Perfil espacial digital para la caracterización del microambiente en glioma infiltrante difuso de tipo adulto

Summary

La desregulación proteómica juega un papel importante en la propagación de gliomas infiltrantes difusos, pero varias proteínas relevantes permanecen sin identificar. El procesamiento espacial digital (DSP) ofrece un enfoque eficiente y de alto rendimiento para caracterizar la expresión diferencial de proteínas candidatas que pueden contribuir a la invasión y migración de gliomas infiltrativos.

Abstract

Los gliomas infiltrantes difusos se asocian con una alta morbilidad y mortalidad debido a la naturaleza infiltrativa de la diseminación tumoral. Son tumores morfológicamente complejos, con un alto grado de variabilidad proteómica tanto en el propio tumor como en su microambiente heterogéneo. El potencial maligno de estos tumores se ve reforzado por la desregulación de las proteínas involucradas en varias vías clave, incluidos los procesos que mantienen la estabilidad celular y preservan la integridad estructural del microambiente. Aunque se han realizado numerosos análisis masivos y de glioma unicelular, existe una relativa escasez de estratificación espacial de estos datos proteómicos. Comprender las diferencias en la distribución espacial de los factores tumorígenos y las poblaciones de células inmunitarias entre el tumor intrínseco, el borde invasivo y el microambiente ofrece información valiosa sobre los mecanismos subyacentes a la proliferación y propagación del tumor. El perfil espacial digital (DSP) representa una tecnología poderosa que puede formar la base para estos importantes análisis multicapa.

DSP es un método que cuantifica eficientemente la expresión de proteínas dentro de las regiones espaciales especificadas por el usuario en una muestra de tejido. DSP es ideal para estudiar la expresión diferencial de múltiples proteínas dentro y entre regiones de distinción, lo que permite múltiples niveles de análisis cuantitativo y cualitativo. El protocolo DSP es sistemático y fácil de usar, lo que permite un análisis espacial personalizado de los datos proteómicos. En este experimento, los microarrays de tejido se construyen a partir de biopsias archivadas del núcleo del glioblastoma. A continuación, se selecciona un panel de anticuerpos, dirigidos a proteínas de interés dentro de la muestra. Los anticuerpos, que se conjugan previamente a oligonucleótidos de ADN fotocleavable UV, se incuban con la muestra de tejido durante la noche. Bajo microscopía de fluorescencia visualización de los anticuerpos, las regiones de interés (ROIs) dentro de las cuales cuantificar la expresión de proteínas se definen con las muestras. La luz UV se dirige a cada ROI, dividiendo los oligonucleótidos de ADN. Los oligonucleótidos son microaspirados y contados dentro de cada ROI, cuantificando la proteína correspondiente sobre una base espacial.

Introduction

Los gliomas infiltrantes difusamente son el tipo más común de tumor cerebral maligno en adultos y son invariablemente letales. La propensión de las células de glioma a migrar extensamente en el cerebro es un desafío terapéutico importante. El mecanismo por el cual se propagan implica la migración dirigida y la invasión sin control. Se ha demostrado que las células de glioma invasivo exhiben tropismo y migración a lo largo de los tractos de sustancia blanca¹, con investigaciones recientes que implican la desmielinización de estos tractos como una característica activa y protumorigénica². La invasión está mediada por una t....

Protocol

El protocolo descrito a continuación sigue las pautas del Comité de Ética de Investigación Humana de Dartmouth-Hitchcock. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes cuyas muestras de tejido fueron incluidas en este estudio. Consulte la sección Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.

1. Preparación de la diapositiva¹⁷

1. Recuperar o preparar tejido fijado en formalina e incrustado en parafina a partir de gliomas infiltrantes difusos de tipo adulto humano.
   NOTA: En....

Results

La Figura 4 muestra los resultados representativos de un experimento DSP realizado en muestras de glioblastoma. Se presenta un mapa de calor, que ilustra uno de los métodos para capturar datos visualmente utilizando el software DSP. Las filas representan objetivos de proteínas, y cada columna corresponde a una región de interés. Una gama de colores de azul a rojo denota una expresión baja a alta, respectivamente. La variabilidad del color dentro de una fila refleja la heterogeneidad regional.......

Discussion

Dada la diversidad de proteínas que podrían influir potencialmente en la agresividad de los gliomas y la noción de que varias de estas proteínas permanecen sin descubrir, un método de cuantificación de proteínas de alto rendimiento es un enfoque tecnológico ideal. Además, dado que los datos espaciales en muestras oncológicas a menudo se correlacionan con la expresión diferencial¹⁸, la incorporación del perfil espacial en el enfoque de cuantificación de proteínas permite un análisis más efectivo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de detección de investigación BOND Leica	Biosystems, Wetzlar, Alemania	DS9455	Sistema de detección abierto que contiene recipientes abiertos en una bandeja de reactivos
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania	AR950	10X solución tampón concentrada para el lavado de tejido fijo
Tampón W	NanoString, Seattle, WA	Contactar empresa	Reactivo de bloqueo
Kit de conjugación Cy3	Abcam, Cambridge, Reino Unido	AB188287	Kit de conjugación de anticuerpos fluorescentes
Cy3 GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	Contactar con la empresa	Sistema para la obtención de imágenes y la caracterización de proteínas y objetivos de
ARN GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA		100471 Kit de tampón para GeoMX DSP (incluye tampones para el procesamiento y preparación de muestras)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controles para ejecutar GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Módulo de proteínas con objetivos para células inmunitarias humanas y objetivos inmunooncológicos
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Módulo de proteínas con dianas para múltiples tipos de tumores humanos y para marcadores de transición epitelio-mesenquimal
Preparación de portaobjetos de proteínas GeoMx FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Reactivos de preparación de muestras para el análisis de proteínas GeoMX DSP
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania	Contactar empresa	tinción IHC totalmente automatizado
12 reacciones	NanoString, Seattle, WA	100052	Materiales y reactivos para usar con el sistema de análisis nCounter Sistema de
análisis nCounter	NanoString, Seattle, WA	Contactar empresa	Sistema automatizado para la cuantificación de la expresión de dianas multiplexadas (para ser utilizado con GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungría		Para crear el bloque de microarrays de tejidos