofluidiske systemet og laste det på mikroskopet
- Forbered Abo1 bildebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1,6% glukose og 0,1x gloksy, se materialfortegnelse).
MERK: Gloxy er et oksygenrensesystem som reduserer fotobleking av fluorescerende fargestoffer. Fremstilling av 100x gloksylager med glukoseoksidase og katalase er beskrevet i referanse35. - Koble en sprøyte inneholdende 10 ml avbildningsbuffer til en sprøytepumpe og fjern bobler i alle slangene i det mikrofluidiske systemet.
- Koble den forberedte flytcellen med det mikrofluidiske systemet via drop-to-drop-tilkobling for å unngå bobleinjeksjon i strømningscellen (figur 1B).
- Monter flytcellen og flytcelleholderne og monter enheten på et spesialbygd TIRF-mikroskop (figur 1C).
FORSIKTIG: Når flytcellen settes under mikroskopet, må du stille høyden på objektivlinsen nøye. Flytcellen må ikke berøre objektivlinsen. Dette kan skade linsen. - Dropp indeksmatchende olje på midten av strømningscellen og sett et skreddersydd dueprisme (se materialfortegnelse) på oljedråpen.
3. Histonmontering av Abo1 ved hjelp av DNA-gardin
- Bland 5 nM Abo1 og 12,5 nM Cy5-merket H3-H4 histondimer (Cy5-H3-H4) (se materialfortegnelse) i 150 μL avbildningsbuffer. Alle proteiner ble fremstilt etter tidligere publisert rapport17.
- Inkuber blandingen på is i 15 minutter.
MERK: For å unngå fotobleking av Cy5, må inkubasjonen gjøres i mørket. - Injiser ~20 pM (2 μL) YOYO-1-fargestoff i bildebuffer gjennom en 100 μL prøvesløyfe for å flekke lambda DNA-molekyler.
- Kjør bildebehandlingsprogramvare (se materialfortegnelse) og slå på 488 nm laser for å sjekke om DNA-gardiner er velformede.
MERK: Hvis DNA-gardiner er velformede, vises DNA-molekylene, som er farget med YOYO-1, som justerte linjer ved en barriere i nærvær av strømning. De strukkede linjene trekker seg tilbake og diffunderer bort fra barrieren når strømmen er slått av. - Injiser 2 ml høy saltbuffer (200 mM NaCl og 40 mM MgCl2) for å eliminere YOYO-1-fargestoff fra DNA.
- Etter at YOYO-1-fargestoffet er fjernet, injiser den pre-inkuberte proteinprøven.
- Når proteinene når DNA-gardinen, slå av sprøytepumpen, slå av avstengningsventilen og inkuber 15 minutter for histonbelastning med Abo1.
- Vask ut ubundne Abo1- og histonproteiner i 5 minutter.
- Slå på avstengningsventilen og gjenoppta strømningsinjeksjonen.
- Slå på 637 nm laser og avbilde fluorescerende proteiner mens bufferstrømmen er på.
- Slå av bufferstrømmen forbigående for å kontrollere om histonproteiner er lastet på DNA (figur 2C).
- Samle DNA-gardinbilder med et bildeinnsamlingsprogram (se materialfortegnelse).
MERK: Når bufferstrømmen forbigående stopper, trekker DNA seg ut av det unnvikende feltet av total intern refleksjon, og fluorescerende merkede proteiner bundet til DNA forsvinner.
4. Dataanalyse
- Transformer bildene tatt av bildeoppkjøpsprogrammet til TIFF-format som bildesekvenser.
MERK: Alle data ble analysert ved hjelp av bilde J (NIH) som beskrevet i referansen20. - Velg et enkelt DNA-molekyl fra bildesekvensene og tegne en kymograph.
MERK: Kymografen kan vise endringen i fluorescensintensiteten til hvert histonprotein bundet til et enkelt DNA-molekyl som en funksjon av tid. - Lag fluorescens intensitet profil fra kymograph og passe den med flere Gaussian funksjoner.
- Samle senterkoordinatene til topper fra fluorescensintensitetsprofilen. I dette trinnet kan minimumsintensiteten av histonfluorescens oppnås.
- Del alle toppintensiteter samlet fra profilene med minimumsintensitet. Antallet H3-H4-dimerer bundet til DNA er estimert i dette trinnet.
- Utfør trinn 4,2-4,5 for andre DNA-molekyler.
- Lag et histogram for bindingsfordelingen av H3-H4-dimerer med 1 kbp bin-størrelse. Antall analyserte molekyler er minst 300.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette arbeidet beskriver prosedyren for klargjøring av flytceller for DNA-gardinanalysen (figur 1A). DNA-gardinanalysen gjorde det lettere å studere histon H3-H4-dimermontering på DNA av Abo1. Først ble DNA-gardindannelse kontrollert ved å farge DNA-molekyler med YOYO-1, et interkalerende fargestoff. Grønne linjer ble vist i parallelle matriser, noe som indikerer at YOYO-1 interkalerte til DNA-molekyler, som var godt justert og strukket ved en diffusjonsbarriere under hydrodynamisk strømning (figur 2A). For å utelukke muligheten for at YOYO-1 hindrer samspillet mellom DNA og histonproteiner, ble YOYO-1 fjernet fra DNA med en høy saltbuffer før tilsetning av histonproteiner. Når Cy5-H3-H4-dimerer ble injisert i DNA-gardinet i fravær av Abo1, bandt ikke Cy5-H3-H4 seg til DNA, noe som indikerer mangel på spontan binding av H3-H4-dimerer til DNA (figur 2B). Når Cy5-H3-H4 ble injisert med Abo1, ble rød fluorescerende puncta sett på DNA-molekyler, noe som tyder på at Abo1 laster H3-H4-dimerer på DNA (figur 2C). Bufferstrømmen ble forbigående slått av for å sikre at Cy5-H3-H4-dimerer ikke bandt seg til glideoverflaten under binding til DNA. Når strømmen ble slått av, forsvant fluorescerende merkede proteiner bundet til DNA fordi DNA-molekyler trakk seg ut av unnvikende felt. I motsetning til dette forblir proteiner adsorbert til overflaten det samme. De fluorescerende signalene forsvant i fravær av strømning og dukket opp igjen da strømmen ble gjenopptatt, noe som tyder på at H3-H4-dimerer binder seg til DNA (figur 2C). Bindingen av H3-H4-dimerer til DNA ble også bekreftet av kymografen, hvor fluorescenssignalene forsvant når strømmen ble slått av (figur 2D). Fordi Abo1 er en AAA + ATPase, ble effekten av ATP-hydrolyse på histonbelastningsaktivitet av Abo1 undersøkt16. Få fluorescerende puncta dukket opp i DNA-gardinet enten i fravær av nukleotid (Apo) eller i nærvær av ADP (figur 2E), noe som indikerer at H3-H4-dimerer sjelden binder seg til DNA enten i Apo-tilstand eller i nærvær av ADP. Figur 2F viser kvantitative analyser av figur 2B, C og figur 2E, som viser at antall H3-H4-dimerer bundet til DNA øker i nærvær av ATP. Resultatene tyder på at ATP-hydrolyse er avgjørende for H3-H4-belastning på DNA ved Abo1 (figur 2E, F).
Deretter ble det testet om Abo1 fortrinnsvis laster histoner til Widom 601-sekvensen, som har en ti ganger høyere bindingsaffinitet til histoner enn tilfeldige sekvenser in vitro, selv om nukleosomer ikke har noen spesifisitet for Widom 601-sekvensen in vivo 36,37,38,39,40. DNA-gardinen ble dannet med lambda-DNA som inneholder Widom 601-repetisjoner i den ene enden eller internt (figur 3A,B). Bindingslandskapet til H3-H4-dimerer på hver DNA-konstruksjon ble oppnådd (figur 3C,D). Bindingsplasseringen til Cy5-H3-H4 ble estimert fra senterposisjonen til 2D Gaussian fitting for hver fluorescerende punctum17,41. Hvis H3-H4-lasteaktiviteten til Abo1 avhenger av DNA-sekvensen, vil bindingsfordelingen være skjev mot Widom 601-sekvensen. Figur 3C,D viser bindingsfordelingshistogrammet til H3-H4-dimerer av Abo1 på lambda-DNA som inneholder Widom 601-repetisjoner på slutten (ti repetisjoner) og internt (fem repetisjoner). Det var ingen fortrinnsrett binding til flere Widom 601-repetisjoner, og bindingsfordelingen var tilfeldig, noe som tyder på at Abo1 ikke har noen preferanse for Widom 601-sekvensen, men i stedet laster H3-H4 på DNA på en sekvensuavhengig måte (figur 3C, D).
Figur 1: Klargjøring av flytcelle. (A) Skjemaer over strømningscellemontering og DNA-gardinsystem. Det mikrofluidiske kammeret kan dannes mellom et smeltet silika-lysbilde og et glassdeksel som sitter fast sammen med dobbeltsidig tape. Under den hydrodynamiske strømmen i kammeret er en stor mengde lambda DNA-molekyler justert ved en diffusjonsbarriere (en nano-grøft her) på grunn av fluiditeten til lipid-dobbeltlaget og strukket som et gardin. I det forstørrede bildet av diffusjonsbarrieren har nanogrøften sagtannmønstre med 1,5 μm stigning, 350 nm bredde og 1,4 μm dybde. (B) Fotografi av det mikrofluidiske systemet som består av en sprøytepumpe, en avstengningsventil og en 6-veis prøveinjeksjonsventil med prøvesløyfe. (C) Bilder av glideholderkomponenter (venstre), montering av holdere og flytcelle (midten), og den fullt monterte flytcellen montert på et skreddersydd TIRF-mikroskop (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Visualisering av histonbelastning med Abo1 ved bruk av enkeltmolekyl DNA-gardin. (A) Bilde av DNA-gardin, hvor DNA-molekyler farget med YOYO-1 (grønn) er godt justert ved en diffusjonsbarriere. (B) Bilder av Cy5-H3-H4 (rød) uten Abo1. (C) Bilder av Cy5-H3-H4 (rød) lastet av Abo1 i nærvær (øverst) og fravær (nederst) av bufferflyt. (D) Kymograph ekstrahert fra et enkelt DNA-molekyl fra (C). Når strømmen er forbigående slått av, forsvinner Cy5-fluorescenssignalene, noe som indikerer at Cy5-H3-H4 binder seg til DNA, men ikke til glideoverflaten. (E) Bilde av Cy5-H3-H4 lastet av Abo1 uten nukleotid (Apo) (øverst). Bilde av Cy5-H3-H4 lastet av Abo1 i nærvær av ADP (nederst). (F) Kvantifisering av Cy5-H3-H4 lastet av Abo1 i henhold til nukleotider. Feilfelt viser standardavviket i tre eksemplarer. Hvert eksperiment involverte analyse av 100-200 molekyler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sekvensuavhengig belastning av H3-H4 ved Abo1. (A) Den ene enden av lambda-DNA er forankret til biotinylert lipid via streptavidin, og den andre enden inneholder ti repetisjoner av Widom 601-sekvensen (øverst). Det andre lambda-DNA-et inneholder fem repetisjoner av Widom 601-sekvensen inne i lambda-DNA (nederst). (B) Skjematisk fremstilling av DNA-gardinanalyse med lambda-DNA som inneholder Widom 601-repetisjoner. (C,D) Bindingsfordelingshistogrammer av Cy5-H3-H4 på lambda-DNA som inneholder Widom 601 repetisjoner på slutten (C) og internt (D). Det er ingen sekvensspesifisitet for DNA når H3-H4 er satt sammen av Abo1. Feilfelt oppnås ved å starte opp42 med et konfidensintervall på 70 %. Totalt antall hendelser er 312 og 252 for henholdsvis (C) og (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som en enkeltmolekylær bildebehandlingsteknikk har DNA-gardin blitt brukt mye til å undersøke DNA-metabolske reaksjoner43. DNA-gardin er et hybridsystem som kobler sammen lipidfluiditet, mikrofluidikk og TIRFM. I motsetning til andre enkeltmolekylære teknikker, muliggjør DNA-gardin høy gjennomstrømning sanntidsvisualisering av protein-DNA-interaksjoner. Derfor er DNA-gardinteknikken egnet for å undersøke mekanismen bak molekylære interaksjoner, inkludert sekvensspesifikk forening, proteinbevegelse sammen med DNA og protein-proteinkollisjon på DNA 17,20,26. I tillegg gjør DNA-gardinens høye gjennomstrømningsnatur det mulig å samle inn nok data for å sikre statistisk pålitelighet. DNA-gardin letter undersøkelsen av de biofysisk-kjemiske egenskapene til proteiner, inkludert kinetiske parametere, diffusjonskoeffisient, hastighet og prosessivitet 17,26,27,30. Det er viktig at DNA-gardin kan brukes til å bestemme bindingslandskapet for nukleosomavsetning, noe som indikerer den inneboende sekvenspreferansen til nukleosomer30.
Flere punkter må vurderes for å oppnå data av høy kvalitet fra DNA-gardinanalysen. Først må lipid-dobbeltlaget dannes hensiktsmessig på glideflaten. Fluiditeten til lipid-dobbeltlaget tillater DNA-molekyler å bevege seg på lysbildet og justeres ved en diffusjonsbarriere i nærvær av hydrodynamisk strømning. Lipid-dobbeltlaget passiverer også overflaten av det mikrofluidiske kammeret for å forhindre uspesifikk adsorpsjon av proteiner til overflaten. Fordi passiveringen av lipid-dobbeltlaget ikke er fullført, adsorberes fluorescerende merkede proteiner ikke-spesifikt til overflaten, noe som fører til feil tolkning av resultatene. Imidlertid kan de overflatefastlåste proteinene skilles fra DNA-bundne ved å slå den forbigående strømmen av og på fordi DNA-bundne proteiner forsvinner når strømmen stopper. For det andre må fotobleking av fluoroforer undertrykkes. Mange enkeltmolekylære fluorescensavbildningsmetoder vedtar et oksygenavløpssystem for å redusere fotobleking. Flere oksygenrensesystemer er utviklet, hvorav den mest populære er gloxy. Gloxy, bestående av glukoseoksidase og katalase, reduserer enzymatisk molekylære oksygener i oppløsning, men senker pH 44,45,46. Lav pH er ikke kompatibel med fysiologiske forhold og reduserer lipidfluiditeten. For å forsinke reduksjonen i pH, (1) må bildebufferen klargjøres med avgasset avionisert vann, (2) bufferen må brukes umiddelbart, og (3) bufferen må forsegles og lagres på is til bruk.
En unik plattform ble utviklet for å forbedre DNA-gardinsystemet der utskårne nanograver fungerer som diffusjonsbarrierer i stedet for kromnanomønstre25. Siden disse nanogravene er mer robuste under tøffe rengjøringsforhold med sterke løsemidler, tillater de repeterbar, klarere bildebehandling. DNA-gardinteknikken har imidlertid flere begrensninger. Under kontinuerlig laserbelysning blir fluoroforene som merker proteiner fotobleket, noe som gjør langtidsmålinger utfordrende. DNA-gardin virker ikke ved lav pH (lavere enn ~ 6) fordi lipid-dobbeltlaget ikke er fluidisk. I tillegg forstyrrer fluorescensbakgrunnen og ikke-spesifikk binding av proteiner til glideoverflaten enkeltmolekylavbildning når proteinkonsentrasjonen er høy. En annen ulempe med DNA-gardinet er at den romlige oppløsningen til DNA-gardinet er ~ 1 kbp / piksel, slik at bevegelsen av proteiner på mindre enn 1 kbp ikke kan observeres. I tillegg bruker DNA-gardin kontinuerlig hydrodynamisk kraft til proteiner på DNA. Men kraften ved strømning er svak (mindre enn 1 pN), og derfor er det utfordrende at histoner eller nukleosomer beveger seg langs DNA i gardinen. Det ble også rapportert at nukleosomer sjelden glir langs DNA uten kromatinremodelers47. Hvis histoner eller nukleosomer glir langs DNA, vil de fleste av dem forbli i endeområdet av DNA i gardinen. Vi så imidlertid ikke den skjeve fordelingen. På den annen side, hvis histoner eller nukleosomer avrenner fra DNA-enden, vil de bli utarmet på slutten av DNA. Det observerte vi heller ikke.
Dette arbeidet demonstrerer at DNA-gardinanalysen er en enkeltmolekylær bildebehandlingsplattform som er ideell for å undersøke kromatindynamikk. DNA-gardin kan brukes til å studere prosessen der histonchaperoner som bromdomeneholdige AAA + ATPaser samler kromatin. Den biologiske funksjonen til bromdomeneholdige AAA + ATPaser er kontroversiell. Mangel på humant ATAD2 eller S. cerevisiae Yta7 nedregulerer genuttrykk via kromatinkondensasjon18. I kontrast øker S. pombe Abo1 nukleosomtettheten16. Enkeltmolekylstudiene viser at Abo1 katalyserer histon H3-H4-belastning på DNA. Det er vist at histonbelastningsaktiviteten til Abo1 er avhengig av ATP-hydrolyse (figur 2C,E,F). Videre viser bindingsfordelingen av H3-H4-dimerer at H3-H4-dimerer belastes DNA av Abo1 på en sekvensuavhengig måte (figur 3). Avslutningsvis kan DNA-gardinet brukes til å løse den biologiske rollen til Abo1 som en histon-chaperone i histonsamling. Ved hjelp av DNA-gardinteknikken vil nukleosomdannelse av Abo1 og andre histonchaperoner som CAF-1 og FACT bli studert i fremtiden.
Basert på denne protokollen kan DNA-gardinanalyse brukes til å observere kromatinomorganisering ved ombyggingskomplekser som translokerer og omorganiserer nukleosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne setter pris på den vennlige støtten til Abo1 og Cy5-H3-H4 av professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., og Juwon Jang, Ph.D., i KAIST, Sør-Korea. Dette arbeidet støttes av National Research Foundation Grant (NRF-2020R1A2B5B01001792), intramural forskningsfond (1.210115.01) fra Ulsan National Institute of Science and Technology, og Institute for Basic Science (IBS-R022-D1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P.
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- McGhee, J. D., Felsenfeld, G.
- Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
- Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
- Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
- Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
- Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
- Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
- Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
- Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
- Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
- Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
- Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
- Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
- Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
- Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
- Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
- Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
- Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
- Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
- Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
- Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
- Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).
