El protocolo describe un biorreactor habilitado para imágenes que permite la eliminación selectiva del epitelio endógeno de la tráquea de la rata y la distribución homogénea de las células exógenas en la superficie de la luz, seguido de un cultivo in vitro a largo plazo de la construcción célula-tejido.
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Artículo de método
Biorreactor guiado por imágenes para generar tejido biodiseñado de las vías respiratorias
En este artículo
Resumen
Resumen
La lesión repetida del tejido de las vías respiratorias puede afectar la función pulmonar y causar enfermedad pulmonar crónica, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Los avances en medicina regenerativa y tecnologías de biorreactores ofrecen oportunidades para producir tejidos funcionales cultivados en laboratorio y construcciones de órganos que se pueden usar para detectar medicamentos, modelar enfermedades y diseñar reemplazos de tejidos. Aquí, se describe un biorreactor miniaturizado junto con una modalidad de imagen que permite la visualización in situ de la luz interna de la tráquea de rata explantada durante la manipulación y el cultivo de tejidos in vitro . Utilizando este biorreactor, el protocolo demuestra la eliminación selectiva guiada por imágenes de componentes celulares endógenos al tiempo que preserva las características bioquímicas intrínsecas y la ultraestructura de la matriz de tejido de las vías respiratorias. Además, se muestra la entrega, distribución uniforme y posterior cultivo prolongado de células exógenas en la luz de la vía aérea descelularizada con monitorización óptica in situ . Los resultados destacan que el biorreactor guiado por imágenes se puede utilizar potencialmente para facilitar la generación de tejidos funcionales in vitro de las vías respiratorias.
Introducción
La superficie luminal del tracto respiratorio está revestida por una capa de epitelio que consiste principalmente en células madre multiciliadas, garrote, copa ybasales 1,2. La capa epitelial sirve como un mecanismo de defensa primario del pulmón, actuando como una barrera biofísica que protege el tejido subyacente de las vías respiratorias contra patógenos inhalados, partículas o gases químicos. Protege el tejido de las vías respiratorias a través de múltiples mecanismos, incluida la formación de uniones estrechas intercelulares, el aclaramiento mucociliar y la secreción antimicrobiana y antioxidante....
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Protocolo
El protocolo de tejido animal a continuación ha sido aprobado por la guía de bienestar animal y las regulaciones del Comité del Instituto para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto de Tecnología Stevens, y cumple con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el uso de animales de experimentación.
1. Diseño y construcción de biorreactor de tráquea de rata guiado por imágenes
- Diseño y fabricación de biorreactor de tráquea de rata
- Cree un modelo de diseño asistido por computadora (CAD) de la cámara del biorreactor con un diseño relevante, como entradas, salidas y cámara de cul....
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Resultados
La modalidad de imagen in situ basada en lente GRIN puede permitir la visualización de la luz interna traqueal in situ (Figura 5A). Utilizando este método de imagen, se pueden obtener imágenes de campo brillante y fluorescentes de las tráqueas nativas y desepitelizadas (Figura 5B, C). No se observó ninguna señal fluorescente de la tráquea nativa antes del etiquetado CFSE (Figura 5Bii). Sin embargo,.......
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Discusión
En este trabajo, creamos un biorreactor guiado por imágenes que puede permitir (i) el monitoreo de la luz de la tráquea in situ después de la eliminación celular y la entrega de células exógenas y (ii) el cultivo in vitro a largo plazo del tejido de la tráquea con semilla celular. Utilizando este biorreactor personalizado, demostramos (i) la eliminación selectiva de las células epiteliales endógenas de la luz de la tráquea utilizando detergente y lavado de las vías respiratorias asistido por vibración y.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Esta investigación ha sido apoyada en parte por el Programa de Investigación de la Fundación de la Sociedad Torácica Americana, la Fundación de Salud de Nueva Jersey y la Fundación Nacional de Ciencias (Premio CAREER 2143620) a J.K.; y los Institutos Nacionales de Salud (P41 EB027062) a G.V.N.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1&veces; PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| conector de 3 puertos | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| de 4 puertos | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Acelerómetro | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Acromático Doblete | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminio muñón de clavija | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiótico-antimicótico | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Varilla de montaje | Thorlabs | ER1 | |
| Tornillos de cabeza de botón | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cubo de jaula | Thorlabs | C4W | |
| Cinta conductora de carbono de doble cara | TED PELLA | 16073 | |
| Kit de etiquetado CFSE | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (agente de limpieza) | Decon | 1061 | |
| Adaptador de montura C | Thorlabs | SM1A9 | |
| Colágeno I | Avanzado BioMatrix | 5153 | |
| Pintura de plata líquida conductora | TED PELLA | 16034 | |
| Espejo dicroico | Semrock | DI03-R488 | Longitudes de onda láser reflejadas: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Eagle modificado de Dulbecco' s medio | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Adaptador de mamparo a manguera de luer | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Luer hembra a lengüeta de tubo | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Conector luer hembra a macho | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Suero fetal bovino | Gibco, Thermo Fisher Scientific 10082147 | ||
| Lente de filtro | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Microscopio fluorescente | Nikon | Eclipse E1000 - D | |
| Fusion 360 | Tuerca | ||
| McMaster-Carr | 91813A160 | ||
| Hexametildisilazano (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Fibra de imagen | SELFOC, NSG grupo | Lente | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Tubos de lente | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Kit de Viabilidad/Citotoxicidad (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Soluciones Newfangled | ||
| Lente | objetivo Olympus | UCPLFLN20X | |
| Bomba peristáltica | Cole Parmer | L/S Sistema | |
| FGF humano recombinante-básico | PeproTech | 100-18B | |
| Anillo de retención | Thorlabs | SM1RR | |
| Cámara CMOS SCIENTIFIC | PCO Panda PCO Panda | 4.2 | |
| Dodecil sulfato de sodio | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks ( 2019) | Dassault Systè mes | ||
| Tubo de lente apilable | Thorlabs | SM1L10 | |
| Amplificador de placa de subwoofer | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Altavoz de subwoofer | Dayton Audio RSS21OHO-4 | del | diafragma: 21 cm |
| Bomba de jeringa | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Placa de jaula roscada | Thorlabs | CP33 | |
| Adaptador luer roscado | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Lente de tubo | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Traductor | Thorlabs | CXY1 |
Referencias
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of N....
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Reimpresiones y permisos
