Un modelo de remodelación vascular inversa en la hipertensión pulmonar debido a la enfermedad cardíaca izquierda por desbandamiento aórtico en ratas

La insuficiencia cardíaca es la principal causa de muerte en los países desarrollados y se espera que aumente en un 25% en la próxima década. La hipertensión pulmonar (HP), un aumento patológico de la presión arterial en la circulación pulmonar, afecta aproximadamente al 70% de los pacientes con insuficiencia cardíaca en etapa terminal; la Organización Mundial de la Salud clasifica la HP como hipertensión pulmonar debida a cardiopatía izquierda (PH-LHD)¹. La PH-LHD se inicia por una función sistólica y/o diastólica del ventrículo izquierdo (VI) deteriorada que resulta en una presión de llenado elevada y una congestión pasiva de la sangre en la circulación pulmonar². Aunque inicialmente reversible, la PH-LHD se fija gradualmente debido a la remodelación vascular pulmonar activa en todos los compartimentos de la circulación pulmonar, es decir, arterias, capilares y venas ^3,4. Tanto el pH reversible como el fijo aumentan la poscarga del RV, lo que inicialmente impulsa la hipertrofia miocárdica adaptativa, pero en última instancia causa dilatación del RV, hipocinesis, fibrosis y descompensación que conducen progresivamente a la falla del RV 1,2,5,6. Como tal, la HP acelera la progresión de la enfermedad en pacientes con insuficiencia cardíaca y aumenta la mortalidad, particularmente en pacientes sometidos a tratamiento quirúrgico mediante la implantación de dispositivos de asistencia ventricular izquierda (DAVI) y / o trasplante de corazón ^7,8,9. Actualmente, no existen terapias curativas que puedan revertir el proceso de remodelación vascular pulmonar, por lo que se necesita una investigación mecanicista fundamental en sistemas modelo apropiados.

Es importante destacar que los estudios clínicos muestran que la PH-LHD como complicación frecuente en pacientes con estenosis aórtica puede mejorar rápidamente en el período postoperatorio temprano después del reemplazo de la válvula aórtica¹⁰. Análogamente, la resistencia vascular pulmonar (PVR) preoperatoria alta (>3 unidades de madera) que, sin embargo, era reversible con nitroprusiato se normalizó de manera sostenible después del trasplante de corazón en un estudio de seguimiento de 5 años¹¹. Del mismo modo, una reducción adecuada de la PVR reversible y fija y la mejora de la función de RV en pacientes con LHD podrían realizarse en varios meses mediante la descarga del ventrículo izquierdo mediante dispositivos de asistencia ventricular pulsátiles y no pulsátiles implantables 12,13,14. Actualmente, los mecanismos celulares y moleculares que impulsan la remodelación inversa en la circulación pulmonar y el miocardio RV no están claros. Sin embargo, su comprensión puede proporcionar información importante sobre las vías fisiológicas que pueden explotarse terapéuticamente para revertir la remodelación vascular pulmonar y de RV en PH-LHD y otras formas de PH.

Se puede utilizar un modelo preclínico adecuado que replique adecuadamente las características fisiopatológicas y moleculares de PH-LHD para estudios traslacionales en insuficiencia cardíaca congestiva inducida por sobrecarga de presión debido a bandas aórticas quirúrgicas (AoB) en ratas ^4,15,16. En comparación con una insuficiencia cardíaca similar debido a la sobrecarga de presión en el modelo murino de constricción aórtica transversa (TAC)¹⁷, la banda de la aorta ascendente por encima de la raíz aórtica en ratas AoB no produce hipertensión en la arteria carótida izquierda ya que el sitio de banda es proximal de la salida de la arteria carótida izquierda de la aorta. Como resultado, AoB no causa lesión neuronal del lado izquierdo en la corteza como es característico de TAC¹⁸, y que puede afectar el resultado del estudio. En comparación con otros modelos de roedores de PH-LHD inducida quirúrgicamente, los modelos de rata en general, y AoB en particular, demuestran ser más robustos, reproducibles y replican la remodelación de la circulación pulmonar característica para los pacientes con PH-LHD. Al mismo tiempo, la letalidad perioperatoria es baja¹⁹. El aumento de las presiones del VI y la disfunción del VI en ratas AoB inducen el desarrollo de PH-LHD, lo que resulta en presiones elevadas de RV y remodelación de RV. Como tal, el modelo de rata AoB ha demostrado ser extremadamente útil en una serie de estudios previos realizados por grupos independientes, incluyéndonos a nosotros mismos, para identificar mecanismos de remodelación vascular pulmonar y probar posibles estrategias de tratamiento para PH-LHD ^{4,15,20,21,22,23,24,25}.

En el presente estudio, el modelo de rata AoB se utilizó para establecer un procedimiento quirúrgico de desbandado aórtico para estudiar los mecanismos de remodelación inversa en la vasculatura pulmonar y el RV. Anteriormente, se han desarrollado modelos de remodelación inversa miocárdica como la desbanda aórtica en ratones²⁶ y ratas²⁷ para investigar los mecanismos celulares y moleculares que regulan la regresión de la hipertrofia ventricular izquierda y probar posibles opciones terapéuticas para promover el miocardio. recuperación. Además, un número limitado de estudios anteriores han explorado los efectos de la desbandación aórtica sobre la HP-LHD en ratas y mostraron que la desbandación aórtica podría revertir la hipertrofia medial en las arteriolas pulmonares, normalizar la expresión de pre-pro-endotelina 1 y mejorar la hemodinámica pulmonar^27,28, proporcionando evidencia de la reversibilidad de la HP en ratas con insuficiencia cardíaca. Aquí, los procedimientos técnicos de la cirugía de desbandado se optimizan y estandarizan, por ejemplo, mediante la aplicación de una traqueotomía en lugar de la intubación endotraqueal o mediante el uso de clips de titanio de un diámetro interno definido para bandas aórticas en lugar de suturas de polipropileno con una aguja roma^26,27, proporcionando así un mejor control de los procedimientos quirúrgicos, una mayor reproducibilidad del modelo y una mejor tasa de supervivencia.

Desde una perspectiva científica, la importancia del modelo de desbandado PH-LHD no radica únicamente en demostrar la reversibilidad del fenotipo cardiovascular y pulmonar en la insuficiencia cardíaca, sino más importante aún, en la identificación de impulsores moleculares que desencadenan y / o sostienen la remodelación inversa en las arterias pulmonares como candidatos prometedores para la futura orientación terapéutica.

Todos los procedimientos se realizaron siguiendo la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (Instituto de Recursos de Animales de Laboratorio, 8ª edición 2011) y aprobados por el comité gubernamental local de cuidado y uso de animales de la Oficina Estatal Alemana de Salud y Asuntos Sociales (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlín; protocolo no. G0030/18). En primer lugar, la insuficiencia cardíaca congestiva se indujo quirúrgicamente en ratas Sprague-Dawley juveniles ~ 100 g de peso corporal (bw) (ver Tabla de Materiales) mediante la colocación de un clip de titanio con un diámetro interno de 0,8 mm en la aorta ascendente (banda aórtica, AoB) como se describió anteriormente^29,30. En la semana 3 después de AoB (Figura 1), se realizó una cirugía de desbandado (Deb) para extraer el clip de la aorta. Los procedimientos quirúrgicos y la validación de la reversión del pH en ratas AoB realizados se representan esquemáticamente en la Figura 1.

1. Preparaciones quirúrgicas

1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos requeridos (Figura 2) en autoclave.
2. Inyecte carprofeno a la rata (5 mg/kg de peso corporal) (ver Tabla de materiales) por vía intraperitoneal (i.p.) para analgesia 30 min antes de la cirugía.
3. Anestesiar a la rata mediante inyección i.p. de ketamina (87 mg/kg de peso corporal) y xilazina (13 mg/kg de peso corporal).
4. Retire el pelo del escote y el pecho del animal con una afeitadora eléctrica.
5. Aplique una gota de ungüento para los ojos para proteger los ojos durante la cirugía.
6. Coloque la rata en posición supina sobre una mesa quirúrgica esterilizada. Fije cuidadosamente el abdomen y las extremidades del animal con cinta adhesiva.
   NOTA: Para mantener la temperatura corporal, coloque una estera calefactora de 37 °C debajo de la mesa quirúrgica. Evite el calentamiento de la región de la cabeza para evitar la sequedad de los ojos.
7. Desinfecte la piel de los animales con solución de povidona-yodo/yodóforo. Tenga en cuenta las cicatrices y suturas de la cirugía primaria de AoB y cubra el campo quirúrgico.
8. Asegurar la profundidad adecuada de la anestesia mediante el pellizco de los dedos de los pies.
   NOTA: La profundidad de la anestesia debe controlarse regularmente durante la cirugía.

2. Traqueotomía y ventilación mecánica

NOTA: Durante toda la cirugía, cámbiese los guantes después de manipular equipos no estériles.

1. Con tijeras finas (Figura 2A), haga una incisión en la línea media cervical de 7-10 mm de largo (Figura 3A).
2. Con la ayuda de un par de fórceps contundentes (Figura 2B'), diseccionar el tejido blando cervical para exponer los músculos infrahioides. Divida los músculos en la línea media para visualizar la tráquea. Cortar y retirar la sutura de la cirugía primaria de AoB.
3. Haga una incisión de tráquea de ~ 2 mm entre dos anillos cartilaginosos usando tijeras de resorte Noyes en ángulo (Figura 2C, 3B). Inserte la cánula traqueal de diámetro exterior de 2 mm (Figura 2D) en la tráquea y asegúrela con una sutura de seda 4-0 (Figura 2E, 3C).
4. Conecte la cánula traqueal a un ventilador mecánico (consulte la Tabla de materiales) manteniendo el espacio muerto al mínimo (Figura 3D-E). Mantenga la ventilación pulmonar perioperatoria a una frecuencia respiratoria de 90 respiraciones/min a un volumen corriente (Vt) de 8,5 ml/kg de peso corporal.

3. Desbandado aórtico

1. Haga una incisión en la piel de ~ 20 mm de largo entre la segunda y la tercera costilla con tijeras finas (Figura 3F).
2. Con la ayuda de tijeras quirúrgicas más pequeñas (Figura 2F), extienda cuidadosamente los músculos y córtelos capa por capa (Figura 3G). Haga una incisión lateral de 10 mm a lo largo del espacio intercostal entre la segunda y la tercera costilla.
   NOTA: La línea media debe abordarse cuidadosamente para evitar el sangrado.
3. Utilice un esparcidor de costillas (Figura 2G) para expandir el espacio intercostal entre la segunda y la tercera costilla para crear una ventana quirúrgica (Figura 3H).
4. Con la ayuda de fórceps contundentes (Figura 2B, B'), separe cuidadosamente el timo del corazón y las arterias del conducto para visualizar la aorta con el clip (Figura 4A).
5. Sostenga el clip con la ayuda de las pinzas y retire cuidadosamente el tejido conectivo alrededor del clip para exponerlo.
   NOTA: Evite sostener o levantar la aorta con las fórceps, ya que puede lesionar la aorta, lo que resulta en sangrado y un resultado letal.
6. Con la ayuda de un soporte de aguja (Figura 2H), abra el clip (Figura 4B) y retírelo de la cavidad torácica.
7. Antes de cerrar el tórax, abra la atelectasia pulmonar, asegure un reclutamiento pulmonar adecuado sin sobredistensión, continúe la ventilación mecánica con una Vt de 9,5 mL/kg de peso corporal durante otros 10 min, y vuelva a una Vt de 8,5 mL/kg de peso corporal para reclutar los pulmones y resolver un posible neumotórax.
8. Cierre los músculos profundos con una simple sutura interrumpida con seda 4-0. Luego conecte los músculos superiores y la piel con una sutura continua simple (Figura 5A, B).

4. Extubación traqueal

1. Desconecte la cánula traqueal de la máquina de ventilación. Observe atentamente a la rata hasta que se restablezca la respiración espontánea. Si el animal no respira espontáneamente al desconectarse, vuelva a conectar el ventilador y continúe ventilando durante 5 minutos adicionales. A continuación, repita el procedimiento.
2. Después de restablecer la respiración espontánea, retire la cánula de la tráquea y limpie el líquido alrededor de la tráquea con puntos de esponja (Figura 2I) (ver Tabla de Materiales).
3. Cierre la tráquea con una sutura simple usando proleno 6-0 (Figura 2E' y Figura 5C). Luego cierre los músculos infrahioides en una sutura interrumpida simple usando seda 4-0 (Figura 5D), y conecte la piel en una sutura continua simple (Figura 5E). Limpie y desinfecte los músculos y la piel durante el proceso con la solución de povidona-yodo/yodóforo.

5. Cuidados postoperatorios

1. Después de completar el procedimiento quirúrgico, mueva cuidadosamente al animal a una jaula de recuperación con oxígeno suplementario y una lámpara infrarroja para mantener a los animales calientes y suficientemente oxigenados durante la fase de recuperación. Coloque la máscara de oxígeno cerca del hocico de la rata. Solo mantenga un animal por jaula de recuperación en cualquier momento.
2. Después de que el animal se despierte, muévalo con cuidado a una jaula regular provista de agua y comida. Durante las siguientes 12 h, controle el estado sanitario del animal operado en intervalos de 2 h.
3. Después de completar el procedimiento quirúrgico, aplique analgesia diariamente mediante inyección i.p. de carprofeno (5 mg/kg de peso corporal) durante una semana.
4. Para evitar la infección bacteriana, administre amoxicilina (500 mg/L) en el agua potable durante una semana después de la operación.

En primer lugar, se confirmó el éxito de la desbandación aórtica mediante ecocardiografía transtorácica realizada antes y después del procedimiento de desbandado en animales AoB (Figura 6). Con este fin, se evaluó el arco aórtico en la vista de modo B del eje largo paraesternal (PLAX). Se visualizó la posición del clip en la aorta ascendente en animales AoB y su ausencia después de la cirugía Deb (Figura 6A,B). A continuación, se evaluó el flujo sanguíneo aórtico mediante imágenes Doppler de onda pulsada (Figura 6C-F). La velocidad máxima del flujo sanguíneo en animales AoB medida antes y después del clip fue de 733.24 ± 17.39 mm / s y 5215.08 ± 48.05 mm / s (n = 8 animales), respectivamente (Figura 6C, E), lo que demuestra un gradiente pronunciado en todo el sitio AoB. Después de la extracción del clip, la velocidad máxima del flujo sanguíneo fue de 1093,79 ± 28,97 mm/s y 2578,73 ± 42,27 mm/s, respectivamente, en las ubicaciones aórticas correspondientes, mostrando una marcada atenuación del gradiente en línea con la desbanda funcional (Figura 6D,F). Para sondear la reversión de la insuficiencia cardíaca izquierda por desbandado aórtico, se accedió a los niveles de expresión del péptido natriurético cerebral (BNP), un parámetro de rutina clínica para evaluar la enfermedad cardíaca31, en el miocardio del VI. En las semanas 3 y 5 después de la banda aórtica, los animales AoB mostraron un aumento significativo de la producción de BNP en comparación con los controles operados simuladamente. En contraste, las ratas Deb en la semana 5 expresaron BNP a niveles comparables a los animales simulados, lo que indica la reversión de la falla del VI por desbanda aórtica (Figura 7A-C). Paralelamente, la evaluación de la función del VI mediante ecocardiografía transtorácica reveló un aumento de la fracción de eyección del VI y del volumen del VI en animales Deb en comparación con ratas AoB (Figura 7D-E). Mientras que la fracción de eyección del VI en animales Deb fue comparable a la de las ratas simuladas, el volumen del VI en las ratas Deb no se normalizó completamente a los valores observados en el grupo simulado, lo que indica que la inversión de la función del VI es incompleta.

Para sondear si los animales Deb pueden servir como modelo preclínico para estudiar la remodelación pulmonar inversa vascular y ventricular derecha (RV) en PH-LHD, la presión sistólica del ventrículo izquierdo (LVSP) y la presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP) se evaluó mediante un catéter Millar de microtipo. En resumen, las ratas fueron nuevamente anestesiadas con ketamina (87 mg / kg de peso corporal) y xilazina (13 mg / kg de peso corporal), traqueotomizadas y ventiladas como se describió anteriormente. El cateterismo cardíaco se realizó después de la toracotomía mediana32 a través del ápice de (primero) el ventrículo izquierdo y (segundo) el ventrículo derecho, respectivamente, ya que el cateterismo directo del ventrículo izquierdo a través de la vía vascular es prevenido por la banda aórtica en animales AoB. Después de la eutanasia por una sobredosis de ketamina/xilazina, se extirpó el corazón y se evaluó la hipertrofia ventricular como el peso del ventrículo izquierdo, incluido el tabique (LV + S) o el ventrículo derecho (RV) normalizado al peso corporal (BW). De acuerdo con las ratas AoB como modelo establecido para PH-LHD, los animales AoB mostraron un aumento significativo de LVSP y RVSP e hipertrofia de LV y RV en comparación con los animales operados simuladamente a las 3 semanas después de la cirugía (Figura 8A-F). La cirugía de desbandado (Deb) realizada en la semana 3 después de AoB resultó en una reducción significativa de la hipertrofia de LVSP y LV en comparación con los animales AoB sin Deb en la semana 3 y la semana 5 después de AoB, lo que demuestra que la normalización de la hemodinámica del VI después de la eliminación del clip de la aorta revirtió la remodelación del VI (Figura 8C, D). En comparación con las ratas AoB en la semana 3 y la semana 5, los animales Deb también mostraron una reducción significativa en RVSP y RV / BW, demostrando una reversión exitosa de PH-LHD (Figura 8E, F). En particular, RVSP en ratas Deb fue comparable a los valores medidos en animales simulados, lo que indica una normalización completa de la hemodinámica rv. En contraste, la hipertrofia de RV en animales Deb solo se revirtió parcialmente con RV / BW, permaneciendo significativamente aumentada en comparación con los controles simulados (Figura 8E, F).

Figura 1: Representación esquemática de los procedimientos quirúrgicos y validación de la reversión del pH en ratas AoB. El esquema representa los diferentes grupos experimentales utilizados en el presente estudio para probar si la cirugía de desbandado revierte la PH-LHD. Controles simulados, operados por simulación; AoB: bandas aórticas; Deb, desbandado. Los triángulos marcan el punto temporal de las intervenciones quirúrgicas: operación primaria (simulada o AoB; rojo) en la semana 0 y operación secundaria (Deb; verde) en la semana 3. Los círculos marcan los análisis de punto final en los que se evaluó ph-LHD mediante presiones de VI y RV y mediciones de hipertrofia, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Instrumentos quirúrgicos. (A) Tijeras finas carburo de tungsteno. B) Fórceps Moria Iris y (B') fórceps Graefe serrados. Las puntas de los fórceps se muestran agrandadas. (C) Tijeras de resorte Noyes. (D) Cánula traqueal. (E, E') suturas 4-0 y 6-0, respectivamente. (F) Tijeras finas carburo de tungsteno. (G) Esparcidor de costillas. (H) Soporte de aguja Mathieu. (I) Tejido de puntos de esponja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Traqueotomía y toracotomía. Las imágenes ilustran los pasos quirúrgicos para la traqueotomía. (A) Incisión cervical en la línea media. (B) Incisión de la tráquea entre dos anillos cartilaginosos. (C) Cánula traqueal insertada en la tráquea y asegurada con una sutura. (D) La cánula traqueal está conectada a un ventilador mecánico. (E) Las imágenes ilustran los pasos quirúrgicos para la toracotomía. (F) Incisión en la piel entre la segunda y tercera costillas. (G) Corte de músculos. (H) Creación de una ventana quirúrgica torácica mediante la extensión de la segunda y la tercera costillas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Visualización del clip de constricción aórtica in vivo y ex vivo. (A) La imagen muestra la cavidad torácica de una rata AoB con un clip de titanio colocado en la aorta ascendente. (B) La imagen muestra el clip cerrado y abierto ex vivo. El asterisco marca la parte del clip que el soporte de la aguja comprime in vivo para abrir el clip. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Cierre de heridas. Las imágenes ilustran el cierre de los músculos torácicos superiores (A) y la piel (B) con una sutura continua simple. La tráquea (C) y los músculos infrahioides (D) están cerrados por una sutura simple y la piel del cuello (E) por una sutura continua simple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Flujo sanguíneo aórtico antes y después de la cirugía de desbandado. (A-B) Visualización de la aorta ascendente en una rata con bandas aórticas (AoB, izquierda) y una rata después de la cirugía de desbandado (Deb, derecha) mediante ecocardiografía transtorácica. La flecha muestra el clip de titanio en la aorta en (A) ausente en (B). (C,D) Las imágenes ecocardiográficas Doppler de onda pulsada muestran el flujo sanguíneo antes del clip en una rata AoB (C) y el flujo sanguíneo en el segmento aórtico correspondiente en una rata Deb (D) tomadas un día antes y un día después de la cirugía de desbandado aórtico, respectivamente. (E,F) Análogamente, las imágenes muestran el flujo sanguíneo en el segmento aórtico después del clip en una rata AoB (E) y en el segmento aórtico correspondiente en una rata Deb (F) tomadas un día antes y un día después de la cirugía de desbandación aórtica, respectivamente. Las líneas verticales de Turquois ilustran las mediciones de la velocidad máxima del flujo aórtico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Normalización de la función ventricular izquierda por desbandamiento aórtico. (A) Los Western blots representativos muestran niveles proteicos de BNP y con GAPDH como control de carga en ventrículos izquierdos (VI) de ratas AoB en la semana 3 después de la banda aórtica (n = 5) y en los controles simulados correspondientes (n = 5). (B) Los Western blots representativos muestran BNP y GAPDH en ventrículos izquierdos (VI) de ratas AoB en la semana 5 después de la banda aórtica (n = 4), en ratas Deb en la semana 5 (n = 5) y en controles simulados en el momento correspondiente después de la cirugía primaria (n = 4). (C) Los gráficos de caja y bigotes muestran la cuantificación de la expresión de BNP normalizada a GAPDH y el control simulado en el momento correspondiente después de la cirugía primaria. Los recuadros muestran percentiles mediano, 25 y 75, respectivamente; los bigotes indican los valores mínimo y máximo. Para los análisis estadísticos, se utilizó la prueba t de Student33 . *p-valor < 0.05. (D) Los gráficos de barras (media ± desviación estándar) muestran la fracción de eyección del VI y el volumen en animales simulados (n = 4), AoB (n = 9) y Deb (n = 7) en la semana 5 medidos por ecocardiografía a partir de imágenes en modo M y B. (E) Las imágenes ecocardiográficas representativas en modo M muestran cambios en el acortamiento fraccional del VI en animales simulados, AoB y Deb en la semana 5. Para los análisis estadísticos se utilizó la prueba U de Mann-Whitney33 . *p-valor < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: La hemodinámica ventricular se normaliza y la hipertrofia cardíaca se invierte mediante la desbandación aórtica. (A) Mediciones representativas de la presión arterial del ventrículo izquierdo (VI) y del ventrículo derecho (RV) en una rata 3 semanas después de la banda aórtica (AoB) en comparación con el control simulado correspondiente. (B) Las imágenes representativas muestran hipertrofia cardíaca en una rata AoB 3 semanas después de la banda aórtica en comparación con el control simulado. (C-F) Los gráficos de caja y bigotes muestran presión sistólica del ventrículo izquierdo (LVSP; C), hipertrofia del VI ([LV+S]/BW; D), presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP; E), e hipertrofia RV (RV/BW; F) en animales simulados y AoB a las 3 y 5 semanas después de la cirugía, y parámetros normalizados (en comparación con los grupos AoB de 3 y 5 semanas) en ratas Deb. Los recuadros muestran percentiles mediano, 25 y 75, respectivamente; los bigotes indican los valores mínimo y máximo. n = 9-12 animales fueron analizados para mediciones hemodinámicas, y el peso cardíaco se midió en n = 7-12 ratas por grupo. Para los análisis estadísticos se utilizó la prueba U de Mann-Whitney. *valor p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar. Todos los coautores han visto y están de acuerdo con el contenido del manuscrito.