Summary
このプロトコルは、ラット気管からの内因性上皮の選択的除去および管腔表面上の外因性細胞の均質な分布、続いて細胞組織構築物の長期 インビトロ 培養を可能にするイメージング対応バイオリアクターを記述している。
Abstract
気道組織への繰り返しの傷害は、肺機能を損ない、慢性閉塞性肺疾患などの慢性肺疾患を引き起こす可能性がある。再生医療とバイオリアクター技術の進歩は、薬物のスクリーニング、疾患のモデル化、および組織置換のエンジニアリングに使用できる、ラボで成長した機能的な組織および臓器構築物を製造する機会を提供します。ここでは、インビトロ組織操作および培養中に外植ラット気管の内腔のin situ視覚化を可能にする画像化モダリティと結合された小型化バイオリアクターが記載されている。このバイオリアクターを使用して、プロトコルは、気道組織マトリックスの固有の生化学的特徴および超構造を維持しながら、内因性細胞成分の画像誘導選択的除去を実証する。さらに、脱細胞化気道内腔上の外因性細胞の送達、均一な分布、およびその後の長期培養を、その場での光学的モニタリングで示す。この結果は、イメージング誘導バイオリアクターが、機能的なインビトロ気道組織の生成を促進するために潜在的に使用できることを強調している。
Introduction
気道の管腔表面は、主に多繊毛、クラブ、杯、および基底幹細胞1,2からなる上皮の層によって裏打ちされている。上皮層は、肺の一次防御機構として機能し、吸入された病原体、微粒子、または化学ガスから基礎となる気道組織を保護する生物物理学的障壁として作用する。これは、細胞間タイトジャンクション形成、粘液繊毛クリアランス、抗菌および抗酸化分泌を含む複数のメカニズムを介して気道組織を保護する3,4。欠損した気道上皮は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)5、原発性毛様体ジスキネジー(PCD)6、および嚢胞性線維症(CF)7などの壊滅的な呼吸器疾患と関連している。
肺オンチップ(LOC)技術の進歩は、ヒトの肺の発達を研究し、さまざまな肺疾患をモデル化し、厳しく規制されたin vitro環境で新しい治療材料を開発する機会を表しています。例えば、気道上皮および内皮を、薄い多孔質膜の反対側で培養して、肺組織を交換するガスを模倣することができ、忠実な疾患モデリングおよび薬物検査を可能にする8。同様に、COPD9および嚢胞性線維症10などの気道疾患をin vitroでモデル化するために、in vitro疾患モデルが作成されている。しかしながら、LOC装置の主要な課題は、肺組織の複雑な三次元(3D)アーキテクチャおよび動的細胞−組織マトリックス相互作用をインビトロ11で反復することである。
近年、エクスビボ肺組織の操作を可能にする革新的な組織工学方法論が開発されている12。これらの方法論を用いて、裸化された同種異系または異種異系組織移植片は、化学的、物理的、および機械的処置13を介して肺組織から内因性細胞を除去することによって調製され得る。さらに、脱細胞化肺足場材中の保存された天然組織細胞外マトリックス(ECM)は、移植細胞が付着、増殖、分化するための生理学的模倣的な構造的、生化学的、および生体力学的手がかりを提供する14,15。
ここでは、外植ラット気管組織の インビトロ 組織操作および培養を可能にするLOCおよび組織工学技術を組み合わせて作成されたイメージング誘導バイオリアクターシステムが報告されている。この気道組織バイオリアクターを使用して、プロトコルは、気道組織の根底にある上皮下細胞および生化学的成分を破壊することなく、内因性上皮細胞の選択的除去を実証する。次に、細胞担持コラーゲンIプレゲル溶液を点眼することにより、間葉系幹細胞(MSC)などの新たに播種した外来性細胞の、むき出し気道内腔上の均質分布および瞬間沈着を示す。また、バイオリアクターに組み込まれたマイクロ光学イメージング装置を用いて、上皮除去や内因性細胞送達時の気管内腔の可視化も行われる。また、気管および新たに移植された細胞は、4日間、顕著な細胞死および組織分解なしにバイオリアクター内で培養され得ることが示された。本研究で用いたイメージング対応バイオリアクタープラットフォーム、薄膜ベースの脱上皮化技術、細胞送達法は、 in vitro 疾患モデリングや薬物スクリーニングのための気道組織の生成に有用であると想定しています。
バイオリアクターは、プログラム可能なシリンジポンプ、灌流ポンプ、および単離ラット気管を培養するための人工呼吸器に接続された長方形のチャンバを含む。バイオリアクターは、気管または組織培養チャンバに接続された入口および出口を備え、気管の内部および外部空間に試薬(例えば、培養培地)を別々に供給する(図1)。カスタムメイドのイメージングシステムを使用して、 体外培養ラット気管の内部を細胞レベルで視覚化することができます(図2)。気管の内因性上皮は、洗剤ベースの脱細胞化溶液の点眼とそれに続く振動支援気道洗浄 によって 除去される(図3)。I型コラーゲンなどのヒドロゲル溶液は、外因性細胞を退毒した気管内腔を横切って均一かつ瞬時に播種するための送達ビヒクルとして使用される(図4)。バイオリアクターの構築と実験の実施に使用されるすべての材料は、 材料表に記載されています。
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Protocol
以下の動物組織プロトコルは、スティーブンス工科大学の動物愛護使用委員会(IACUC)の動物福祉ガイドラインおよび規制によって承認されており、実験動物の使用に関する国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに準拠しています。
1. 画像誘導ラット気管バイオリアクターの設計・構築
- ラット気管バイオリアクターの設計と作製
- CADジェネレータソフトウェアを使用して、入口、出口、組織培養室などの関連設計を備えたバイオリアクターチャンバのコンピュータ支援設計(CAD)モデルを作成します。このスタディでは、図 1A-C に示すジオメトリと寸法を使用します。CADジェネレータソフトウェアのチュートリアルは16,17にあります。
- 生成されたCADモデルをコンピュータ数値制御(CNC)コントローラソフトウェアにエクスポートし、CNCマシンを使用してポリテトラフルオロエチレン(PTFE)プラスチックを切断してバイオリアクターチャンバを作成します。CNCコントローラソフトウェアのチュートリアルは18にあります。
注:PTFEに加えて、超高分子量ポリエチレン(UHMWPE)およびポリエーテルイミドなどの他のプラスチック材料を使用して、培養チャンバを作製することができる。 - ルアーアダプターやネジなどのすべてのバイオリアクターコンポーネントを滅菌して、デバイスで培養された組織や細胞の汚染を防ぎます。すべてのバイオリアクターコンポーネントをクリーンな環境でメイン組織培養チャンバに組み立てます(図1A)。
- グラジエントインデックス(GRIN)レンズを用いた撮像装置の構築
- in situ撮像素子を作成するには、積み重ね可能なレンズチューブにチューブレンズを挿入し、保持リングを使用して固定します。レンズチューブアセンブリをCマウントアダプタを介して科学CMOSカメラに取り付けます。
- Micro-Managerなどのソフトウェアを使用して、カメラを操作し、写真やビデオを取得します。長距離(例えば、カメラから10m)に位置する物体を狙い、使用されている撮像ソフトウェアによって物体の焦点が合った画像がコンピュータ画面上に形成されるまで、カメラのチューブレンズと撮像センサとの間の距離を調整する。
- フィルターレンズをデュアルエッジ超解像ダイクロイックミラーに取り付け、レーザーを組み立てロッド、ねじ付きケージプレート、ケージキューブなどの光学ケージシステムコンポーネントを使用してデバイスに取り付けます。
- 対物レンズ (20x) をデバイスに接続します。GRINレンズ(直径=500μm)をXYトランスレータ を介して レンズチューブの先端に取り付けます。GRINレンズと対物レンズの距離を調整して、集束した顕微鏡画像を形成します(図2A、B)。
2.ラット気管の単離
- 手術前に手術部位を消毒し、オートクレーブを121°Cで30分間使用して手術器具を滅菌する。
- ラットを誘導チャンバーに入れ、動物を麻酔するために小さな気化器を用いて15分間2.5%のイソフルランを送達する。ペダル反射により麻酔の深さを評価する。これを行うには、つま先をしっかりとつまみ、動物がつま先のピンチに反応しないことを確認します。
- 麻酔後、イソフルランをチャンバーから取り出し、側尾静脈を通して1,000単位/mLのヘパリンを1mL投与し、肺血管系の血液凝固を防止する。
- 動物を安楽死させるには、動物を5%イソフルランにさらに15〜20分間さらします。誘導チャンバーから動物を取り出し、外科用ボード上に顔を上げた仰臥位に置きます。
- 粘着テープを使用して脚と尾を固定することによって、ラットを手術ボードに固定する。次に、70%イソプロピルアルコール(IPA)を用いてラットの首および胸部領域を滅菌する。皮膚のはさみを使用して3〜4cmの切開をして腹腔を開きます。
メモ:はさみの先端を上に向けて皮膚を深く切らないように注意してください。 - 下大静脈(IVC)をハサミでトランセクトし、エクサンギネーションで安楽死を確認します。
- 首の正中線にハサミを使って切開を行い、気管を露出させて気管切開を行います。胸壁に切開を行い、肺に接続された気管端に達するように肋骨の間を切断することによって正中線開胸術を行う。次に、上腕二頭筋とハサミを使って気管の両端を切断し、気管を隔離します。
- 単離後、20mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を用いて気管をすすぐ。滅菌された上腕二頭筋を用いて気管をバイオリアクターに移す。気管の両端を4-0縫合糸を使用してルアーコネクタに固定します。
- 5 mL の培養液を、バイオリアクターチャンバーに接続されたチューブを介してプログラム可能なシリンジポンプを使用して、5 mL/minの流量でバイオリアクターチャンバーに送達します。
注:培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、組換えヒトFGF-basic(0.1ng/mL)、ウシ胎児血清(FBS、10%)、および抗生物質 - 抗真菌薬(1%)で構成されています。 - バイオリアクターの蓋をアクリルプラスチック製の蓋とネジでしっかりと閉じます。バイオリアクターチャンバーのチューブ接続をオス/メスのルアープラグで閉じて、チューブ内の培養培地の流れを防ぎます。
3. 気管上皮の画像誘導除去
- 気管内腔を明視野または蛍光のいずれかで視覚化するには、バイオリアクターをイメージングステージに配置します(図3A)。
- CFSE溶液を1x PBSで希釈することにより、CFSE細胞標識キットにカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)溶液(濃度:100μM)を調製する。
注:元のCFSE溶液の濃度は10mM(ジメチルスルホキシド(DMSO)中)である。 - 500 μLのCFSE溶液を、気管カニューレに接続されたチューブ を介して シリンジポンプを介して気管を通して5mL/minの流量で注入する。CFSE溶液が気管を満たしたらポンプを停止します。10分間待ってから、シリンジポンプを用いて1x PBSの10mLの注入によって気管内腔を洗浄し、残留未取り込みCFSE試薬を除去した。
- GRINレンズの遠位結像端を気管の一端に取り付けられたルアーコネクタ を介して 気管内に挿入します。その後、気管表面がピントを合わせるまで気管内部にGRINレンズを静かに動かし、20倍の倍率で明視野または蛍光で写真やビデオを撮影します。
- Micro-Managerソフトウェアで明視野画像をキャプチャするには、次の手順に従います。
- ケージキューブを通して白色光を導入し、気管内腔を照らす。 ライブ アイコンをクリックすると、気管の管腔面がリアルタイムで表示されます。 イメージング設定>露出(ms) を使用して、露光時間を目的の値に変更します。この研究では、使用した露光時間は10msおよび50msの範囲であった。
- 画像のコントラストと明るさを調整するには、「ヒストグラム 」ウィンドウと「強度スケーリング」ウィンドウを使用して、インタラクティブヒストグラム 表示の端点に白黒矢印を移動します。または、ソフトウェアが明るさとコントラストを最適なレベルに自動的に調整できるようにする 自動ストレッチ オプションを使用します。
- スナップアイコンをクリックして画像をフリーズします。次に、[画像を置き換え>設定]を使用して、画像を目的の形式で保存します。または、「ImageJ >設定」を使用して、イメージを ImageJ ソフトウェアに直接エクスポートして保存します。
- 蛍光モードで写真やビデオを得るには、ケージキューブを通してCFSE特異的レーザー光(CFSE:励起波長:488nm、発光波長:515nm)で気管内腔を照らす。手順 3.5.2 ~ 3.5.3 に従って、イメージを取得します。写真やビデオを撮った後、気管からGRINレンズをそっと外します。
- 以下のように脱上皮化を行う。
- 2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)脱細胞化溶液を蒸留(DI)水に調製する。50 μLのSDSを6.3mL/minの流量で気管を通して注入し、気管カニューレを通してシリンジポンプを使用して気管内腔に洗剤溶液の薄膜を生成する。
- オス/メスのルアープラグを使用してバイオリアクターのチューブ接続を閉じ、バイオリアクターをインキュベーターに移します。SDSを気管内に37°Cで10分間滞留させます。 気管を通して別の50μLのSDS溶液を注入し、10分間インキュベートする。
- 溶解した上皮およびSDSを除去するには、気管内腔を500μLの1x PBSでシリンジポンプ を介して 3xの流量で10mL/minで灌注する。バイオリアクターをシェーカー上に置き、20Hzの周波数および約0.3mmの変位振幅でバイオリアクターを機械的に振動させて、SDS処理した上皮細胞の気管内腔からの剥離を物理的に促進する。
注:この研究では、シェーカーはサブウーファースピーカー、サブウーファープレートアンプ、および加速度計を組み立てることによってカスタムメイドされました。正弦波波形はコンピュータによって生成され、アンプを介してシェーカーに供給され、シェーカーの応答は加速度計を介して監視されました(図3B)。加えて、電磁シェーカーおよび慣性シェーカーなどの従来のシェーカーは、細胞の剥離を促進するために使用することができる。これを行うには、シェーカーの周波数と加速度をそれぞれ20Hzと0.5gに設定します(変位振幅0.3mmに相当)。 - 気管内腔に500 μLの1x PBSを2回点滴し、気管を機械的に振動させながら残留SDSおよび細胞破片を除去した。上皮除去手順に続いて、ステップ3.6のようにGRINレンズ撮像素子を用いてCFSEの強度を測定することにより上皮層のクリアランスを評価する(図3C)。
4. さらなる分析のための気管組織調製
- 上皮除去を確認するために、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色、トリクロム、ペンタクローム、および免疫染色などのさらなる組織分析を行う。これを行うには、バイオリアクターから気管を取り出し、4°Cで一晩、1x PBS(pH=7.4)中の30mLの4%中性緩衝パラホルムアルデヒド溶液中で固定した。
- 以下の手順に従って固定気管組織を脱水および埋め込みます。
- 固定後、気管組織を10mLの1x PBSで洗浄し、気管を30mLの70%アルコールに移し、4°Cで一晩保持する。鋭利な刃を用いて気管を小さな円筒形切片(〜5mm)に切断し、組織包埋カセット(長さ×幅×高さ:4cm x 2.5cm x 0.5cm)に組織切片を挿入します。各カセットに2つの気管切片を保管してください。
- 一連のイソプロピルアルコール(IPA)溶液(85%、90%、95%、100%)中の切片を、各溶液の30mL中で1時間脱水する。次のソリューションを追加する前に、前のソリューションを削除します。
- 完了したら、カセットを30mLの透明化剤(例えばキシレン)に2時間沈め、IPA溶液を組織切片から完全に置換する。この手順は、適切な換気でヒュームフード内で実行します。
- カセットをパラフィンに2時間沈め、4°Cで一晩パラフィンに埋め込んだ。次に、H&E、トリクロム、ペンタクローム、および免疫染色用のミクロトーム装置を使用して、パラフィン包埋組織を薄切片(5〜8μm)に切断する。
- 走査型電子顕微鏡(SEM)分析のために組織を調製するために、気管を1x PBS(pH=7.4)中の2.5%グルタルアルデヒド溶液の30mL中で4°Cで一晩固定した。その後、SEM用固定気管組織を以下の手順に従って脱水する。
- 固定後、10mLの1x PBSで気管組織をすすいでください。気管組織をハサミで縦方向に小さな半筒切片(長さ:~5mm)に切り込み、組織切片をカセットに挿入します。
- 一連のIPA溶液(35%、50%、70%、85%、95%、および100%)の各溶液中の切片を30mLで10分間脱水する。次のソリューションを追加する前に、前のソリューションを削除します。
- 100%IPA:HMDS(2:1;v/v)を10分間、続いて100%IPA:HMDS(1:2;v/v)を10分間、最後に100%HMDSを一晩浸漬することにより、ヘキサメチルジシラザン(HMDS)ベースの乾燥方法を行います。
注:HMDSは有毒です。すべての乾燥ステップ中にヒュームフードの下で作業します。 - HMDS溶液から組織を取り出し、ヒュームフードの下で1時間乾燥させる。SEMイメージング用のカーボン両面導電性テープまたは銀導電性ペーストを使用して、アルミニウムピンスタブに断面を取り付けます。
5. 外因性細胞のむき出し気管内腔への均質な分布
- ステップ3のプロトコールを用いて脱上皮化ラット気管を準備する。凍結間葉系幹細胞(MSC)を37°Cの水浴中で30秒間解凍する。
注:本研究では、間葉系幹細胞(MSC)をモデル細胞として用い、脱上皮化気管上への外因性細胞の分布を示した。理想的には、初代気道上皮細胞、基底細胞、または誘導ヒト多能性細胞(iPSC)を上皮再生の目的のために使用することができる。 - 血球計数器で細胞を計数し、5 x106 細胞/ mLの濃度の細胞溶液を調製する。細胞を2mLのCFSE溶液(濃度:100μM)と共に室温で15分間インキュベートすることによって、細胞を蛍光標識する。5 mL の 1x PBS で細胞を 3x ですすぎ、3 x107 cells/mL の最終濃度で細胞を新しい培養培地に再懸濁します。
- ヒドロゲルプレゲル溶液を細胞送達のためのビヒクルとして調製する。この研究では、コラーゲンIをMSC細胞の送達ビヒクルとして使用し、製造元の指示に従ってプレゲルを調製します。例えば、3.6 mg/mL コラーゲンプレゲルを得るには、冷却した中和液の 1 部とラット尾部コラーゲンの 9 部を 1.5 mL の滅菌チューブで混合します。次に、混合物を上下に静かにピして、適切な混合を行います。
注:他の生体適合性ヒドロゲルは、研究およびユーザーのニーズに応じてコラーゲンIの代わりに使用することができる。 - ヒドロゲル溶液が調製されたら、所望の濃度(例えば、5 x106 細胞/mL)の溶液に細胞を素早く加える。均一な細胞ヒドロゲル混合物を得るために、マイクロピペットで穏やかにピすることによって細胞とゲル溶液を混合する。
- バイオリアクター内の気管の一端を、ルアーコネクタを介してプログラム可能なシリンジポンプに取り付けます。5 mL の新鮮な培養液を 37 °C でバイオリアクターチャンバーに送達し、シリンジポンプを使用して気管の外面を 5 mL/minの流量で覆います。
- シリンジポンプを使用して、バイオリアクター内の脱上皮化気管に細胞-ヒドロゲル混合物の10 μLボーラスを5 mL/minの流量で投与し、気管内腔上に細胞-ヒドロゲル層を生成する(図4)。
- 細胞注入後、バイオリアクターをゲル化のために37°Cおよび5%CO2 の滅菌細胞培養インキュベーターに入れる。コラーゲンIの場合、ゲル化は30分で起こる。
- 移植細胞の分布を可視化するには、70%のIPAまたはエタノールで拭いてGRINレンズを滅菌し、バイオリアクターをイメージングステージに置きます。必要に応じて、明視野モードと蛍光モードの両方で写真やビデオを撮影します。
- 30分間の細胞播種後、シリンジポンプを用いて1mL/minの流速で1mLの培養液を気管内腔に注入する。
- 細胞播種気管をバイオリアクター内で37°Cのインキュベーター内で所望の時間培養する。長期間培養する場合は、気管内腔およびバイオリアクターチャンバー内の培養培地を24時間ごとにリフレッシュします。細胞培養中は、内腔内の培地を静的に保ち、24時間ごとに交換し、気管の外側の培地は5mL/minの一方向流 を介して 連続的に灌流する。
- 細胞を一定期間(例えば、この研究では1および4日間)培養した後、バイオリアクターから気管を除去する。はさみを使用して、 体外 培養の1日目および4日目に気管を縦方向に2つの半筒切片(すなわち、上部および下部切片)に切断し、細胞増殖を監視し、細胞密度を計算するために内面を露出させる。従来の蛍光顕微鏡を使用して、内面の細胞を視覚化します。
- Micro-Managerソフトウェアを使用して画像を取得するには、手順3.5および3.6に従います。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)フィルターを使用して、CFSE標識細胞を蛍光モードで可視化します。蛍光顕微鏡で撮影した画像を分析し、ImageJソフトウェアを使用して上下断面の細胞密度を計算します。セル数とセル密度を計算するには、次の手順に従います。
- ImageJ ソフトウェアでイメージを開き、イメージ > タイプ > 16 ビットを使用して、イメージをバイナリ イメージ (16 ビット) に変換します。スケールバーで画像スケールを設定するには 、「スケールを解析」>使用して設定します。
- 画像のしきい値を調整して、カウントするセルの構造を強調表示します。 画像>使用してしきい値>調整します。 [粒子の解析]>[パーティクルの解析] を使用して、セルの数をカウントします。細胞数を画像の表面積で割ることによって細胞の密度を計算する。
- 細胞播種後の生存率を評価するには、細胞生存率キットを使用する。この研究のために、気管組織および細胞をバイオリアクター内で37°Cで6時間インキュベートし、室温で15分間、1mLの1x PBS中の4mMカルセイン-AMおよび2mMエチジウムホモダイマー-1で細胞を染色する。
- 1x PBSでリンスした後、蛍光顕微鏡を用いて細胞を視覚化する。ステップ 5.12 で説明した手順を使用して、生細胞と死細胞をカウントします。全細胞(生細胞と死細胞の両方)あたりの生細胞(カルセイン-AMで染色)の割合として細胞生存率を計算します。
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Representative Results
GRINレンズベースのin situイメージングモダリティは、その場で気管内管腔の視覚化を可能にすることができます(図5A)。この画像化方法を用いて、天然および脱上皮化気管の明視野画像および蛍光画像の両方を得ることができる(図5B、C)。CFSE標識の前に天然気管から蛍光シグナルは観察されなかった(図5Bii)。しかし、気管上皮をCFSE色素で標識したところ、上皮全体に均一な蛍光シグナル(緑色)が観察された(図5Ci)。SDSおよび振動支援気道灌漑を介した脱上皮化に続いて、蛍光シグナルの強度は有意に減少し(図5Cii)、上皮のアブレーションを示した。
脱上皮化気管のH&E画像は、気管内腔からの偽層状上皮の除去および下層組織層における細胞およびECM微細構造の保存を示した(図6A)。さらに、ペンタクローム染色(図6B)およびトリクロム染色(図6C)は、気管組織構造およびコラーゲンおよびプロテオグリカンなどのECM成分の維持を確認した。また、上皮細胞の免疫蛍光(上皮細胞接着分子、EpCAM; 図6D)コラーゲンI(図6E)は、上皮の完全な除去および上皮下組織内のコラーゲンIの保存を明らかにした。天然の気管のSEM画像化は、天然ラット気管の管腔表面に主に多繊毛細胞および杯細胞が移入されていることを示した。一方、脱上皮化気管内腔のSEM画像は、ECM線維のメッシュネットワークによって示されるように基底膜が露出し、上皮細胞が存在しないことを示した(図6F)。
脱上皮化ラット気管と蛍光標識細胞を用いて、ヒドロゲルを細胞送達ビヒクルとして組み込むことで、脱上皮化気管腔への均一な細胞分布を達成できるかどうかを調べた(図7A、B)。この研究では、間葉系幹細胞(MSC)を細胞送達および培養研究のモデル細胞として使用した。プロトコール(ステップ5)に記載されているように、MSC負荷コラーゲンIプレゲルを脱上皮化ラット気管に点眼し、GRINレンズイメージングシステムを用いて気管内腔上の細胞の分布をモニターした。対照実験として、MSCsを培養液に懸濁し、細胞負荷培養液を気管内に注入し、細胞の分布を目視で検査した。 in situ イメージング結果は、ヒドロゲル を介して 送達された蛍光標識された細胞が、培養培地 を介して 播種されたものよりも内腔を横切ってより均一に接着したままであることを示した(図7B)。次に、細胞送達前後の細胞生存率を試験して、細胞注入中の剪断ストレスによる潜在的な細胞損傷および死亡を評価した。結果は、細胞の90%以上が生存可能なままであるため、細胞生存率は細胞送達手順によって有意に影響を受けないことを示した(図7C)。
さらに、細胞播種気管を4日間培養した。コラーゲンおよび培養液の両方 を介して 播種された細胞(対照)は、気管内腔の上半分および下半分の両方でCFSEを発現する細胞の数が経時的に増加したことによって示されるように、脱上皮化気管内腔表面上で増殖した(図7D)。注目すべきことに、コラーゲンヒドロゲル送達群では、上部内腔と下部ルーメンとの間の細胞密度の差が対照群のそれよりも小さかったことが、ヒドロゲル を介 した細胞送達が気管腔全体にわたる均質な細胞分布を促進することを示す。
図1:気管バイオリアクターの3次元(3D)コンピュータ図面。(B)バイオリアクターチャンバーの寸法。(C)透明なアクリルプラスチックシートを切断し、ネジでメインチャンバーの上部に取り付けます。単位 = ミリメートル;R = 半径。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ラット気管の in situ 可視化のためのカスタムメイドのマイクロファイバーイメージング。 (a)(i)光路の撮像セットアップコンポーネントの概略図。略語: C = カメラ, TL = チューブレンズ, F = フィルター, DM = ダイクロイックミラー, OL = 対物レンズ;(ii)バイオリアクターのルアーコネクタに挿入された撮像プローブ(GRINレンズ)を示す撮像セットアップ構成要素の写真。(b)GRINレンズがバイオリアクターと一体化していることを示す模式図。(c)バイオリアクター内部の気管を可視化するために用いられるイメージングプローブを示す写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ラット気管の脱上皮化のためのプラットフォーム(A)脱上皮化およびin situ光ファイバイメージングのための実験セットアップを示す写真。(b)上皮除去を容易にするために使用される特注式電磁シェーカーの構成要素およびアセンブリを示す図。ω:周波数、a:振幅(C)ラット気管脱上皮化手順のワークフローを示す模式図。PBS = リン酸緩衝生理食塩水。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ヒドロゲルを用いた脱上皮化ラット気管への外因性細胞の送達。 脱上皮ラット気管の内腔上に細胞を局所的に沈着させる送達ビヒクルとして用いられるヒドロゲル溶液を示す概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:脱上皮化気管の in situ イメージング。 (a)CFSE標識上皮をGRINレンズを通して488nmの青色レーザーで励起しながら気管内腔を蛍光イメージングする写真。(b)(i)明視野および(ii)上皮標識前の気管内腔の蛍光画像。(c)上皮がCFSE蛍光色素で標識されている間の(i)天然および(ii)脱上皮化気管(De-Epi気管)の蛍光画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:天然および脱上皮化ラット気管の組織学、免疫蛍光、およびSEM分析。 (A)H&E染色。(B)紫色が細胞質、青色が細胞核、緑色がプロテオグリカン(例えば、ムチン)、黄色がコラーゲン線維であるペンタクロム染色。(C)ピンクが細胞質、濃い青が細胞核、青がコラーゲンであるトリクロム染色。天然および脱上皮化気管の蛍光画像。(d)EpCAMおよび(E)コラーゲンI.矢印は、気管内腔の表面を示す。(f)気管内腔のSEM顕微鏡写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:気管内腔における外因性MSCの局所沈着。 (a)(i)明視野および(ii)脱上皮化気管の蛍光画像。(b)(i)PBSおよび(ii)コラーゲンIプレゲルを播種したときの脱上皮化気管腔の蛍光画像。気管内腔上への細胞の均質な分布は、プレゲルコラーゲンが細胞の送達ビヒクルとして使用されるときに達成される。(c)(i)蛍光画像および(ii)プレゲルコラーゲンによる送達の6時間前後の細胞の生存率を定量した。n:サンプル数。プロトコールのステップ5.1および5.17に従って、細胞の生存率を評価した。(d)(i)細胞播種1日後及び(ii)細胞播種培養4日後に測定した細胞播種密度。細胞密度は、細胞数を調べた表面積で割ることによって計算した。すべての値は平均±標準偏差を表します。一元配置分散分析(ANOVA)を使用して、グループ間の統計的に有意な差を決定し、p<0.05を有意と見なしました。略号:CM=培地、C=コラーゲン。*p < 0.05**p < 0.01.ns: 重要ではありません。上面と下面の間に有意差(ns)がないことは、気管の円周にわたって均一な細胞分布を意味する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、(i)細胞除去および外因性細胞送達後の気管内腔の in situ モニタリング、および(ii)細胞播種気管組織の長期 インビトロ 培養を可能にするイメージング誘導バイオリアクターを作成した。このカスタムビルドバイオリアクターを使用して、(i)洗剤および振動支援気道洗浄を使用して気管内腔から内因性上皮細胞を選択的に除去すること、および(ii)細胞負荷コラーゲンIプレゲルを使用して、裸の気管の管腔表面上への外因性細胞の均一な分布を実証した。さらに、GRINレンズベースの撮像モダリティは、その場で上皮の除去を確認し た。さらに、H&E、トリクロム、ペンタクローム、免疫蛍光染色、SEMなどのさらなる分析により、上皮の除去と、下層の組織層のアーキテクチャとコンポーネントの維持を確認しました。さらに、新たに移植された外因性MSCのGRINレンズベースのイメージングは、コラーゲンIプレゲルを送達ビヒクルとして用いた場合の細胞の均一な分布を示した。最後に、移植された細胞は、脱上皮化気管上で生存および増殖し、細胞播種気道組織の長期培養におけるバイオリアクターの有効性を強調した。
脱上皮化プロトコルにおける重要なステップは、気管内腔内に薄い洗剤溶液層を作成することです。現在の脱細胞化プロトコルでは、化学物質および酵素の複数のサイクルが長期間にわたって使用されており、コラーゲン線維、グリコサミノグリカン(GAG)、プロテオグリカン、および軟骨細胞の数を減らし、気道足場の生物学的および生体力学的特性を損なう19,20,21。一方、ECMは、移植された外因性細胞の生存、増殖、および分化のための生化学的および機械的手がかりおよび適切な物理的環境を提供する22、23。本研究で説明した薄膜堆積法では、上皮アブレーションに少量の洗剤(50μL未満)を使用しながら、下層の組織層および上皮下細胞成分の保存を可能にする。この研究で実証された洗剤暴露組織の機械的振動は、溶解細胞の剥離およびクリアランスを可能にするため、重要な手順である。上皮を洗剤に曝露することから生じる細胞破片および部分的に破壊された細胞は、洗浄溶液で気管を浸水させることによってのみ洗浄されることが困難である。したがって、洗浄中に気管を機械的に振動させることは、気管内腔から細胞破片を除去するのに十分な剪断力を提供する。
一般に、プレゲルベースの細胞播種アプローチは、送達速度、プレゲルの粘度(すなわち、プレゲル濃度に直接関係する)、表面張力、およびゲル化時間によって影響され得る。特に、プレゲル調製時には、細胞懸濁プレゲルをチューブ内で輸送するのに十分なほど低く、気管の上面に細胞を維持するのに十分な高さのプレゲル濃度を維持することが必須である。したがって、様々な濃度を試験することによって、各プレゲルの最適濃度を見つけることを強く推奨する。さらに、細胞負荷プレゲルの送達を確実に成功させるために、より少ない貴重な細胞で送達速度などの送達技術を実践する。さらに、我々は、(i)送達ビヒクルとしてプレゲルを有する細胞の分布および(ii)退去気管腔上に新たに播種された細胞を培養するためのバイオリアクターシステムの能力を実証するために、細胞モデルとしてMSCを使用したが、将来の研究における幹細胞(例えば、基底細胞)および一次気道上皮細胞の使用は、細胞分化および機能的上皮細胞再生の研究を可能にする可能性がある24、25。さらに、将来の研究には、現在のプラットフォームに空気 - 液体界面(ALI)を追加して、機能的な上皮の生成のために播種された細胞に インビボ様の剪断応力を発生させることが含まれる可能性がある。現在の装置にALIを加えるために、小動物人工呼吸器を気管入口に接続して気管を換気することができる。また、ALIを達成するために、薄膜堆積法を利用して、細胞播種気管内に液差しの培養液を注入することができる。液膜の厚さは、液栓速度26、27を変えることによって変調することができる。プラグは、新たに播種された細胞が接着し、気管内腔にしっかりと生着した後に開始することができる。
さらに、このプロトコルで使用されるin situGRIN レンズベースのイメージングアプローチは、脱上皮化の有効性を確認し、新たに播種された細胞の分布の質を評価するために重要です。組織学や免疫蛍光などの従来の組織解析方法では、気管組織からサンプルを解剖して分析する必要がありますが、本研究で開発されたイメージングプラットフォームは、脱上皮化および細胞送達中の気道内腔の迅速かつ非破壊的なモニタリングを可能にします。 in situ イメージング中に気管を滅菌しておくには、気管内腔に導入する前に、必ず70%IPAまたはエタノールで拭いてGRINレンズを滅菌してください。さらに、GRINレンズを用いて細胞をイメージングするために、細胞(内因性気管上皮細胞または新たに移植された細胞のいずれか)を、異なる励起/発光波長を有する様々な蛍光色素で標識することができる。これを行うには、適切なレーザー光発生器を使用して蛍光標識された細胞を励起し、適切なフィルターレンズをデュアルエッジ超解像ダイクロイックミラーに統合してください。
脱上皮化、細胞送達、および in situ イメージング法の新規性と革新性にもかかわらず、この研究にはいくつかの限界があります。本研究で説明した脱上皮化および細胞送達方法は、表面張力が優勢な小さな気道(直径:3〜4mm未満)に適用可能である。液体プラグを形成し、ブタおよびヒト気管、または気管支などのより大きな気道に脱上皮化溶液または細胞負荷プレゲル懸濁液の薄膜を作成することは、表面張力が他の力、特に重力と比較して無視できる程度になるため、困難な場合があります。さらに、薄膜堆積アプローチを使用し、時間と濃度を調整することにより、強力な洗剤(SDS)で上皮をアブレーションし、下層の組織層を保存することができました。しかし、将来の研究では、3-[(3-コールアミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)28などのより穏やかな脱細胞化洗剤、または水酸化ナトリウム(NaOH)29などの非洗剤溶液を、ECM成分の保存および新たに移植された細胞の支持体について試験することができる。さらに、CFSE標識細胞の蛍光強度は、細胞の分裂により経時的に減少する。我々の研究では、脱上皮化気管上で4日間培養したMSCの蛍光画像は、蛍光強度の有意な減少を示した。組織足場に播種された外因性細胞の長期モニタリングおよび追跡のためには、細胞の長期的または恒久的な蛍光標識を可能にすることができる異なる細胞標識方法が必要であろう。
我々は、本レポートに記載されているイメージング誘導バイオリアクタープラットフォームおよび細胞除去および送達プロトコルにより、バイオエンジニアリングされた気道組織を生成するために使用できる脱上皮化気道組織足場の作成を可能にすることができると想定している。このようなインビトロ気道は、ヒト気道疾患の高忠実度のインビトロモデリングおよび薬物スクリーニングを提供することができる。 例えば、機能的な気道上皮を確立するために、気道基礎幹細胞を、脱上皮化気道組織30上に最初に移植することができる。そして、基底幹細胞から各種上皮細胞への分化に重要な気液界面(ALI)を気管内に生成することができる。さらに、in situ画像化システムは、肺気道障害を有する患者の気道を蛍光的に視覚化するために修正および使用することができる。その場で気道組織を評価するために臨床的に使用するために、剛性GRINレンズは、気道をナビゲートするために柔軟な光ファイバイメージングプローブと置き換えることができる。さらに、ヒドロゲルベースの細胞播種を使用して気道内に細胞を均質に分布させる能力は、患者の損傷または損傷した上皮を置き換える前例のない機会を提供することができる。特に、本研究で開発および使用される細胞置換アプローチは、嚢胞性線維症および原発性毛様体ジスキネジアなどの呼吸器疾患を治療し、重傷を負った気道組織のために移植を拒否されたドナー肺を修復するための細胞ベースの治療を加速することができる31、32、33、34。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、米国胸部学会財団研究プログラム、ニュージャージー健康財団、および国立科学財団(CAREER賞2143620)によってJ.K.に部分的に支援されています。国立衛生研究所(P41 EB027062)からG.V.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 - D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
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