Las respuestas vasculares de la circulación pulmonar arterial se pueden explorar utilizando la arteria intrapulmonar (IPA) y las células del músculo liso vascular (VSMC). El presente estudio describe el aislamiento de IPA en detalle y los protocolos utilizados para investigar la vasorelajación en respuesta a estímulos fisiológicos.
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Artículo de método
Aislamiento de la arteria intrapulmonar y las células del músculo liso para investigar las respuestas vasculares
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Resumen
Resumen
La arteria intrapulmonar (IPA) y las células del músculo liso vascular (VSMC) aisladas de pulmones de rata se pueden usar para estudiar los mecanismos subyacentes de vasoconstricción y vasorelajación. Después de aislar el IPA y VSMCs, las características de las respuestas vasculares en condiciones fisiológicas y patológicas pueden evaluarse en ausencia de factores extrínsecos como señales nerviosas, hormonas, citoquinas, etc. Por lo tanto, el IPA y los VSMC sirven como excelentes modelos para estudiar la fisiología / fisiopatología vascular, junto con diversas investigaciones experimentales, como la modulación por agentes farmacológicos, el análisis electrofisiológico de patch-clamp, las imágenes de calcio, etc. Aquí, hemos utilizado una técnica para aislar el IPA para investigar las respuestas vasculares en una configuración de baño de órganos. Los segmentos de IPA se montaron en la cámara de baño del órgano a través de cables intraluminales y fueron estimulados por diversos agentes farmacológicos. Los cambios en el tono vascular IPA (es decir, vasoconstricción y vasorelajación), se registraron utilizando un transductor de fuerza isométrica y un programa de software de análisis de datos fisiológicos. Implementamos varios protocolos experimentales, que pueden adaptarse para investigar los mecanismos de vasorelajación/vasoconstricción para estudiar las actividades farmacológicas de fármacos fitoquímicos o sintéticos. Los protocolos también se pueden utilizar para evaluar el papel de los fármacos en la modulación de diversas enfermedades, incluida la hipertensión arterial pulmonar. El modelo IPA nos permite investigar la curva concentración-respuesta, que es crucial para evaluar los parámetros farmacodinámicos de los fármacos.
Introducción
La vasculatura pulmonar es un sistema vascular de baja presión en el que la función principal es suministrar sangre desoxigenada al área de intercambio de gases de los pulmones. Las arterias pulmonares en los pulmones están dispuestas en ramas paralelas al árbol bronquial, formando finalmente una extensa red de capilares que es continua sobre varios alvéolos y, finalmente, uniéndose en vénulas y venas. El tono vascular de la arteria pulmonar está controlado por varios factores, que involucran la interacción entre el endotelio y las células del músculo liso vascular (CMV)1.
En este estudio, nos centramos en la vasorelajación dependiente e independiente del endotelio de la arteria intrapulmonar (IPA). Con respecto a la vasorelajación dependiente del endotelio, varios mecanismos que ocurren en la superficie de las células endoteliales podrían aumentar la concentración intracelular de Ca2+ (por ejemplo, la acetilcolina [ACh] se une con el receptor muscarínico [M3]), lo que lleva a la formación de óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGl2) y factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF) (Figura 1 ). El NO es el principal factor relajante derivado del endotelio sintetizado a partir de la L-arginina por la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS)2, que luego se disocia de las células endoteliales a los VSMC (Figura 1) y estimula la enzima guanilil ciclasa soluble (sGC); esta enzima cambia el trifosfato de guanosina (GTP) en monofosfato de guanosina cíclico (GMPc), que activa la proteína quinasa G (PKG) y reduce los niveles citosólicos de Ca2+, causando así vasorelajación (Figura 1). PGl2 es sintetizado por las células endoteliales a través de la vía de la ciclooxigenasa (COX) 3,4. Se une con el receptor de prostaciclina (IP) en los VSMC y estimula la enzima adenilil ciclasa (AC), que luego convierte el trifosfato de adenosina (ATP) en monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) (Figura 1)3,4. El AMPc activa la proteína quinasa A (PKA), reduciendo los niveles citosólicos deCa2+ y provocando vasorelajación5 (Figura 1). La vía EDHF también participa en la vasorelajación dependiente del endotelio a través de varios mediadores endoteliales y eventos eléctricos. La activación de la vía EDHF conduce a la hiperpolarización de los VSMC, cerrando así los canales de Ca 2+ operados por voltaje (VOCC), reduciendo los niveles intracelulares de Ca 2+ e induciendo vasorelajación 6. La vasorelajación independiente del endotelio ocurre directamente en los VSMC a través de varios mecanismos, como la reducción del nivel intracelular de Ca 2+, la inhibición de la quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK), la activación de la fosfatasa de cadena ligera de miosina (MLCP) y la reducción de la sensibilidad de Ca2+ a la maquinaria contráctil de los VSMC. En este estudio, nos centramos en la vasorelajación causada por la apertura de varios canales K +, el bloqueo de VOCC y la inhibición de la liberación de Ca 2+ del retículo sarcoplásmico7, lo que conduce a la reducción de los niveles intracelulares de Ca2+, disminuyendo así la fosforilación de la cadena ligera de miosina VSMC y la unión miosina-actina o la formación de puentes cruzados, respectivamente, en última instancia, resultando en vasorelajación.
La técnica para evaluar las mediciones de vasoconstricción y vasorelajación en IPA aislada está bien establecida para roedores, pero los datos variaron dependiendo de los protocolos experimentales. El presente estudio describe el método utilizado para evaluar las reactividades vasculares de preparaciones de IPA de rata in vitro, que se realizaron en ausencia de factores externos que modulan la respuesta vascular in vivo, como señales nerviosas, hormonas, citoquinas, presión arterial, etc.
Empleamos varios protocolos experimentales utilizando el extracto de la planta como ejemplo para estudiar las reactividades vasculares de IPA. Se utilizaron varios bloqueantes (Figura 1) para identificar los mecanismos de vasorelajación dependiente e independiente del endotelio inducidos por el extracto de la planta. Sin embargo, los mismos protocolos se pueden adaptar para evaluar las respuestas vasculares de IPA a cualquier fármaco, extracto o fitoquímico utilizado para el tratamiento de diversas patologías pulmonares.
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Protocolo
Los experimentos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Naresuan (NUACUC), número de protocolo NU-AE620921, para el cuidado y uso de animales con fines científicos.
1. Composición de las soluciones fisiológicas
- Formular la solución de Krebs disolviendo productos químicos en agua destilada para alcanzar las concentraciones finales de la siguiente manera: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0.5 mM KH 2 PO 4, 0.5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl 2 y 11 mM glucosa8. Ajustar el pH de la solución a 7,3 con NaOH 1 M y precalentar a 37 °C antes de su uso.
- Prepare la solución fría de Krebs de manera similar a la mencionada en el paso 1.1. para su uso como medio de aislamiento de IPA, como se describe en el paso 2.
2. Aislamiento de la arteria intrapulmonar (IPA)
- Anestesiar ratas Wistar macho de 8 semanas de edad con una inyección intraperitoneal de tiopental sódico (100 mg/kg)9. Verifique a las ratas su reacción a estímulos dolorosos en el sueño profundo usando fórceps sujetos a sus pies, luego asegúrese de que las ratas no tengan una reacción de retroceso del pie antes de sacrificarlas en el paso 2.2.
- Abra el tórax medio de la rata y el terminal cardíaco con tijeras (tamaño 14 cm). Luego, localice la raíz del pulmón con tijeras (tamaño 14 cm). Cosechar todo el pulmón cortando con tijeras y sumergirlo en la solución fría de Krebs10,11.
- Cortar un solo lóbulo del pulmón con tijeras (tamaño 11 cm) y colocar sobre una placa de Petri (tamaño 9 cm) con el lado medial/raíz del pulmón hacia arriba (Figura 2A, B). Observe e identifique la alineación de la vena, los bronquios y la arteria de arriba a abajo (Figura 2B).
- Cortar el bronquio longitudinalmente con tijeras (tamaño 11 cm). Luego, use los fórceps (tamaño 11 cm) para agarrar la punta del bronquio. Diseccionar suavemente y extraer el bronquio y las venas del pulmón. Tenga en cuenta que el AFI siempre está alineado anatómicamente debajo del bronquio.
- Después de eso, se puede visualizar el IPA principal (Figura 2C). Use los fórceps (tamaño 11 cm) para agarrar la punta del AFI y diseccionarla cuidadosamente del tejido pulmonar con tijeras (tamaño 11 cm).
- Conservar el IPA aislado en una solución de Krebs fría hasta que se configure el conjunto del baño de órganos (pH 7,3 y temperatura 4 °C)1 1.
3. Aislamiento de células del músculo liso vascular (VSMCs)
- Aísle IPA como se describió anteriormente en el paso 2. Cortar la rama principal del AFI longitudinalmente con tijeras (tamaño 11 cm) y cortar en tiras pequeñas (2 mm) (Figura 3A).
- Sumergir las tiras IPA en un medio de disociación (MS)10,12 que contenga 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaH 2 PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,03 mM rojo fenol, 10 mM taurina, 0,5 mM EDTA, 2 mM MgCl 2, 11 mM glucosa y 0,16 mM CaCl 2, y ajustar el pH a 7,0 con 1 M NaOH. Incubar las tiras durante 1 h a 4 °C en MS que contengan 1 mg/ml de papaína, 0,04% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,4 mM de 1,4-ditiothreitol (DTT), e incubar a 37 °C durante 15 min. Añadir 1 mg/ml de colagenasa tipo 1A en DM e incubar a 37 °C durante 5 min.
NOTA: La DM es una solución utilizada para preservar la viabilidad celular. La papaína y la colagenasa tipo 1A son enzimas que descomponen las proteínas de la matriz extracelular para aislar células individuales. BSA es una proteína de albúmina sérica utilizada para la estabilización de enzimas durante el almacenamiento y las reacciones enzimáticas. La TDT es un agente reductor utilizado para estabilizar y promover la actividad de las enzimas durante el proceso de aislamiento celular. La taurina es ácido sulfúrico amino utilizado para estabilizar la membrana celular y la integridad celular. - Transfiera los tejidos a MS fresca y disperse mediante una trituración suave utilizando una pipeta de vidrio Pasteur (Figura 3B). Siga triturando hasta que los VSMC aislados se hagan visibles en la solución de baño bajo el microscopio (Figura 3C).
NOTA: Los VSMC recién aislados se pueden utilizar para estudiar la fisiología / fisiopatología vascular, junto con varias investigaciones experimentales, como la modulación por agentes farmacológicos, el análisis electrofisiológico de patch-clamp, las imágenes de calcio, etc. Sin embargo, el presente estudio se centra sólo en la vasorelajación de la IPA aislada utilizando la técnica de baño de órganos.
4. Técnica de baño de órganos
- Aísle IPA como se describió anteriormente en el paso 2. Corte la rama principal del AFI en anillos de ~2 mm de longitud (Figura 2D)13.
- Fijar los anillos IPA en cámaras de baño de órganos (Figura 4) enroscándolos en dos alambres de acero inoxidable de 40 μm de diámetro (Figura 2E)11,13,14.
- Acople cables de acero inoxidable montados con anillos IPA a los transductores de fuerza isométricos conectados al dispositivo de adquisición de datos y al sistema informático instalado con el software fisiológico adecuado para el registro y análisis de datos, luego eleve suavemente la tensión del anillo IPA a 1 g11.
- Deje que los segmentos del vaso se equilibren durante unos 45 minutos a una tensión en reposo de 1 g. Durante el período de equilibrio, asegúrese de que la solución de Krebs se cambie regularmente cada 15 minutos. Después de este período de equilibrio, probar la viabilidad de los vasos midiendo su vasoconstricción a una solución extracelular alta de K+ (80 mM) que contiene 47,4 mM de NaCl, 80 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,5 mM de KH 2 PO 4, 0,5 mM de NaHPO4, 1,8 mM de CaCl 2, 1 mM de MgCl2 y 11 mM de glucosa10,11.
- Evaluar la presencia o ausencia de endotelio calculando la respuesta de relajación a la acetilcolina (1 x 10− 5 M) en anillos precontraídos con fenilefrina (PE, 1 x 10−5 M) (Nótese que las contracciones vasculares permanecen estables durante 1 h después de añadir EP). Considere los anillos como endotelios intactos si cuantifican más del 70% de relajación (Figura 5A). Si tienen menos del 10% de relajación, considere los anillos como desnudos por endotelio13 (Figura 5B). Retire mecánicamente el endotelio frotando suavemente dentro del recipiente con un pequeño alambre para inducir la denudación.
- Nuevamente equilibre los anillos arteriales durante 30 minutos antes del inicio de los experimentos de prueba.
5. Respuesta vasorelajante al extracto de la planta
- Investigar el efecto relajante del extracto de la planta precontrayendo anillos IPA con PE (1 x 10−5 M).
- Luego, agregue cuidadosamente el extracto de la planta (1-1,000 μg / ml) acumulativamente a los anillos intactos del endotelio y los anillos desnudos del endotelio para inducir la vasorelajación (Figura 6A, B) y adquirir una curva de respuesta dependiente de la concentración (Figura 6C).
- Asegúrese de que el efecto del dimetilsulfóxido (DMSO) utilizado como solvente también se evalúe de manera similar para servir como control negativo (Figura 6C).
6. Mecanismo de vasorelajación inducida por extractos vegetales a través del endotelio
- Evaluar el mecanismo de acción vasorelajante del extracto vegetal a través de las vías endotelial de óxido nítrico sintasa (eNOS), ciclooxigenasa (COX)13 y factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF) incubando los anillos IPA intactos del endotelio durante 30 min con los siguientes inhibidores (Figura 7A): 1 x 10−4 M NG-nitro-L-arginina éster metílico (L-NAME, un inhibidor de eNOS)9, 1 x 10−5 M indometacina (un inhibidor de la COX)9, o una combinación de 1 x 10−7 M de apamina (un pequeño bloqueador de los canales de potasio activado por calcio) y 1 x 10−7 M de caribdotoxina (un bloqueador de los canales de potasio activado por calcio de conductancia intermedia y de gran conductancia), antes de inducir contracciones de IPA con 1 x 10−5 M PE.
- Luego, después de que las contracciones para estabilizar PE, agregue concentraciones acumuladas (0.1-1,000 μg / mL) del extracto de la planta.
- Presentar los efectos del extracto vegetal como porcentaje de relajación de los anillos IPA en presencia de inhibidores en comparación con la respuesta de los anillos IPA sin inhibidores (Figura 7B-D) y construir la curva concentración-respuesta.
7. Mecanismo de vasorelajación inducida por extracto vegetal a través de los canales K+ del músculo liso vascular
- Anillos IPA desnudos de endotelio preincubados durante 30 min con 1 x 10−3 M 4-aminopiridina (4-AP), un bloqueador del canal de potasio dependiente de voltaje (KV) (Figura 8A), 1 x 10−5 M glibenclamida, un bloqueador del canal de potasio sensible al ATP (KATP), o 1 x iberiotoxina 10−7 M, un bloqueador de canales K+ activados por Ca 2+ de gran conductancia (KCa), antes de inducir contracciones de IPA con 1 x 10−5 M PE.
- Luego, agregue concentraciones acumuladas del extracto de la planta.
- Presentar los efectos del extracto vegetal como porcentaje de relajación de los anillos IPA con inhibidor en comparación con los anillos IPA sin inhibidor (Figura 8B-D) y construir la curva concentración-respuesta.
8. Mecanismo de vasorelajación inducida por extractos vegetales a través de la inhibición de la afluencia de calcio extracelular (Ca 2+) en VSMCs
- Anillos IPA desnudos de endotelio preincubados durante 30 min en solución de Krebs libre de Ca2+ que contiene 1 mM de etilenglicol-bis (2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA) (Figura 9A).
- Luego, reemplace la solución de baño con una solución de Ca2 + libre-80 mM K+ durante 10 min para despolarizar los VSMC, que luego abren los VOCC (Figura 9A).
- Añadir acumulativamente CaCl2 (0,01-10 mM) para inducir la vasoconstricción del AFI y construir la curva concentración-respuesta (Figura 9A).
- Repita este protocolo en los mismos anillos IPA pero incubarlos previamente con extracto vegetal o 1 μM de nicardipina (bloqueador de canal Ca 2+ tipo L) en Ca2+ que contenga 80 mM de solución K+ durante 10 min seguido de la adición acumulativa de CaCl28.
- Por último, compare la respuesta contráctil con la contracción máxima previamente provocada por los desafíos de control de CaCl2 (Figura 9B).
9. Mecanismo de vasorelajación inducida por extracto vegetal mediante la inhibición de la liberación intracelular de calcio (Ca 2+) del retículo sarcoplásmico (RS)
- Exponga los anillos IPA desnudos de endotelio a una solución K+ de 80 mM durante aproximadamente 5 min, despolarizando los VSMC, abriendo los VOCC y, en última instancia, generando la carga de Ca2+ en el SR (Figura 10A).
- Sustituir la solución de baño durante 10 min por una solución de Krebs libre de Ca2+ que contenga 1 mM de EGTA (Figura 10A).
- Luego, desafíe los anillos IPA con 1 x 10−5 M PE, que activa la vía de fosfolipasa C/IP3 , liberando finalmente Ca2+ de la RS y evocando una contracción transitoria de IPA (Figura 10A).
- Repita el mismo protocolo para determinar contracciones transitorias similares a la EP.
- Vuelva a desafiar los anillos IPA con una solución de 80 mM K+ durante unos 5 minutos, luego reemplace la solución de baño con una solución de Krebs libre de Ca2+ que contenga 1 mM de EGTA con o sin el extracto de la planta durante 10 min.
- Una vez más, desafíe los anillos IPA con 1 x 10−5 M PE.
- Compare las contracciones de IPA inducidas por PE entre la condición con y sin el extracto de la planta (Figura 10B).
10. Análisis estadístico
- Expresar los resultados como media ± SEM. Compare estos valores utilizando la prueba t de Student o analice mediante un análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey-Kramer utilizando un software estadístico adecuado. Considere que las diferencias en p < 0,05 son estadísticamente significativas. Aquí, había n = 6 ratas/protocolo experimental.
NOTA: El registro de vasoconstricción y vasorelajación se puede evaluar con el software adecuado instalado en la computadora. Por ejemplo, la Figura 5A muestra que, cuando los vasos sanguíneos son estimulados por la EP que causa la contracción, esto podría observarse a partir del aumento de la tensión del trazado original. El rastreo se estabilizará en 20-30 minutos, lo que se considera una contracción del 100%. Después de eso, la ACh estimula los vasos sanguíneos, causando relajación, que se pudo observar a partir de la disminución de la tensión del trazado original. Por lo tanto, la tensión reducida se calcula como el porcentaje en comparación con la contracción del 100%.
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Resultados
El protocolo en el presente estudio ha sido desarrollado para determinar las condiciones experimentales óptimas para medir los fenómenos fisiológicos observados en las respuestas vasculares de preparaciones aisladas de IPA. Los experimentos piloto se realizaron para describir los resultados potenciales que ayudan a la comprensión de los efectos vasculares y la base mecanicista de la acción vasorelajante del extracto de la planta, de la siguiente manera.
Efecto vasorelajante del extract...
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Discusión
En este manuscrito, describimos la técnica para el aislamiento de IPA de rata y VSMCs. Se han empleado varios protocolos experimentales para investigar la respuesta vascular de IPA in vitro, que se pueden utilizar para caracterizar el efecto farmacológico y las bases mecanicistas de la vasorelajación de IPA inducida por extracto de planta.
En cuanto a la acción vasodilatadora dependiente del endotelio del extracto vegetal, se emplearon varios bloqueadores como L-NAME (eNOS), indometac...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Consejo Nacional de Investigación de Tailandia, al Centro de Excelencia para la Innovación en Química (PERCH-CIC) y a la Red Internacional de Investigación (IRN61W0005) por brindar apoyo financiero, y al Departamento de Fisiología de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Naresuan, por el apoyo a las instalaciones de investigación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,4-ditiotreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 | |
| 4-aminopiridina (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 | |
| Acetilcolina | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 | |
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 | |
| Bovino albúmina sérica (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 | |
| Chorro de calcio | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 | |
| Caribdotoxina | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 | |
| Colagenasa tipo 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 | De Clostridium histolyticum |
| D(+)- Glucosa monohidrato | Millipore Corporation | K50876942 924 N.º CAS 14431-43-7 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 N.º CAS 67-68-5 | |
| Etilenglicol-bis (2-aminoetiléter)-N,N,N'-ácido tetraacético (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS N.º 67-42-5 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS Nº 60-00-4 | |
| Pinzas 11 cm. | Pinzas Rustless Dumoxel | ||
| 14 cm. | Rustless Dumoxel-Glibenclamide | ||
| Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 | ||
| GraphPad Prism Program | Software version 5.0 (San Diego, CA, EE. UU.) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 | |
| Iberiotoxina | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 | recombinante de Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 | |
| Labchart Program | Software versión 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Cloruro de magnesio | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 | |
| Ratas Wistar macho | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Tailandia | ||
| NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 | |
| Nicardipina | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 | |
| Baño de órganos: 15 mL. | - | - | Pedido específico de los investigadores |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 | DePapaya Látex |
| Feno rojo | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 | |
| Fenilefrina | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 | |
| Cloruro de potasio | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 | |
| Dihidrogenofosfato de potasio | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 | |
| S+A2:E36cloruro de odio | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 | |
| Tijeras 11 cm. | inoxidables | ||
| Sphail 14 cm. | de | ||
| sodio | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 | |
| Dihidrogenofosfato de sodio | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 | |
| Hidróxido de sodio | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 | |
| Tiopental de sodio | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 Nº CAS 107-35-7 | |
| Baño de agua WBU 45 | Memmert | 2766 Nº CAS - |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
