Summary
耐药性白色念珠菌的发病率不断上升，这是全世界的一个严重健康问题。抗菌光动力疗法 （aPDT） 可能提供对抗耐药性真菌感染的策略。本方案描述了Rose bengal介导的apDT在体外耐多药白色念珠菌菌株的疗效。
Abstract
侵袭性 白色念珠菌 感染是人类中一种严重的机会性真菌感染，因为它是肠道，口腔，阴道和皮肤最常见的定殖者之一。尽管有抗真菌药物，但侵袭性念珠菌病的死亡率仍约为50%。不幸的是，耐药性 白色念珠菌 的发病率在全球范围内正在增加。抗菌光动力疗法（aPDT）可以提供替代或辅助治疗，以抑制 白色念珠菌 生物膜的形成并克服耐药性。孟加拉玫瑰（RB）介导的aPDT已经显示出对细菌和 白色念珠菌的有效细胞杀伤。在这项研究中，描述了RB-aPDT对耐多药 白色念珠菌的 疗效。自制的绿色发光二极管（LED）光源设计用于与96孔板的孔的中心对齐。酵母在具有不同浓度RB的孔中孵育，并用不同流量的绿光照亮。采用平板稀释法分析杀伤效果。通过光和RB的最佳组合，实现了3对数生长抑制。得出的结论是，RB-aPDT可能潜在地抑制耐药的 白色念珠菌。
Introduction
白色念珠菌定植于健康个体的胃肠道和泌尿生殖道中，在约50%的个体中可被检测为正常微生物群1。如果在宿主和病原体之间产生不平衡，白色念珠菌能够入侵并引起疾病。感染的范围可以从局部粘膜感染到多器官衰竭2。在美国的一项多中心监测研究中，2009 年至 2017 年间，从侵袭性念珠菌病患者中分离出的约一半是白色念珠菌 3 号。念珠菌血症可能与高发病率、死亡率、住院时间延长有关4.美国疾病控制和预防中心报告说，在所有测试的念珠菌血液样本中，约有7%对抗真菌药物氟康唑5具有耐药性。耐药性念珠菌属的出现引起了人们的关切，即开发抗真菌药物的替代或辅助疗法。
抗菌光动力疗法（aPDT）涉及用PS6峰值吸收波长处的光激活特定的光敏剂（PS）。激发后，激发的PS将其能量或电子转移到附近的氧分子并返回到基态。在此过程中，形成活性氧和单线态氧并引起细胞损伤。aPDT自20世纪90年代以来已被广泛用于杀死微生物7。aPDT的一个好处是，在照射过程中，单线态氧和/或活性氧（ROS）在细胞中会损坏多个细胞器;因此，直到今天才发现对apDT的抗性。此外，最近的一项研究报告说，在apDT后存活的细菌对抗生素8变得更加敏感。
aPDT中使用的光源包括激光器，带滤光片的金属卤素灯，近红外光和发光二极管（LED）9，10，11，12。激光提供高光功率，通常大于0.5 W / cm2，允许在很短的时间内提供高光剂量。它已被广泛用于治疗时间较长的不方便的情况，例如用于口腔感染的apDT。激光器的缺点是其光斑尺寸的照明很小，使用扩散器从几百微米到10毫米不等。此外，激光设备价格昂贵，需要特定的培训才能操作。另一方面，带滤光片的金属卤素灯的照射面积相对较大13。但是，灯太重且昂贵。LED光源已成为aPDT在皮肤病学领域的主流，因为它体积小且价格较低。照射面积可以相对较大，具有LED灯泡的阵列排列。整个脸部可以同时被照亮9.然而，目前可用的大多数（如果不是全部）LED光源都是为临床使用而设计的。它可能不适合在实验室中进行实验，因为它占用空间且价格昂贵。我们开发了一种廉价的LED阵列，它非常小，可以从LED灯带切割和组装。LED可以安装在不同的布置中，用于不同的实验设计。在一次实验中，可以在96孔板甚至384孔板中完成不同条件的apDT。
孟加拉玫瑰（RB）是一种有色染料，广泛用于增强人眼角膜损伤的可视化14。RB介导的aPDT对 金黄色葡萄球菌， 大肠杆菌和 白色念珠菌 的杀伤作用与甲苯胺蓝O15的效率大致相当。这项研究展示了一种验证RB-aPDT对耐多药白色念 珠菌的影响的方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. aPDT系统准备
- 从LED灯条上切割四个绿色发光二极管（LED）（参见 材料表），并将它们与96孔板的四个孔对齐（图1）。
注：LED 被排列成一个 4 x 3 阵列。LED的背面粘附在散热器上以在照射过程中分散热量。 - 使用光功率计测量LED在540 nm处的通量率11 （参见 材料表）。参见 补充图1 ，确保LED的通量率在510-560nm之间。
- 在照射过程中，在板旁边放一个电风扇，以保持恒定的温度（25±1°C）11。参见 补充图2 ，以确保在照射过程中保持介质的恒定温度。
2. 白色念珠菌酵母形式的培养
注：一种耐多药 白色念珠菌 （BCRC 21538/ATCC 10231），对包括氟康唑在内的大多数抗真菌药具有耐药性，用于实验16。
- 按照先前发表的报告17，用圆盘扩散法确定抗真菌药物敏感性。
- 在酵母，菌丝和假菌丝形成中生长 白色念 珠菌，这取决于微生态环境18。
注意：菌丝和假菌丝形式很难进行准确计算。酵母形式可以在显微镜下或流式细胞术下精确计算。细胞生长过程中的温度决定了其形态。在室温（25°C）下，几乎所有的细胞都是酵母形式。 白色念珠 菌在30°C下短时间孵育4小时不影响其酵母形态。
3. aPDT在浮游白色念珠菌上
- 从具有无菌环的琼脂平板中分离出白色 念珠菌 的单菌落，并将其添加到灭菌玻璃管中的3mL酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（参见 材料表）中。
- 将试管在25±1°C下孵育过夜（14-16小时）在培养箱中以155rpm的转速膨胀 白色念珠菌 并保持酵母形式的真菌以进行准确定量。
- 用培养基将过夜培养物在30 °C下稀释至OD 600值约0.5，并以155rpm的速度旋转4小时，以达到 白色念珠菌的对数生长阶段。
- 用新鲜的YPD培养基再次稀释对数期培养物至OD600 值0.65（约1 x 107 菌落形成单位，CFU / mL）。通过连续稀释方法在琼脂平板8上确认最终浓度。
- 通过将粉末溶解在1x PBS中来制备孟加拉玫瑰（RB）的储备溶液（4%）。用0.22μm过滤器过滤并灭菌，并将其储存在4°C的黑暗中。RB的最终工作浓度为0.2%。
- 在1.5mL微量离心管中加入111μL2%RB至1mL对数期白色念珠菌 ，并在室温下在不同时间点（0，15和30分钟）共培养，以了解RB在细胞中的吸收（图2）。
- 用1mL 1x PBS洗涤共培养三次，并在室温下以16，100× g 离心2.5分钟。
注意：aPDT包含四种不同的条件：绝对控制（无光暴露，无RB），暗控制（无光，但与RB一起孵化），光控制（暴露于没有RB的光），aPDT（在RB存在的情况下暴露于光）。 - 将 白色念珠菌 重悬于1 mL的1x PBS中，并将它们分配到96孔板中的三个不同孔中，用于每种情况。洗涤后将孔与LED阵列对齐。
- 在有光照的人群中，打开电风扇和灯。
注意：通过将孔暴露在不同的时间段内，可以实现不同的通量（J / cm2）。例如，使用10 mW/cm2 LED灯泡，16.7分钟的光照为10 J/cm2 。 - 照射后，将20μL共培养溶液从一个孔中加入到含有180μL1x PBS的1.5mL离心管中以制备10x稀释液。另外，稀释十次，随后遵循相同的方法。
- 将三滴20μL的每次连续稀释液滴到YPD琼脂平板的一象限上，以达到该板的可计数菌落。通过将菌落与稀释因子3相乘来计算CFU / mL。
4. 统计分析
- 使用绘图和统计软件分析收集的数据（参见 材料表）。
- 按平均值±平均值的标准误差来描述数据。对方差8 执行双向方差分析，以评估不同检验条件之间的显著差异。
- 执行 Tukey 的多重比较测试以进行成对比较8。对于每种不同的治疗，至少进行三次独立实验。考虑 p 值< 0.05 具有统计显著性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图1 显示了本研究中使用的apDT系统。由于高温可能导致严重的电池死亡，因此LED阵列由电风扇冷却，并在照射过程中使用散热器将恒定温度保持在25±1°C。 热效应可以打折。具有均匀的光分布也是成功的apDT的重要决定因素;因此，在照明期间将LED灯泡精确地对准井至关重要。由于LED的亮度，在开灯之前需要配备太阳镜。
白色念珠菌 立即用RB染色，在荧光显微镜下通过红色荧光可视化（ 图2中的0分钟）。可以看出，RB以时间依赖性的方式进入细胞（图2）。该研究使用了15分钟的RB孵育，其中15分钟后，大多数细胞被RB染色。较高浓度的RB导致更强的荧光，产生更多的自由基来杀死真菌。然而，它也可能导致正常细胞的显着细胞死亡;因此，0.2%RB浓度在临床中常用。因此，本研究选择了确切的浓度。
PDT涉及用光激活RB。当激活的RB恢复到其基态时，它将能量和电子转移到附近的氧气中以产生自由基和单线态氧，导致细胞死亡。 图3 显示，在没有照射或没有RB的情况下，没有细胞死亡。在绿光照射后，在0.2%RB的存在下，白色 念珠菌 以轻剂量依赖性方式被抑制（图3）。将真菌暴露在30 J / cm2 的绿光下导致4对数（99.99%）抑制细胞生长。
图 1：光动力系统。（A） 将绿色 LED 阵列粘附在金属散热器上以在照射过程中分散热量。在光源旁边放置一个电风扇，以保持温度恒定在25±1°C。（C）96孔板的孔与LED的中心对齐。请点击此处查看此图的大图。
图2：蔷薇进入白色念珠菌的时间依赖性研究。与0.2%孟加拉玫瑰（RB）共培养0-30分钟后白色念珠菌的明场（A-D）和荧光图像（E-H）。（A）和（E）对照，不进行RB共培养。（B）和（F）立即用0.2%RB染色细胞。（C）和（G）培养15分钟后，大多数细胞显示红色荧光，表明细胞内RB。（D）和（H）在30分钟的孵育中注意到RB的较强荧光。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的大图。
图3：抗菌光动力疗法对耐多药白色念珠菌的影响。细胞的生长抑制取决于光通量。在0.2%孟加拉玫瑰的存在下，将白色念珠菌暴露在10 J / cm 2的通量下，分别抑制1.5个对数，2个20 J / cm2的对数和4个30 J / cm 2的对量的细胞生长。-RB，没有玫瑰孟加拉孵化;+RB，与孟加拉玫瑰共培养15分钟。数据是±三个重复执行的独立实验的SEM的平均值。图中标示了p值（Tukey的多重比较检验，双向方差分析）。请点击此处查看此图的大图。
补充图1：LED输出光谱。 用功率计测量510-560 nm每2 nm一次的通量率。数据从两个独立的实验中汇集，一式三份测量。 请点击此处下载此文件。
补充图2：介质在照射过程中的温度。 将热电偶插入装有100μL肉汤的96孔板的每个孔中以测量温度。温度恒定在25±1°C。 数据从一式三份孔的重复实验中汇集。 请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
最近报道了RB-PDT治疗真菌性角膜炎的临床应用结果令人鼓舞 19.RB的吸收峰在450-650nm处。确定光源的通量率对于成功的apDT至关重要。治疗癌细胞需要高通量（通常>100 J / cm2），而较低的通量有望治疗感染的病变6。高通量意味着长时间暴露，这在临床环境中可能不切实际。对于治疗真菌性角膜炎，眼科界同意5.4 J/ cm 2 20。RB的孵育时间长也不方便患者接受apDT治疗。因此，选择15分钟的孵育时间进行进一步的实验。
某些步骤对于成功的实验至关重要。将用于真菌培养的琼脂平板在打开风扇的层状流动舱中干燥15-20分钟，以减少表面上的水分。潮湿的表面将允许真菌液滴的流动混合，防止形成单个菌落。
在昏暗的光线下执行所有实验对于防止RB进行光漂白至关重要。电路并联，因此如果其中一个电路发生中断，其余设备不会受到影响。如果结果超出其他范围，可以首先检查阵列，以确保所有LED灯泡都处于良好状态。
使用LED光源的一个限制是其温度依赖性。在LED中，热量不是由LED灯泡本身产生的，而是在器件9内的半导体结处产生的。由于LED过驱动超过其额定电流会引起结温的升高，最终导致灯泡过早失效，因此有必要为设备配备金属散热器，以提供适当的结冷。LED阵列当前设计的另一个限制是每个LED灯泡照亮的受限区域，它只能容纳96孔板中的一个孔。如果需要更大的照明面积，则需要在板上方或下方具有适当相应距离的LED灯泡的不同排列，以实现均匀的照明。
该研究设计的优点是用于apDT实验的光动力系统的设置简单且便宜。它可用于有关真菌感染的实验。病毒和细菌也可以在同一系统中进行测试。LED灯条可以从不同颜色的光中选择，以与不同光敏剂的吸收峰相关联，范围从可见光到近红外光谱。它们可以很容易地从市场上购买。该条带可以切割并组装成不同的阵列，以与96孔板对齐，以实现高通量测定。使用96孔板可以同时使用不同的测试条件，以节省实验室的时间和空间。
总之，本研究中建立的系统简单，容易，并且通用，可以检查对各种微生物和细胞的不同光动力效应。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作已获得国立成功大学应用纳米医学中心的资助，教育部（MOE）高等教育萌芽项目框架内的特色区域研究中心计划，以及台湾科技部[MOST 109-2327-B-006-005]到TW Wong。洪俊华感谢台湾成功大学医院[NCKUH-11006018]和[MOST 110-2314-B-006-086-MY3]的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | Disperses heat from the LED array. |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
- Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
- Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
- Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
- Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia - four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
- Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195 (2020).
- Wainwright, M.
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).
- Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
- Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen's disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
- Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
- Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).
- Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
- Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
- Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
- Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).
- Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
- Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
- Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).
