Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لدراسة بروتينات الغشاء الكهروجيني عن طريق قياس التغيرات في جهد الغشاء. يوفر هذا الفحص منصة للقراءة الوظيفية لقنوات أيونية متعددة يتم التعبير عنها داخليا في خطوط الخلايا الظهارية.
Abstract
الدراسات القائمة على التألق مناسبة لمقايسات قارئ الألواح عالية الإنتاجية للخلايا في الثقافة. وقد تم استخدامها بشكل شائع في حملات اكتشاف الأدوية التي تستهدف بروتينات القناة الأيونية المؤتلفة التي يتم التعبير عنها بشكل مفرط في خلايا مثل خلايا HEK-293. ومع ذلك ، هناك تركيز متزايد على استخدام خطوط الخلايا ذات الصلة بالأنسجة لدراسة آثار تدخلات الجزيئات الصغيرة. يصف البروتوكول التالي تكييف مقايسة جهد الغشاء القائم على التألق لدراسة القنوات الأيونية المعبر عنها داخليا في خطوط الخلايا الظهارية. يفصل فحص إمكانات الغشاء مقايسة عالية الإنتاجية لنشاط قناة الكلوريد لمنظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR) في خطي خلايا ظهارية تمت دراستهما بشكل شائع ، Caco-2 و Calu-3. بالإضافة إلى ذلك ، تصف هذه الورقة تطبيقا جديدا لهذا النظام لقياس نشاط قناة الصوديوم الظهارية (ENaC) بتنسيق عالي الإنتاجية في نفس خطوط الخلايا الظهارية. معا ، توفر هذه المقايسات القائمة على التألق منصة قوية ومرنة لدراسة معدلات الجزيئات الصغيرة ، وتستهدف قناتين ظهاريتين في سياق خلوي ذي صلة.
Introduction
كانت فحوصات النشاط عالي الإنتاجية القائمة على التألق لبروتينات القناة المؤتلفة فعالة للغاية في تحديد معدلات الجزيئات الصغيرة التي لديها القدرة على أن تصبح علاجات مستقبلية1،2،3،4. إحدى الطرق الشائعة لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة لمعدلات القناة الأيونية هي من خلال قياس التغيرات في إمكانات الغشاء. عادة ، يتم إجراء هذه الشاشات باستخدام قنوات مؤتلفة يتم التعبير عنها بشكل غير متجانس في خطوط الخلايا مثل خلايا HEK-2935،6،7.
ومع ذلك ، هناك حاجة للتحقق من صحة "الزيارات" في أنواع الخلايا ذات الصلة. نقترح أن تكون الشاشة الثانوية في خطوط الخلايا ذات الصلة التي تعبر داخليا عن قنوات الاهتمام أمرا مرغوبا فيه. ستحدد هذه الشاشة الثانوية تلك المعدلات التي من المرجح أن تكون فعالة في فحوصات التحقق النهائية التي تعتمد على الأنسجة البشرية الأولية التي يصعب الوصول إليها.
هناك أيضا حاجة إلى أنظمة فحص تتمتع بالمرونة للإبلاغ عن نشاط أهداف القنوات الأيونية المتعددة في نفس نوع الأنسجة. على سبيل المثال ، هناك أدبيات منشورة موضوعية تدعم مفهوم أن CFTR و ENaC يتفاعلان وظيفيا8،9،10. على الرغم من أنه من المعروف أن العديد من خطوط الخلايا الظهارية المدروسة جيدا تعبر عن كل من CFTR و ENaC ، حتى الآن ، لم يتم وصف شروط الفحص لدراسة كليهما بطريقة عالية الإنتاجية.
هذا الفحص المحتمل للغشاء القائم على التألق متعدد الاستخدامات ، لأنه يستخدم مسبارا كيميائيا خارجيا لقياس وظيفة CFTR و ENaC ، متجاوزا الحاجة إلى مجسات مشفرة وراثيا11. كدليل على المبدأ ، تمت دراسة خطين من الخلايا الظهارية شائعة الاستخدام كأمثلة لتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة اللازمة لقياس نشاط القناة لكل من CFTR و ENaC.
Protocol
1. طلاء الخلايا والتمايز
- زراعة خلايا Calu-3 و Caco-2 في EMEM تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (قلم / جربية) في دورق T-75.
- بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80-100٪ ، قم باستنشاق الوسط من قارورة T-75.
- اغسل الخلايا برفق مرة واحدة باستخدام 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- أضف 2 مل من 0.25٪ تربسين / 0.1٪ EDTA المسخن مسبقا إلى الطبقة الأحادية للخلية وضع دورق T-75 عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تقريبا للسماح للخلايا بالرفع من سطح دورق الاستزراع والانفصال إلى معلق أحادي الخلية.
- بمجرد رفع الخلايا من سطح الدورق ، قم بتحييد التفاعل باستخدام 8 مل من وسط المزرعة (الخطوة 1.1) ليصبح المجموع 10 مل من معلق الخلية.
ملاحظة: فصل كتل الخلايا ميكانيكيا إلى تعليق أحادي الخلية باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. - لوحة الخلايا على لوحة 96 بئر (~ 140،000-150،000 خلية / بئر) أو لوحة 384 بئر (~ 45،000-50،000 خلية / بئر) عند التقاء 30-40٪.
- للوحة واحدة كاملة من 96 بئرا ، أضف 1.5 مل من معلق الخلية إلى 18.5 مل من وسط الاستزراع في أنبوب مخروطي 50 mL. بعد الخلط ، أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر.
- للوحة واحدة كاملة من 384 بئرا ، أضف 1 مل من معلق الخلية إلى 17 مل من وسط الاستزراع في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. بعد الخلط ، أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر.
ملاحظة: تأكد من عدم وجود كتل من الخلايا ، ويتم توزيع الخلايا المفردة بالتساوي عبر كل بئر.
- تغيير الوسط كل 2 أيام بعد الطلاء. إذا لم تصل الخلايا إلى نقطة التقاء في نفس الوقت بين الآبار المختلفة ، فتخلص من اللوحة وكرر الخطوة 1.5.
- بمجرد البذر ، انتظر حتى تصل الخلايا إلى التقاء 100٪ في غضون 3-5 أيام. تغيير الوسط 24 ساعة قبل الدراسات الوظيفية.
2. إعداد محلول المخزن المؤقت للفحص الوظيفي CFTR
- تحضير المحلول العازل الخالي من الصوديوم والكلوريد باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 1.
- أضف الكواشف إلى درجة زراعة الأنسجة ، H 2 O المقطر المزدوج (ddH2O). اترك الكواشف تذوب (في حاوية مغلقة لتجنب التبخر) عن طريق التقليب طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
- بمجرد استقرار المحلول ، قم بقياس الرقم الهيدروجيني. إذا تجاوز الرقم الهيدروجيني للمحلول 7.4 ، أضف 1 M محلول N-methyl-D-glucamine (NMDG) بالتنقيط لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
ملاحظة: لا تقم بضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول باستخدام حمض الهيدروكلوريك لأن المحلول يجب أن يظل خاليا من الكلوريد. - اترك المحلول يختلط لمدة 30 دقيقة أخرى وقم بقياس الأسمولية للمحلول.
- تقليل الأسمولية للمحلول العازل إلى نطاق فسيولوجي من 300 ± 5 mOsm / kg.
- قم بتصفية وتخزين المحلول العازل في زجاجات معقمة.
ملاحظة: يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا تم تخزينها لمدة تزيد عن 6 أشهر ، فتحقق من درجة الحموضة والتناضح في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
3. مقايسة وظيفية CFTR
- قم بإذابة صبغة جهد الغشاء في محلول عازل خال من الصوديوم والكلوريد (0.5 مجم من الصبغة / 1 مل من المحلول العازل) وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تجنب تعريض مسحوق الصبغة المحتمل للغشاء للضوء. - قم بإزالة وسط الاستزراع من أحادي الطبقة الأحادية للخلايا Calu-3 أو Caco-2 وأضف المحلول المحتوي على الصبغة إلى كل بئر (195 ميكرولتر لكل بئر للوحة 96 بئرا ، 95 ميكرولتر لكل بئر للوحة 384 بئر).
ملاحظة: يمكن إضافة ما يصل إلى 112 ميكرولتر لكل بئر من 384 لوحة بئر. - اترك الخلايا تحمل الصبغة لمدة 35 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- انقل الخلايا المحملة بمحلول صبغ إلى قارئ الألواح الفلورية. خذ قياسات مضان من أسفل اللوحة ، مع الإثارة = 530 ± 5 نانومتر ، الانبعاث = 560 ± 5 نانومتر
- ابدأ بأخذ قراءات خط الأساس المستمرة لمدة 5 دقائق على فترات 30 ثانية.
- أضف 5 ميكرولتر من محلول منخفض التركيز من فورسكولين أو DMSO إلى كل بئر للحصول على تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر فورسكولين (1x). خذ قراءة تحفيز لمدة 20 دقيقة مع قياسات على فترات 15 ثانية.
- بالنسبة لتنسيق اللوحة المكونة من 96 بئرا ، قم بإعداد محلول فورسكولين منخفض التركيز (40 ميكرومتر (تخفيف 1:25)) من فورسكولين عن طريق تخفيف 2 ميكرولتر من محلول مخزون فورسكولين (1000x) 1 مللي متر أو DMSO في 48 ميكرولتر من محلول عازل خال من الصوديوم والكلوريد.
ملاحظة: يتبع فورسكولين منخفض التركيز 40 ميكرومتر تخفيف ثان (تخفيف 1:40) في الخطوة التالية لتركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر فورسكولين. - بالنسبة لتنسيق اللوحة المكونة من 384 بئرا ، قم بإعداد محلول منخفض التركيز (20 ميكرومتر فورسكولين (تخفيف 1:50)) عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من 1 مللي متر (1000x) محلول مخزون فورسكولين أو DMSO في 49 ميكرولتر من محلول عازل خال من الصوديوم وخالي من الكلوريد.
ملاحظة: يتبع فورسكولين منخفض التركيز 20 ميكرومتر تخفيف ثان (تخفيف 1:20) في الخطوة التالية لتركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر فورسكولين.
- بالنسبة لتنسيق اللوحة المكونة من 96 بئرا ، قم بإعداد محلول فورسكولين منخفض التركيز (40 ميكرومتر (تخفيف 1:25)) من فورسكولين عن طريق تخفيف 2 ميكرولتر من محلول مخزون فورسكولين (1000x) 1 مللي متر أو DMSO في 48 ميكرولتر من محلول عازل خال من الصوديوم والكلوريد.
- أضف 5 ميكرولتر من محلول منخفض التركيز من CFTRInh172 للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر CFTRInh172. خذ قراءة تثبيط لمدة 15 دقيقة مع القياسات على فترات 30 ثانية.
- بالنسبة لتنسيق اللوحة المكونة من 96 بئرا ، قم بإعداد محلول CFTRInh172 منخفض التركيز (400 ميكرومتر CFTRInh172 (تخفيف 1:25)) عن طريق تخفيف 2 ميكرولتر من محلول مخزون 10 mM CFTRInh172 (1000x) في 48 ميكرولتر من محلول عازل خال من الصوديوم والكلوريد.
ملاحظة: يتبع التركيز المنخفض 400 ميكرومتر CFTRInh172 تخفيف ثان (تخفيف 1:40) في الخطوة التالية لتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر CFTRInh172. - بالنسبة لتنسيق لوحة 384 بئرا ، قم بإعداد محلول CFTRInh172 منخفض التركيز (200 ميكرومتر CFTRInh172 (تخفيف 1:50)) عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من 10 مللي متر CFTRInh172 (1000x) محلول مخزون في 49 ميكرولتر من محلول عازل خال من الصوديوم والكلوريد.
ملاحظة: يتبع التركيز المنخفض 200 ميكرومتر CFTRInh172 تخفيف ثان (تخفيف 1:20) في الخطوة التالية لتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر CFTRInh172.
- بالنسبة لتنسيق اللوحة المكونة من 96 بئرا ، قم بإعداد محلول CFTRInh172 منخفض التركيز (400 ميكرومتر CFTRInh172 (تخفيف 1:25)) عن طريق تخفيف 2 ميكرولتر من محلول مخزون 10 mM CFTRInh172 (1000x) في 48 ميكرولتر من محلول عازل خال من الصوديوم والكلوريد.
- تحديد قياسات شدة التألق لكل بئر ، وتصدير القيم كجدول بيانات بتنسيق عمود يحتوي على آبار فردية. لحساب التغيرات التي يسببها فورسكولين ، قسم قياسات RFU (وحدات التألق النسبية) من كل بئر من لوحة 96 أو 384 بئرا على آخر قياس لشدة التألق لقراءة خط الأساس ورسمها.
- بدلا من ذلك ، قم بقياس استجابة تثبيط CFTRInh172 بوساطة لتأكيد خصوصية وظيفة CFTR12 بشكل أفضل ، حيث قد يؤدي العلاج الحاد بالفورسكولين إلى إزالة استقطاب الغشاء من خلال نشاط قنوات الكلوريد الأخرى ، مثل SLC26A912.
- قم بقياس استجابات الذروة كأقصى قياس لشدة التألق من خط الأساس أثناء تحفيز فورسكولين. استخدم هذا القياس أو المنطقة الموجودة أسفل المنحنى لتحديد استجابة CFTR.
4. إعداد محلول المخزن المؤقت للفحص الوظيفي ENaC
- تحضير المحلول العازل عالي الصوديوم والخالي من الكلوريد مع الكواشف المدرجة في الجدول 2.
- بمجرد استقرار المحلول ، قم بقياس الرقم الهيدروجيني. إذا كان الرقم الهيدروجيني للمحلول أقل من 7.4 ، أضف محلول 1 N NaOH قطرة لضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4.
ملاحظة: لا تقم بضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول باستخدام حمض الهيدروكلوريك لأن المحلول يجب أن يظل خاليا من الكلوريد. - تقليل الأسمولية للمحلول العازل إلى نطاق فسيولوجي من 300 ± 5 mOsm / kg.
- قم بتصفية وتخزين المحلول العازل في زجاجات معقمة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
ملاحظة: إذا كان التخزين أطول من 6 أشهر ، فتحقق من درجة الحموضة والأسمولية في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
5. مقايسة ENaC الوظيفية
- قم بإذابة صبغة جهد الغشاء في محلول عازل عالي الصوديوم وخالي من الكلوريد (0.5 مجم صبغة / 1 مل من المحلول العازل) وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تجنب تعريض مسحوق الصبغة المحتمل للغشاء للضوء. - قم بإزالة وسط الاستزراع من أحاديات طبقة الخلايا Calu-3 أو Caco-2 وأضف المحلول المحتوي على الصبغة إلى كل بئر (195 ميكرولتر لكل بئر لألواح 96 بئرا ، 95 ميكرولتر لكل بئر لألواح 384 بئر).
ملاحظة: تجنب تعريض محلول الصبغة للضوء. - اترك الخلايا تحمل الصبغة لمدة 35 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- انقل الخلايا المحملة بمحلول صبغ إلى قارئ الألواح الفلورية. اقرأ قياسات التألق من أسفل اللوحة ، مع الإثارة = 530 ± 5 نانومتر ، الانبعاث = 560 ± 5 نانومتر.
- ابدأ بأخذ قراءات خط الأساس المستمرة لمدة 5 دقائق على فترات 30 ثانية.
- لتثبيط وظيفة ENaC ، أضف 5 ميكرولتر من محلول أميلوريد منخفض التركيز أو محلول DMSO منخفض التركيز مذاب في محلول عازل عالي الصوديوم وخالي من الكلوريد لتركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر أميلورايد.
- بالنسبة لتنسيق اللوحة المكونة من 96 بئرا ، قم بإعداد محلول الأميلورايد منخفض التركيز (400 ميكرومتر (تخفيف 1:25)) من الأميلورايد عن طريق تخفيف 2 ميكرولتر من محلول مخزون أميلوريد 10 مللي متر (1000x) في 48 ميكرولتر من محلول عازل عالي الصوديوم وخالي من الكلوريد.
ملاحظة: يتبع أميلوريد 400 ميكرومتر منخفض التركيز تخفيف ثان (تخفيف 1:40) في الخطوة التالية لتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر أميلورايد. - بالنسبة لتنسيق اللوحة المكونة من 384 بئرا ، قم بإعداد محلول أميلوريد منخفض التركيز (200 ميكرومتر أميلوريد (تخفيف 1:50)) من الأميلورايد عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من محلول مخزون أميلوريد 10 مللي متر (1000x) في 49 ميكرولتر من محلول عازل عالي الصوديوم وخالي من الكلوريد.
ملاحظة: يتبع أميلوريد 200 ميكرومتر منخفض التركيز تخفيف ثان (تخفيف 1:20) في الخطوة التالية لتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر أميلورايد.
- بالنسبة لتنسيق اللوحة المكونة من 96 بئرا ، قم بإعداد محلول الأميلورايد منخفض التركيز (400 ميكرومتر (تخفيف 1:25)) من الأميلورايد عن طريق تخفيف 2 ميكرولتر من محلول مخزون أميلوريد 10 مللي متر (1000x) في 48 ميكرولتر من محلول عازل عالي الصوديوم وخالي من الكلوريد.
- خذ قراءة تثبيط لمدة 60 دقيقة مع القياسات على فترات 45 ثانية.
- كرر الخطوة 3.7 لتحليل البيانات.
- قم بقياس استجابة الأميلورايد كنسبة تثبيط من خط الأساس إلى نقطة الهضبة ، حوالي 15-20 دقيقة بعد إضافة الأميلورايد. استخدم هذا الاختلاف لتحديد استجابة ENaC.
Representative Results
لقياس نشاط قناة CFTR ، يتم تحضين الخلايا المتمايزة جيدا والملتصقة في محلول خارج الخلية خال من كلوريد يحتوي على صبغة الغشاء الحساسة للجهد. يتم الكشف عن وظيفة CFTR باستمرار على أنها إزالة استقطاب الغشاء بعد تحفيز فورسكولين. تم الكشف عن تدفق الكلوريد كزيادة حادة في التألق مقارنة بالتحكم في السيارة. تستمر الإشارة الفلورية حتى إضافة مثبط CFTR (CFTRInh172) ، مما يؤدي إلى انخفاض سريع في شدة التألق ، كما هو موضح في خلايا Caco-2 (الشكل 1A) ، ويمكن استنساخها في كل من خلايا Caco-2 و Calu-3 (الشكل 1B). تقييم نشاط CFTR كفرق في التغيير الأقصى في التألق بعد فورسكولين أو DMSO (مركبة). تراوحت النقاط الفردية بين ± 3 انحرافات معيارية عن متوسط تحفيز فورسكولين (النقاط السوداء) أو التحكم DMSO (النقاط الرمادية) ، والتي تتوافق مع عامل Z '0.586. أشارت هذه النتيجة الممتازة إلى قابلية استنساخ هذا الفحص (الشكل 1C). في حالة وجود انحراف طفيف في خط الأساس ، يمكن تقليل تأثير الانجراف عن طريق استقراء خط الأساس في جميع أنحاء التتبع بعد التنشيط حتى نقطة إضافة المانع. يمكن قياس الاستجابة كميا على أنها المنطقة الواقعة أسفل المنحنى ، مع تحديد الحد الأدنى بواسطة الخط المستنبط.
يمكن أيضا قياس نشاط ENaC في مجرى الهواء المتلاقى والخلايا الظهارية القولونية المزروعة في 96 صفيحة جيدة. على عكس مقايسة نشاط قناة CFTR ، يتم غمر هذه الخلايا في محلول يحتوي على نسبة عالية من الصوديوم ، مما يتيح امتصاص الصوديوم من خلال ENaC. مع الإضافة الحادة للأميلورايد ، يتم حظر امتصاص الصوديوم ، وتعاني الخلايا من فرط استقطاب الغشاء النسبي. يظهر هذا في خلايا Caco-2 عند كل من التركيزات المنخفضة (10 ميكرومتر) (الشكل 2 أ) وتركيزات عالية (50 ميكرومتر) من الأميلوريد (الشكل 2 أ ، ب) وفي خلايا كالو -3 ذات التركيز العالي من الأميلوريد (50 ميكرومتر) (الشكل 2 ب). تم توسيع اختبار ENaC إلى شكل لوحة 384 بئرا وأظهر قابلية استنساخ كبيرة في تثبيط ENaC. وبالمثل ، تراوحت النقاط الفردية بين ± 3 انحرافات معيارية عن متوسط تثبيط الأميلورايد (النقاط السوداء) أو التحكم في DMSO (النقاط الرمادية). أبلغت استجابة ENaC في خلايا Calu-3 عن عامل Z يبلغ 0.629 مع العلاج الحاد باستخدام أميلورايد (50 ميكرومتر) (الشكل 2C) ، مما يشير إلى أن هذه المعلمات تدعم الفحص عالي الإنتاجية.
الشكل 1: قياس قناة CFTR كتغيرات في إزالة استقطاب الغشاء في خلايا Caco-2 و Calu-3. (أ) تتبع تمثيلي لتحفيز CFTR مع فورسكولين (1 ميكرومتر) والتحكم DMSO في خلايا Caco-2. (ب) مخطط صندوقي وشارب لتحفيز فورسكولين في خلايا Caco-2 و Calu-3 (**** P < 0.0001 ، n > 3 مكررات بيولوجية ، n > 3 تكرارات تقنية). النسخ المتماثلة البيولوجية هي ممرات خط خلية مستقلة. تشير النسخ المتماثلة التقنية إلى الآبار المستقلة لألواح الآبار المتعددة. مخطط مربع يصور القيمة المتوسطة. تصور الحدود IQR ، مع شعيرات تحدد القيم الدنيا والقصوى. (C) مخطط بلاند-ألتمان لاستجابة CFTR القابلة للتكرار مع تحفيز فورسكولين مقارنة بالتحكم في DMSO في خلايا Caco-2. تمثل النقاط السوداء أقصى قدر من التغيرات المطلقة في التألق استجابة لتحفيز فورسكولين. تمثل النقاط الرمادية التغيرات في التألق استجابة للتحكم في DMSO. الاختصارات: CFTR = منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي. DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد ؛ IQR = المدى الربيعي ؛ Fsk = فورسكولين. ΔF / F0 = التغير في التألق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياسات تثبيط ENaC من خلال فرط استقطاب الغشاء في خلايا Caco-2 و Calu-3. (أ) تتبع تمثيلي لتثبيط ENaC مع أميلوريد (10 ميكرومتر) بالنسبة للتحكم DMSO في خلايا Caco-2. (ب) مخطط صندوقي وشارب لتثبيط الأميلوريد في خلايا Caco-2 و Calu-3 (**** P < 0.0001 ، n > 3 مكررات بيولوجية ، n > 3 تكرارات تقنية). (C) مخطط بلاند-ألتمان لاستجابة ENaC القابلة للتكرار مع تثبيط الأميلورايد مقارنة بالتحكم في DMSO في خلايا Calu-3. تمثل النقاط السوداء أقصى تغييرات مطلقة في التألق استجابة لتثبيط الأميلورايد. تمثل النقاط الرمادية التغيرات في التألق استجابة للتحكم في DMSO. الاختصارات: ENaC = قناة الصوديوم الظهارية. DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد ؛ عامل. = أميلورايد. ΔF / F0 = التغير في التألق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم | تركيز |
| NMDG (ن-ميثيل-د-الجلوكامين) | 150 مللي متر |
| حمض الجلوكونيك لاكتون | 150 مللي متر |
| غلوكونات البوتاسيوم | 3 مللي متر |
| هيبس | 10 مللي متر |
الجدول 1: الكواشف وتركيزاتها المقابلة للمقايسة الوظيفية CFTR مع صفر الصوديوم والكلوريد. اختصار: CFTR = منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي.
| اسم | تركيز |
| غلوكونات الصوديوم | 150 مللي متر |
| غلوكونات البوتاسيوم | 3 مللي متر |
| هيبس | 10 مللي متر |
الجدول 2: الكواشف وتركيزاتها المقابلة لمخزن الفحص الوظيفي ENaC مع ارتفاع الصوديوم ، كلوريد صفر. اختصار: ENaC = قناة الصوديوم الظهارية (Na).
Discussion
هنا ، وصفنا الطرق القائمة على التألق لقياس نشاط CFTR و ENaC في خط خلايا سرطان القولون والمستقيم الظهاري ، Caco-2 ، وخط خلايا سرطان الرئة الظهاري البشري ، Calu-3. يمكن استخدام مقايسات إمكانات الغشاء هذه في خطوط الخلايا الظهارية لتأكيد فعالية مركبات معدل الجزيئات الصغيرة ، التي تم تحديدها مسبقا في أنظمة التعبير غير المتجانسة ، قبل التحقق النهائي في المختبر في الثقافات الظهارية الأولية المشتقة من المريض.
من الضروري التأكد من أن القياسات المذكورة أعلاه تعزى بشكل مناسب إلى قناة الاهتمام. على سبيل المثال ، يجب أن يظهر القياس المنسوب إلى CFTR الاعتماد على تعبير بروتين CFTR والقوة الدافعة الكهروكيميائية للكلوريد ، والتي يتم تعديلها بواسطة فورسكولين والمثبط CFTRInh-172. وبالمثل ، يمكن أن تعزى التغيرات المحتملة في الغشاء الناتجة عن أميلوريد 10 ميكرومتر إلى ENaC ، إذا كانت تعتمد على تعبير بروتين ENaC وقوة دافعة للصوديوم الداخلي. على الرغم من أننا أكدنا هذه الخصائص ل ENaC في خلايا MDCK بعد النقل مع جميع الوحدات الفرعية الثلاث ل ENaC 2 ، إلا أننا لم نؤكد رسميا بعد أن استجابة الأميلوريد المقاسة في خلايا Caco-2 و Calu-3 تمنحها ENaC. هذا مهم بشكل خاص ، حيث يمكن للأميلورايد تعديل وظيفة مبادل الصوديوم والبروتون NHE3 بالإضافة إلى ENaC13. من المتصور أن فرط الاستقطاب الناجم عن الأميلورايد الذي لوحظ في هذا الفحص يمكن أن يعكس جزئيا الآثار غير المباشرة للتحمض داخل الخلايا على القنوات الأخرى. للتأكد من أن فرط الاستقطاب الناجم عن الأميلورايد الذي تم قياسه باستخدام هذه الصبغة الحساسة للجهد الغشائي يتم منحه بواسطة ENaC في خطوط الخلايا المذكورة أعلاه وأنظمة الخلايا الأكثر تعقيدا ، مثل الأنسجة المشتقة من iPSC ، فإننا نؤكد أن هذا النشاط يتم فقده عن طريق ضرب وحدة فرعية ENaC ملزمة (بيتا) في هذه السطور.
يتطلب نجاح هذه المقايسات الانتباه إلى عدة عوامل. أولا ، يجب أن تكون الثقافات الظهارية متقاربة ومتباينة بشكل جيد. لقياس وظيفة CFTR و ENaC ، يجب طلاء ما يقرب من 145000 خلية لكل بئر في 96 لوحة بئر أو 45000 خلية لكل بئر في 384 لوحة بئر. بمجرد وصول الخلايا الظهارية إلى الالتقاء (في غضون 3-4 أيام من الطلاء) ، اترك 2-5 أيام من التمايز. تم تحديد هذا التوقيت سابقا بناء على أقصى تعبير لبروتين CFTR عن طريق النشاف المناعي14. وبالمثل ، تم تحديد التوقيت الأمثل لتعبير ENaC الوظيفي في كلا خطي الخلية ، Calu-3 و Caco-2.
تؤدي الطبقة الأحادية غير المتقاربة أو فرط نمو الخلايا إلى انخفاض قابلية التكاثر عبر النسخ المتماثلة التقنية. في الحالات التي لا تصل فيها الخلايا الموجودة في الآبار الفردية إلى نقطة التقاء في نفس الوقت ، يجب التخلص من هذه اللوحات. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون قراءات خط الأساس غير المستقرة أو نقص استجابات التحفيز مؤشرا على ضعف جودة الخلية ، والتي يجب استبعادها من التحليل. يمكن أن تعكس الاستجابات المنخفضة لمنشط CFTR ، فورسكولين ، أو مثبط ENaC ، أميلورايد ، استخدام الخلايا المارة بشكل مفرط15. على الرغم من أنها ليست مشكلة بالنسبة لخلايا Calu-3 و Caco-2 ، إلا أن الخلايا أو الأنسجة الأخرى قد لا تلتصق جيدا بالألواح وقد تتطلب الطلاء المسبق للآبار. على سبيل المثال ، في الدراسات السابقة ، تم إرفاق ثقافات الخلايا الصفراوية 2D بالألواح باستخدام طلاء الكولاجين16. بدلا من ذلك ، تم زيادة التصاق الأنسجة المعوية ثنائية الأبعاد باستخدام Poly-L-Lysine2.
علاوة على ذلك ، عند اختبار تعديل القنوات الأيونية بواسطة جزيئات صغيرة باستخدام مقايسة قائمة على التألق ، من الأهمية بمكان معالجة القطع الأثرية المحتملة التي تمنحها خصائص الفلورسنت للجزيئات الصغيرة. لتأكيد خصوصية الاستجابات الوظيفية ، يمكن التحقق من صحة فحوصات إمكانات الغشاء باستخدام الطرق الكهربية التقليدية ، مثل دراسات Ussing17.
بعد التأكد من أن الاستجابة المكتشفة بواسطة الأصباغ الحساسة للإمكانات الغشائية يتم منحها على وجه التحديد من خلال قناة الاهتمام ، فإن هذه المقايسات لديها إمكانات هائلة للتحقق من صحة المعدلات الواعدة لقنوات الأيونات الظهارية في سياقها الخلوي ذي الصلة. يمكن لهذه المنصة سد الفجوة بين شاشات المغير عالية الإنتاجية في أنظمة التعبير غير المتجانسة والقياسات الكهربائية الحيوية التي تستغرق وقتا طويلا في الأنسجة الأولية التي يصعب الوصول إليها.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا كريستوفر فلاد ومركز SPARC الحيوي في مستشفى الأطفال المرضى على مساعدتهم في إجراء فحوصات إمكانات الغشاء لقياس CFTR و ENaC. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج CFIT بتمويل مقدم من CF Canada ومؤسسة Sick Kids. تم تمويل هذا العمل من قبل حكومة كندا من خلال جينوم كندا ومعهد أونتاريو للجينوم (OGI-148). تم تمويل هذه الدراسة من قبل حكومة أونتاريو. تم دعم S.X. من قبل الجمعية الكندية لأمراض الجهاز الهضمي (CAG) منحة الدكتوراه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
| EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
| FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
| HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
| Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
| Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
| Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |
References
- Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. NPJ Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
- Xia, S., et al. High-throughput functional analysis of CFTR and other apically localized proteins in iPSC-derived human intestinal organoids. Cells. 10 (12), 3419 (2021).
- Jiang, J. X., et al. A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients. Stem Cell Reports. 16 (11), 2825-2837 (2021).
- Hu, J., et al. Human Embryonic Kidney 293 Cells: a vehicle for biopharmaceutical manufacturing, structural biology, and electrophysiology. Cells, Tissues, Organs. 205 (1), 1-8 (2018).
- Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (23), 9776-9795 (2014).
- Chen, M. X., et al. Validation and optimization of novel high-throughput assays for human epithelial sodium channels. Journal of Biomolecular Screening. 20 (2), 242-253 (2015).
- Maitra, R., Sivashanmugam, P., Warner, K. A rapid membrane potential assay to monitor CFTR function and inhibition. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1132-1137 (2013).
- Mall, M. A. ENaC inhibition in cystic fibrosis: potential role in the new era of CFTR modulator therapies. European Respiratory Journal. 56 (6), 2000946 (2020).
- Moore, P. J., Tarran, R. The epithelial sodium channel (ENaC) as a therapeutic target for cystic fibrosis lung disease. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 22 (8), 687-701 (2018).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Merkert, S., et al. High-throughput screening for modulators of CFTR activity based on genetically engineered cystic fibrosis disease-specific iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1389-1403 (2019).
- Bertrand, C. A., et al. The CFTR trafficking mutation F508del inhibits the constitutive activity of SLC26A9. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), 912-925 (2017).
- Frelin, C., et al. Amiloride and its analogs as tools to inhibit Na+ transport via the Na+ channel the Na+/H+ antiport and the Na+/Ca2+ exchanger. Biochimie. 70 (9), 1285-1290 (1988).
- Di Paola, M., et al. SLC6A14 is a genetic modifier of cystic fibrosis that regulates Pseudomonas aeruginosa attachment to human bronchial epithelial cells. mBio. 8 (6), 02073 (2017).
- Schiavi, S. C., et al. Biosynthetic and growth abnormalities are associated with high-level expression of CFTR in heterologous cells. American Journal of Physiology. 270, 341-351 (1996).
- Ogawa, M., et al. Generation of functional ciliated cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 12 (1), 6504 (2021).
- Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool. Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).
