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Bioengineering

आंतों के क्षेत्र-विशिष्ट कार्यक्षमता को मॉडल करने के लिए मानव ऑर्गेनोइड और ऑर्गन-ऑन-ए-चिप प्रौद्योगिकी का संयोजन

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63724
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2,3
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

बायोप्सी-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड और ऑर्गन-ऑन-ए-चिप्स प्रौद्योगिकियों को क्षेत्र-विशिष्ट आंतों की कार्यक्षमता को पुन: प्राप्त करने के लिए एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल प्लेटफॉर्म में जोड़ा जाता है।

Abstract

आंतों का श्लेष्म एक जटिल भौतिक और जैव रासायनिक बाधा है जो महत्वपूर्ण कार्यों के असंख्य को पूरा करता है। यह माइक्रोबायोटा के साथ सहजीवी संबंध को सुविधाजनक बनाते हुए और सूक्ष्मजीवों के आक्रमण को प्रतिबंधित करते हुए पोषक तत्वों और ज़ेनोबायोटिक्स के परिवहन, अवशोषण और चयापचय को सक्षम बनाता है। आंतों के ऊतक होमियोस्टेसिस को स्थापित करने और बनाए रखने के लिए विभिन्न सेल प्रकारों और उनके भौतिक और जैव रासायनिक वातावरण के बीच कार्यात्मक बातचीत महत्वपूर्ण है। इन जटिल इंटरैक्शन और एकीकृत आंतों के शरीर विज्ञान को इन विट्रो में मॉडलिंग करना नए चिकित्सीय लक्ष्यों और दवा उम्मीदवारों की खोज और विकास के तरीके को बदलने की क्षमता के साथ एक दुर्जेय लक्ष्य है।

ऑर्गेनोइड्स और ऑर्गन-ऑन-ए-चिप प्रौद्योगिकियों को हाल ही में आंतों के शरीर विज्ञान और इन विट्रो में पैथोफिजियोलॉजी के कार्यात्मक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त मानव-प्रासंगिक आंत चिप्स उत्पन्न करने के लिए जोड़ा गया है। छोटी (ग्रहणी) और बड़ी आंत की बायोप्सी से प्राप्त ऑर्गेनोइड को एक अंग चिप के शीर्ष डिब्बे में वरीयता दी जाती है और फिर प्रत्येक आंतों के क्षेत्र की विशिष्ट सेलुलर, आणविक और कार्यात्मक विशेषताओं को संरक्षित करते हुए मोनोलेयर के रूप में सफलतापूर्वक विस्तार किया जाता है। मानव आंत ऊतक-विशिष्ट माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को उपकला-एंडोथेलियल इंटरफ़ेस को फिर से बनाने के लिए अंग चिप के निचले डिब्बे में शामिल किया जाता है। यह उपन्यास मंच पोषक तत्वों, दवाओं और सूक्ष्मजीवों के लिए ल्यूमिनल एक्सपोजर की सुविधा प्रदान करता है, आंतों के परिवहन, पारगम्यता और मेजबान-सूक्ष्मजीव इंटरैक्शन के अध्ययन को सक्षम करता है।

यहां, मानव ग्रहणी (ग्रहणी चिप) और बृहदान्त्र (बृहदान्त्र चिप) का प्रतिनिधित्व करने वाले आंत चिप्स की स्थापना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, और निरंतर प्रवाह और पेरिस्टलसिस जैसी विकृतियों के तहत उनकी बाद की संस्कृति। हम प्रोटोटाइपिकल इंड्यूसर और सब्सट्रेट का उपयोग करके ग्रहणी चिप में दवा चयापचय और सीवाईपी 3 ए 4 प्रेरण का आकलन करने के तरीकों का प्रदर्शन करते हैं। अंत में, हम बृहदान्त्र चिप में इंटरफेरॉन गामा (आईएफएन) -मध्यस्थता बाधा व्यवधान (टपका हुआ आंत सिंड्रोम) के इन विट्रो मॉडलिंग के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करते हैं, जिसमें पैरासेल्युलर पारगम्यता के परिवर्तन, साइटोकिन स्राव में परिवर्तन और चिप के भीतर कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग का मूल्यांकन करने के तरीके शामिल हैं।

Introduction

मानव आंत एक जटिल और मल्टीटास्किंग अंग है जो आत्म-उत्थान में सक्षम है। यह छोटी और बड़ी आंत में विभाजित है। छोटी आंत का प्राथमिक कार्य पेट से आने वाले भोजन को पचाना, सभी पोषक तत्वों को अवशोषित करना और बड़ी आंत पर अवशेषों को पारित करना है, जो पानी और इलेक्ट्रोलाइट्स को पुनर्प्राप्त करता है। छोटी आंत को आगे कई शारीरिक रूप से अलग-अलग क्षेत्रों में विभाजित किया गया है: ग्रहणी, जेजुनम और इलियम, जिनमें से प्रत्येक को विशिष्ट कार्यों को करने के लिए अनुकूलित किया जाता है। उदाहरण के लिए, ग्रहणी जेजुनम में प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, विटामिन और खनिजों से जुड़े पोषक तत्वों के उचित अवशोषण को सक्षम करने के लिए चाइम (पेट की सामग्री) को तोड़ने में मदद करता है। छोटी आंत का यह समीपस्थ हिस्सा आंतों की दवा अवशोषण और चयापचय की मुख्य साइट भी है, और यह इलियम और बृहदान्त्र1 में उनकी अभिव्यक्ति की तुलना में दवा-चयापचय एंजाइमों (जैसे, सीवाईपी 3 ए 4) की उच्च अभिव्यक्ति की विशेषता है। पोषक तत्वों को पचाने और अवशोषित करने में इसकी मुख्य भूमिका के अलावा, आंत संभावित हानिकारक ल्यूमिनल सामग्री, जैसे रोगजनक सूक्ष्मजीवों, माइक्रोबियल चयापचयों, आहार एंटीजन और विषाक्त पदार्थों 2,3 के खिलाफ एक प्रभावी बाधा भी है। यह उल्लेखनीय है कि मानव बृहदान्त्र बड़ी संख्या में सूक्ष्मजीवों द्वारा बसा हुआ है, जो मानव शरीर में कुल कोशिकाओं से कहीं अधिक है, जो पोषण, चयापचय और प्रतिरक्षा के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं। इसलिए, आंतों के उपकला कोशिकाओं द्वारा गठित श्लेष्म बाधा की अखंडता का रखरखाव आंत माइक्रोबायोटा और मेजबान कोशिकाओं के बीच सहजीवी संबंधों को अनावश्यक प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण से बचने के लिए शारीरिक रूप से अलग करने की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है2. इसके अलावा, क्रमादेशित आंतों की कोशिका मृत्यु एक आत्म-सुरक्षात्मक तंत्र के रूप में एक आवश्यक भूमिका निभाती है जो संक्रमित कोशिकाओं को जारी रखने या प्रसार करने से रोकती है- जिससे संभावित रोगजनकोंका प्रसार होता है 3-जबकि हर चार से सात दिनों में आंतों के उपकला का निरंतर आत्म-नवीकरण कोशिका हानि के लिए क्षतिपूर्ति करता है जो बाधा अखंडता और ऊतक होमियोस्टेसिस सुनिश्चित करता है। पोषक तत्वअवशोषण, बाधा अखंडता, या आंतों की कोशिका मृत्यु और आत्म-नवीकरण में असंतुलन सहित वर्णित आंतों के कार्यों की हानि, कुपोषण और सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) 2,3 सहित गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों की एक श्रृंखला के विकास के परिणामस्वरूप हो सकती है।

इससे पहले, मानव आंतों के ऊतकों के शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल कार्यों का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल और परिवर्तित कैंसर-व्युत्पन्न आंतों की कोशिका रेखाओं का उपयोग किया गया है। हालांकि, दो प्रजातियों के बीच महत्वपूर्ण असमानताओं की उपस्थिति के कारण मनुष्यों के लिए पशु अनुसंधान की अनुवादशीलता के बारे में तेजी से प्रमुख चिंताओं ने मानव-प्रासंगिक वैकल्पिक तरीकों की आवश्यकता पर प्रकाश डाला4. आमतौर पर इन विट्रो आंतों की सेल लाइनों में टी 84, कैको -2 और एचटी 29 कोशिकाएं शामिल हैं। जबकि वे आंतों के अवरोध समारोह और झिल्ली परिवहन के कुछ पहलुओं की नकल करते हैं, उन्हें दवा चयापचय एंजाइम5, सतह रिसेप्टर्स और ट्रांसपोर्टरों4 की एक परिवर्तित अभिव्यक्ति की विशेषता है। इसके अलावा, उनके पास आंतों के खंड विशिष्टता की कमी होती है और आंतों के उपकला की जटिलता को दोहराने में विफल रहते हैं, प्रत्येक मॉडल में आंत में मौजूद पांच उपकला कोशिका प्रकारों में से केवल एकहोता है 6.

हाल ही में, छोटी आंत और बृहदान्त्र 7,8 या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) 9 की ताजा बायोप्सी से स्थापित मानव आंतों के ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को भविष्य में पशु प्रयोग के पूरक, कम करने और शायद बदलने की क्षमता के साथ वैकल्पिक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में पेश किया गया था। जबकि आईपीएससी को गैर-आक्रामक तरीके से प्राप्त किया जा सकता है, आईपीएससी से ऑर्गेनोइड स्थापित करने के लिए जटिल और लंबे प्रोटोकॉल (कई प्रयोगात्मक चरणों के साथ) के उपयोग की आवश्यकता होती है और मानव भ्रूण के ऊतकों से मिलती-जुलती संस्कृतियां उत्पन्न होती हैं। इसके विपरीत, बायोप्सी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड अत्यधिक स्केलेबल हैं, क्योंकि वे आंतों के ऊतकों की अंतर्निहित नवीकरण क्षमता का लाभ उठा सकते हैं और इन विट्रो में अनिश्चित काल तक पारित और प्रचारित किए जा सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, बायोप्सी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड प्राथमिक ऊतक की बीमारी और आंतों के क्षेत्र-विशिष्ट विशेषताओं को बनाए रखते हैं जिससे वे विकसित किए गए थे और आंतों के उपकला की सेलुलर विविधता का अनुकरण करते हैं। ऑर्गेनोइड का उपयोग विभिन्न गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों के जीव विज्ञान और रोगजनन को उजागर करने और उनके चिकित्सीय प्रबंधन में सुधार करने के लिए इन विट्रो में रोगी-विशिष्ट अवतारों के रूप में किया जा सकता है। यद्यपि आंतों के ऑर्गेनोइड ने शारीरिक कार्यक्षमता की एक प्रभावशाली डिग्री हासिल की है, फिर भी वे महत्वपूर्ण स्ट्रोमल घटकों की कमी के कारण देशी अंगों की जटिलता को पुन: उत्पन्न करने में विफल रहते हैं- जिसमें रक्त वाहिकाओं, संयोजी ऊतक, परिधीय तंत्रिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं-साथ ही यांत्रिक उत्तेजना भी शामिल है। यांत्रिक पैरामीटर, जैसे प्रवाह, कतरनी तनाव, खिंचाव और दबाव, विवो में ऊतक मॉर्फोजेनेसिस और होमियोस्टेसिस को प्रभावित करने के लिए जाने जाते हैं और पहले इन विट्रो10,11,12,13 में कोशिकाओं की परिपक्वता में सुधार करने के लिए दिखाए गए थे। ऑर्गेनोइड सिस्टम का एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण दोष लुमेन की दुर्गमता है और इस प्रकार, उपकला के एपिकल पक्ष के लिए। यह आयन और ड्रग ट्रांसपोर्टरों, होस्ट-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन और फार्मास्युटिकल विषाक्तता परीक्षण की ध्रुवीकृत अभिव्यक्ति से जुड़े विभिन्न तंत्रों की जांच के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करता है। अंत में, ऑर्गेनोइड संस्कृतियां आकार, आकृति विज्ञान और कार्य में काफी परिवर्तनशीलता से पीड़ित हैं, इन विट्रो स्व-संगठन प्रक्रिया और सेल भाग्य विकल्पों की स्टोकेस्टिक प्रकृति के कारण। इसलिए, रोग मॉडलिंग, ड्रग स्क्रीनिंग और पुनर्योजी चिकित्सा में आंतों के ऑर्गेनोइड की पूरी क्षमता का एहसास करने के लिए, नई रणनीतियों का पता लगाना आवश्यक है जो ऑर्गेनोइड विकास में परिवर्तनशीलता को कम करते हैं, ल्यूमिनल डिब्बे तक पहुंच में सुधार करते हैं, और लापता सेल-सेल इंटरैक्शन को शामिल करते हैं।

ऑर्गन-ऑन-ए-चिप तकनीक ने इन विट्रो में आंतों की कोशिका संस्कृतियों में यांत्रिक बलों और द्रव प्रवाह को शामिल करने के लिए कई तकनीकों को पेश किया है। हालांकि, चूंकि अधिकांश प्रारंभिक प्रमाण-अवधारणा अध्ययनों ने कैंसर-व्युत्पन्न सेल लाइनों का उपयोग किया है जो पर्याप्त सेलुलर विविधता का प्रदर्शन नहीं करते हैं, इसलिए इन प्रणालियों की प्रासंगिकता पर सवाल उठाया गया है। हाल ही में, हमने आंतों के ऑर्गेनोइड और ऑर्गन-ऑन-ए-चिप तकनीक को सहक्रियात्मक रूप से जोड़ा है ताकि प्रत्येक दृष्टिकोण की सर्वोत्तम विशेषताओं को इन विट्रो सिस्टम14,15,16 में शामिल किया जा सके। परिणामस्वरूप आंत-चिप आंतों के उपकला के बहुकोशिकीय वास्तुकला, उपकला-एंडोथेलियल ऊतक इंटरफ़ेस की उपस्थिति, और द्रव प्रवाह और खिंचाव के यांत्रिक बलों को दोहराता है, जो इन विट्रो में अंग-स्तरीय कार्यों के अनुकरण को सक्षम करता है। इसके अतिरिक्त, प्रारंभिक सामग्री के रूप में प्राथमिक-ऊतक-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड (जिसे मानव आंत के विभिन्न क्षेत्रों से नमूना लिया जा सकता है) का उपयोग इस मॉडल की बहुमुखी प्रतिभा को बढ़ाता है, क्योंकि मानव ग्रहणी, जेजुनम, इलियम और बृहदान्त्र का प्रतिनिधित्व करने वाले चिप्स समान बोने और संस्कृति प्रक्रियाओं के बाद स्थापित किए जा सकते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि आंत-चिप्स वास्तविक समय के मूल्यांकन को सक्षम करते हैं: आंतों की बाधा अखंडता; ब्रश सीमा और दवा-चयापचय एंजाइमों की गतिविधि; म्यूकिन का उत्पादन; साइटोकिन्स का स्राव; और रोगजनक और कमेंसल सूक्ष्मजीवों के साथ आंतों की कोशिकाओं की बातचीत, जैसा कि पहले प्रकाशित रिपोर्टों में दिखाया गया है। विशेष रूप से, जब विभिन्न व्यक्तियों के ऊतकों से उत्पन्न ऑर्गेनोइड का उपयोग करके आंत के चिप्स स्थापित किए गए थे, तो इन मॉडलों ने विभिन्न दवाओं और उपचारों के कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं में अपेक्षित अंतर-दाता परिवर्तनशीलता पर कब्जा कर लिया। कुल मिलाकर, ऑर्गन-ऑन-ए-चिप तकनीक के साथ ऑर्गेनोइड को विलय करने से विवो-प्रासंगिक मॉडल में अधिक उन्नत, व्यक्तिगत, दरवाजा खुलता है जो इन विट्रो निष्कर्षों की शारीरिक प्रासंगिकता और सटीकता के साथ-साथ मनुष्यों के लिए उनके एक्सट्रपलेशन में सुधार कर सकता है। यहां, दो आंतों के खंडों के शारीरिक कार्यों के अध्ययन में आंत चिप और इसके आवेदन की स्थापना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है: ग्रहणी और बृहदान्त्र। सबसे पहले, ग्रहणी चिप में दवा-चयापचय एंजाइम सीवाईपी 3 ए 4 की गतिविधि का आकलन करने के तरीकों के साथ-साथ रिफैम्पिसिन और विटामिन डी 3 जैसे प्रोटोटाइपिकल यौगिकों द्वारा इसके प्रेरण का वर्णन किया गया है। दूसरे, बृहदान्त्र चिप में "टपका हुआ आंत" मॉडल करने के लिए आवश्यक कदम प्रोटोकॉल में उल्लिखित हैं, उपकला बाधा के विघटन के साथ आईबीडी के रोगजनन में फंसे हॉलमार्क साइटोकिन्स का उपयोग करके किया जा रहा है। संक्षेप में, मानव बायोप्सी से प्राप्त ऑर्गेनोइड को इन विट्रो में प्रचारित किया जाता है, एंजाइमी पाचन के अधीन किया जाता है, और चिप के शीर्ष चैनल में पेश किया जाता है। विकास-कारक-समृद्ध मीडिया के साथ निरंतर छिड़काव की उपस्थिति में वे 3 डी वास्तुकला और आसानी से सुलभ एपिकल सेल सतह के साथ एक संगम उपकला मोनोलेयर में विकसित होते हैं। नीचे, "संवहनी" चिप डिब्बे को छोटी या बड़ी आंत से अलग माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ वरीयता दी जाती है। उपकला और एंडोथेलियम को एक छिद्रपूर्ण खिंचाव झिल्ली द्वारा अलग किया जाता है, जो दो ऊतकों के बीच पैराक्राइन इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान करता है और, जब चक्रीय विकृतियों के अधीन होता है, तो मानव आंत के पेरिस्टलसिस जैसी गति का अनुकरण करता है। सह-संस्कृति को उचित सेल संस्कृति मीडिया के साथ ल्यूमिनल और संवहनी छिड़काव द्वारा उत्पन्न गतिशील प्रवाह स्थितियों के तहत बनाए रखा जाता है। अंत में, हम कई प्रकार के परख और समापन बिंदु विश्लेषणों का वर्णन करते हैं जिन्हें सीधे ऑन-चिप या नमूना सेल संस्कृति प्रवाह से किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: सभी सेल संस्कृतियों को उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करके संभाला जाना चाहिए।

इस अध्ययन में नियोजित मानव आंतों के ऑर्गेनोइड जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय से प्राप्त किए गए थे और सभी तरीकों को अनुमोदित दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किया गया था। सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी #NA 00038329) द्वारा अनुमोदित किए गए थे।

1. सेल संस्कृति अभिकर्मकों की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) का पालन करते हुए मानव ऑर्गेनोइड विकास माध्यम तैयार करें और इसे प्राइमोसिन के 100 μg /
  2. निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) का पालन करते हुए मानव माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम तैयार करें और प्राइमोसिन के 100 μg / मिलीलीटर के बजाय 1:20 वॉल्यूम / वॉल्यूम एफबीएस और 50 μg / मिलीलीटर के साथ पूरक करें।
  3. 10 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए डीपीबीएस में बाँझ 0.1% बीएसए में वाई -27632 (रो-किनेज अवरोधक) को फिर से निलंबित करें। बाँझ माइक्रोट्यूब में विभाज्य और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 5 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए बाँझ डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में सीएचआईआर 99021 (जीएसके -3 अवरोधक) को फिर से निलंबित करें। बाँझ माइक्रोट्यूब में विभाज्य और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. वॉल्यूम ऑर्गेनोइड पृथक्करण समाधान (सामग्री की तालिका) को डीपीबीएस समाधान (सामग्री की तालिका) के साथ मिलाकर और वाई -27632 के 10 μM स्टॉक समाधान के साथ पूरक करके मानव ऑर्गेनोइड पाचन समाधान तैयार करें। इस अभिकर्मक को प्रत्येक उपयोग के लिए ताजा बनाया जाना चाहिए।

2. मानव आंतों माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआईएमईसी) की संस्कृति

  1. चिप पर बोने से 7 दिन पहले एचआईएमईसी संस्कृति (सामग्री की तालिका) शुरू करें। चिप सीडिंग के लिए मार्ग 1-6 पर केवल एचआईएमईसी का उपयोग किया जा सकता है।
  2. एक टी 150 फ्लास्क में अनुलग्नक कारक समाधान (सामग्री की तालिका) के 5 एमएल जोड़ें; 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और समाधान त्यागें।
  3. फ्लास्क में कमरे के तापमान पर पूर्व-गर्म एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम के 19 एमएल जोड़ें (चरण 1.2 देखें)।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एचआईएमईसी (2 मिलियन कोशिकाओं / शीशी) की एक जमे हुए शीशी को पिघलाएं।
  5. शीशी की सामग्री को फ्लास्क में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए धीरे-धीरे फ्लास्क को रॉक करें। एंडोथेलियल कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति देने के लिए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में फ्लास्क रखें।
  6. अगले दिन और उसके बाद हर 3 दिनों में कमरे के तापमान पर पूर्व-गर्म एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ माध्यम को बदलें। संस्कृतियों चिप प्रयोगों के लिए सेल फसल के दिन संगम के 90% तक पहुँचना चाहिए.

3. माइक्रोफैब्रिकेशन और चिप की तैयारी

  1. एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता (सामग्री की तालिका) से चिप्स प्राप्त करें। चिप्स को अनपैक करें और उन्हें एक वर्ग पेट्री डिश (सामग्री की तालिका) में रखे चिप पालने में रखें। प्रयोगात्मक शर्तों (चित्रा 1 ए) के साथ प्रत्येक चिप वाहक के सामने की तरफ लेबल।
    नोट: जबकि प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चिप और इंस्ट्रूमेंटेशन के उपयोग पर निर्भर करता है, विभिन्न विक्रेताओं के माध्यम से पेश किए गए कई माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस हैं, जो वैकल्पिक फायदे प्रदान कर सकते हैं लेकिन खिंचाव को शामिल करने की क्षमता की कमी है। इसके अलावा, ऑर्गन-ऑन-चिप्स के माइक्रोफैब्रिकेशन को हुह एट अल .21 में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद "घर में" किया जा सकता है।

4. झिल्ली की सक्रियण और ईसीएम कोटिंग

  1. सक्रियण समाधान की तैयारी
    1. उपयोग से पहले संतुलित करने के लिए कमरे के तापमान पर ईआर -1 और ईआर -2 अभिकर्मकों (सामग्री की तालिका) लाएं। ईआर -1 प्रकाश संवेदनशील है और इसे अंधेरे में संभाला जाना चाहिए।
    2. एमएल की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए ईआर -2 अभिकर्मक के 10 एमएल में ईआर -1 का पुनर्गठन करें और पुष्टि करें कि ईआर -1 पूरी तरह से भंग हो गया है।
  2. सतह सक्रियण
    1. चिप (चित्रा 1 ए) के दोनों चैनलों के माध्यम से ईआर -1 समाधान के 50 μL को धीरे से धक्का दें।
    2. एस्पिरेटर का उपयोग करके चिप की सतह से किसी भी अतिरिक्त ईआर -1 समाधान को हटा दें।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए चिप्स का निरीक्षण करें कि सभी चिप्स को ईआर -1 समाधान प्राप्त हुआ है। हवा के बुलबुले के मामले में, बुलबुले पूरी तरह से हटा दिए जाने तक अधिक ईआर -1 समाधान पेश करें।
    4. 15 मिनट के लिए यूवी दीपक कक्ष (सामग्री की तालिका) के अंदर चिप्स सेते हैं। पुष्टि करें कि यूवी लैंप सुसंगत सेटिंग पर सेट है।
    5. ईआर -1 सक्रिय चिप्स को जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में वापस लाएं। दोनों चैनलों से ईआर -1 समाधान की आकांक्षा करें। ईआर -2 के 200 μL के साथ ईआर -1 समाधान के किसी भी अवशेष को धो लें।
    6. चैनलों (सामग्री की तालिका) के माध्यम से बाँझ डलबेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीबीपीएस) के 200 μL पुश करें और अगले चरण तक चैनलों में डीबीपीएस छोड़ दें।
  3. बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) और झिल्ली कोटिंग की तैयारी
    1. ईसीएम घटकों के स्टॉक समाधान की तैयारी
      1. एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ सेल संस्कृति ग्रेड पानी (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके कोलेजन चतुर्थ (सामग्री की तालिका) और फाइब्रोनेक्टिन (सामग्री की तालिका) का पुनर्गठन करें। विभाज्य तैयार करें और उपयोग होने तक उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. झिल्ली कोटिंग के लिए ईसीएम काम समाधान की तैयारी
      1. लेपित होने के लिए प्रत्येक 12 चिप्स के लिए ऊपर और नीचे चैनल के लिए प्रत्येक ईसीएम समाधान का 1.5 एमएल तैयार करें। ईसीएम समाधान हमेशा उपयोग से ठीक पहले तैयार किया जाना चाहिए।
      2. शीर्ष चैनल के लिए, क्रमशः 200 μg/mL और 100 μg/mL पर बाँझ ठंड डीबीपीएस में कोलेजन चतुर्थ और घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (बीएमएम) (सामग्री की तालिका) मिलाएं। नीचे चैनल के लिए, क्रमशः 200 μg / एमएल और 30 μg / एमएल पर बाँझ ठंड डीपीबीएस में कोलेजन चतुर्थ और फाइब्रोनेक्टिन मिलाएं।
    3. चिप्स की ईसीएम कोटिंग
      1. चिप्स के दोनों चैनलों से डीबीपीएस की आकांक्षा करें और प्रत्येक चैनल (चित्रा 1 ए) के लिए उपयुक्त ईसीएम कामकाजी समाधान के साथ प्रतिस्थापित करें।
      2. यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक चिप का निरीक्षण करें कि इसे कोटिंग समाधान प्राप्त हुआ है। हवा के बुलबुले के मामले में, अधिक कोटिंग समाधान के माध्यम से धक्का दें जब तक कि सभी बुलबुले पूरी तरह से हटा नहीं दिए जाते।
      3. चिप पालना करने के लिए बाँझ डीपीबीएस जोड़ें और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में चिप्स युक्त पेट्री डिश जगह। सक्रिय पीडीएमएस झिल्ली के साथ आयनिक बांड बनाने के लिए ईसीएम प्रोटीन की अनुमति देने के लिए रात भर सेते हैं। यदि वांछित है, तो चिप्स की कोटिंग के बाद कोशिकाओं को 2 घंटे और 1 दिन के बीच कभी भी वरीयता दी जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, लेपित चिप्स को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, इसके बाद रात भर इनक्यूबेशन 37 डिग्री सेल्सियस और चिप बोने पर।

5. चिप के निचले चैनल में आंतों के माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआईएमईसी) का बीजारोपण

नोट: छोटे आंतों और कोलोनिक एचआईएमईसी को क्रमशः ग्रहणी और बृहदान्त्र चिप के निचले चैनल में वरीयता दी जाती है।

  1. चिप्स तैयार करें
    1. बीएससी में ईसीएम-लेपित चिप्स स्थानांतरित करें। चिप्स के दोनों चैनलों से ईसीएम कोटिंग को धीरे-धीरे एस्पिरेट करें, और फिर क्रमशः ऑर्गेनोइड ग्रोथ मीडियम और एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम के 200 μL के साथ दोनों चैनलों को धो लें।
    2. एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीजारोपण के साथ आगे बढ़ने तक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में धोए गए चिप्स को स्टोर करें।
  2. एंडोथेलियल कोशिकाओं की कटाई करें
    1. एचआईएमईसी संस्कृति फ्लास्क को बीएससी में लाएं और बाँझ डीपीबीएस का उपयोग करके धो लें।
    2. कुप्पी करने के लिए पृथक्करण समाधान के 3 एमएल जोड़ें और पूर्ण सेल टुकड़ी के लिए अनुमति देने के लिए 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह है।
    3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा और 10 मिलीलीटर तक पहुँचने तक एंडोथेलियल सेल विकास मीडिया जोड़ें। सेल गिनती के लिए सेल निलंबन के नमूना 15-20 μL। 5 मिनट के लिए 150 x g पर अपकेंद्रित्र।
    4. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा और एंडोथेलियल सेल विकास मीडिया में 8-10 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व के लिए एचआईएमईसी को फिर से निलंबित करें।
  3. चिप के निचले चैनल में बीज एंडोथेलियल कोशिकाएं
    1. बीएससी करने के लिए चिप्स युक्त पेट्री डिश लाओ और धीरे एक 1,000 μL विंदुक का उपयोग कर नीचे चैनल से सभी मीडिया को हटा दें।
    2. चिप के निचले चैनल में एचआईएमईसी निलंबन के 10-15 μL का परिचय दें। चैनल (चित्रा 1 डी) के भीतर इष्टतम बोने घनत्व (कवरेज का 80% -90%) और समरूप सेल वितरण सुनिश्चित करने के लिए बोने के ठीक बाद चिप का निरीक्षण करें। यदि बोने का घनत्व अपेक्षित या असमान से अधिक या कम है, तो एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडिया के 200 μL के साथ चैनल 2x को धो लें और बोने की प्रक्रिया को दोहराएं।
    3. पीडीएमएस झिल्ली के निचले हिस्से में एंडोथेलियल सेल लगाव की अनुमति देने के लिए छह चिप्स के प्रत्येक बैच को बोने के तुरंत बाद पेट्री डिश को पलटें। पेट्री व्यंजनों को 30 मिनट से 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें, या जब तक कि नीचे के चैनल में एचआईएमईसी झिल्ली (चित्रा 1 डी) से जुड़े न हों।
  4. चिप्स को धो लें
    1. धीरे किसी भी असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने और मीडिया में पोषक तत्वों को फिर से भरने के लिए नीचे चैनल इनलेट के माध्यम से एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडिया के 200 μL धक्का।
    2. उन कोशिकाओं को धो लें जो 5 μM CHIR99021 और 10 μM Y-27632 के साथ पूरक ऑर्गेनोइड विकास माध्यम के 200 μL के साथ शीर्ष चैनल में संलग्न नहीं थे।
    3. उपकला सेल सीडिंग के लिए आगे बढ़ने तक चिप्स को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।

6. चिप के शीर्ष चैनल में ऑर्गेनोइड टुकड़ों का बीजारोपण

नोट: विभिन्न आंतों के क्षेत्रों की बायोप्सी से पृथक ऑर्गेनोइड आंत चिप7 में सुसंस्कृत किया जा सकता है। मानव आंतों के क्रिप्ट्स के अलगाव और ऑर्गेनोइड संस्कृतियों की स्थापना के लिए फ़ूजी एट अल में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करें22. यहां, ग्रहणी और कोलोनिक ऑर्गेनोइड का उपयोग क्रमशः ग्रहणी और बृहदान्त्र चिप्स उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। ऑर्गेनोइड गठन और विकास में उच्च बैच-टू-बैच और दाता-से-दाता परिवर्तनशीलता को देखते हुए, 8 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के इष्टतम बोने घनत्व को प्राप्त करने के लिए ऑर्गेनोइड निलंबन संस्कृति (24-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप) में सेल घनत्व का पायलट मूल्यांकन करने का सुझाव दिया जाता है।

  1. स्थैतिक ऑर्गेनॉइड संस्कृति के सेल नंबर /कुएं का पायलट मूल्यांकन।
    नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया पूरी तरह से चिप बोने के लिए आवश्यक ऑर्गेनोइड निलंबन संस्कृति के कुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए है। परिणामी एकल कोशिकाओं का उपयोग चिप बोने के लिए नहीं किया जाना चाहिए।
    1. ऑर्गेनोइड संस्कृति प्लेट के तीन कुओं से सतह पर तैरनेवाला सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। प्रत्येक कुएं में बर्फ-ठंडा बीएमएम पृथक्करण समाधान (सामग्री की तालिका) के 500 μL जोड़ें और प्लास्टिक से घुलनशील बीएमएम को अलग करने के लिए प्लास्टिक खुरचनी का उपयोग करें।
    2. एक बर्फ ठंडा 1,000 μL विंदुक का उपयोग कर एक बाँझ कम प्रोटीन बाध्यकारी शंक्वाकार ट्यूब में ऑर्गेनोइड निलंबन ले लीजिए। 60 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं, धीरे ट्यूब मिलाते हुए हर 15 मिनट मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
    3. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और ट्रिप्सिन के 2 मिलीलीटर जोड़ें। एकल कोशिका स्तर पर ऑर्गेनोइड को पचाने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और एंजाइमी प्रतिक्रिया को रोकने के लिए पूर्ण ऑर्गेनोइड विकास माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
    4. पूर्ण ऑर्गेनोइड विकास माध्यम के 1 मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और मानक विधियों के अनुसार हेमटोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें।
  2. ऑर्गेनोइड टुकड़ों की तैयारी और चिप में उनके बीजारोपण
    नोट: चिप के शीर्ष चैनल में ग्रहणी या कोलोनिक ऑर्गेनोइड बीज के लिए निम्नलिखित प्रक्रियाओं का उपयोग किया जा सकता है। इन विवो प्रासंगिक 3 डी साइटोआर्किटेक्चर के साथ एक उपकला मोनोलेयर की स्थापना प्रवाह15,23 की उपस्थिति और ऑर्गेनोइड टुकड़ों के सफल बोने पर आकस्मिक है।
    1. ध्यान से स्थिर ऑर्गेनोइड संस्कृति के कुओं की संख्या से माध्यम की आकांक्षा करें, जो पर्याप्त है, जैसा कि चरण 6.1 में निर्धारित किया गया है, 8 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के अंतिम बीजारोपण घनत्व को प्राप्त करने के लिए। प्रत्येक कुएं में बर्फ-ठंडा बीएमएम पृथक्करण समाधान के 500 μL जोड़ें।
    2. एक प्लास्टिक खुरचनी या 1,000 μL विंदुक का उपयोग कर कुओं की सतह से घुलनशील बीएमएम को अलग करें। एक 15 एमएल कम प्रोटीन बाध्यकारी शंक्वाकार ट्यूब में निलंबन ले लीजिए।
    3. 60 मिनट के लिए बर्फ पर निलंबन स्टोर, धीरे ट्यूब मिलाकर हर 15 मिनट मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए आगे बढ़ें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद एक अच्छी तरह से परिभाषित ऑर्गेनोइड गोली दिखाई देनी चाहिए। यदि सेल गोली (घुलनशील बीएमएम के अवशेष) (चित्रा 1 बी) के ऊपर एक पारदर्शी जेल परत देखी जाती है, तो निम्नलिखित चरणों के साथ आगे बढ़ें।
      1. सतह पर तैरनेवाला और सेल गोली मिश्रण और ट्यूब में बीएमएम पृथक्करण समाधान की एक समान मात्रा जोड़ें। धीरे मिश्रण और एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए बर्फ पर स्टोर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए आगे बढ़ें।
      2. यदि आवश्यक हो, तो चरण 6.2.3.1 दोहराएं जब तक कि कोई घुलनशील बीएमएम अवशेष मौजूद न हों।
    4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ऑर्गेनोइड पाचन समाधान के साथ ऑर्गेनोइड गोली को फिर से निलंबित करें (चरण 1.5 देखें)। गोली के पूर्ण डूबने को सुनिश्चित करने के लिए ऑर्गेनोइड पाचन समाधान की पर्याप्त मात्रा का उपयोग करें। समाधान का 2 एमएल लगभग 2,400-12,000 मध्यम आकार के ऑर्गेनोइड (चित्रा 1 डी, पोस्ट-सीडिंग) के लिए उपयुक्त है। 1-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. एंजाइमी प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ट्यूब में उन्नत डीएमईएम / एफ -12 जोड़ें। उपयोग किए गए पाचन समाधान की मात्रा का चार गुना उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
    6. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा और 8 मिलियन कोशिकाओं / एमएल को प्राप्त करने के लिए 5 μM CHIR99021 और 10 μM Y-27632 के साथ पूरक एक पूर्ण ऑर्गेनोइड विकास माध्यम में ऑर्गेनोइड टुकड़े गोली को फिर से निलंबित करें। दीवारों पर लगाव के कारण सेल घनत्व में कमी को रोकने के लिए बाँझ 1.5 एमएल कम प्रोटीन बाध्यकारी ट्यूबों में निलंबन के 360 μL विभाज्य तैयार करें।
    7. लेपित चिप्स के शीर्ष चैनल से माध्यम निकालें। प्रत्येक चिप के शीर्ष चैनल में सेल निलंबन के 30 μL जोड़ें। ईसीएम लेपित झिल्ली (चित्रा 1 डी) का पालन करने के लिए ऑर्गेनोइड टुकड़े की अनुमति देने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर चिप्स सेते हैं।

7. आंत चिप की गतिशील संस्कृति - दीक्षा, और प्रवाह और पेरिस्टलसिस जैसी गति का रखरखाव

  1. मीडिया की तैयारी और विघटन
    1. चिप के माध्यम से निरंतर लामिना के प्रवाह को बनाए रखने के लिए, मीडिया तापमान को कमरे के तापमान पर संतुलित करने की अनुमति दें, और फिर वैक्यूम पंप और पीवीडीएफ फ़िल्टर शंक्वाकार ट्यूबों (मीडिया डिगैसिंग) का उपयोग करके 10 मिनट के लिए वैक्यूम-चालित निस्पंदन के अधीन करें।
  2. पोर्टेबल मॉड्यूल का भड़काना
    नोट: पोर्टेबल मॉड्यूल जलाशय हैं जो चिप्स और संस्कृति मॉड्यूल के बीच एक इंटरफ़ेस के रूप में कार्य करते हैं जो मीडिया के नमूने और खुराक को दोहराने की अनुमति देते हैं।
    1. बीएससी में पोर्टेबल मॉड्यूल खोलें, और उन्हें संस्कृति मॉड्यूल ट्रे पर रखें, जो पोर्टेबल मॉड्यूल के संरेखण के लिए विशेष कंटेनर हैं।
    2. शीर्ष इनलेट जलाशय में 5 μM CHIR99021 और 10 μM Y-27632 के साथ पूरक पूर्व-संतुलित पूर्ण ऑर्गेनोइड विकास माध्यम के 3 मिलीलीटर और नीचे इनलेट जलाशय (चित्रा 1 सी) में पूर्व-संतुलित एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम के 3 एमएल जोड़ें। संबंधित आउटलेट जलाशयों में एक ही मीडिया के 300 μL जोड़ें।
    3. ट्रे को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लाएं और उन्हें संस्कृति मॉड्यूल (चित्रा 1 सी) में स्लाइड करें। "प्राइम साइकिल" (1 मिनट लंबा) चलाने के लिए संस्कृति मॉड्यूल की स्क्रीन पर नियंत्रण का उपयोग करें। जब स्थिति पट्टी "तैयार" इंगित करती है, तो प्राइम साइकिल पूर्ण हो जाती है। चिप्स को सफलतापूर्वक जोड़ने के लिए पर्याप्त बूंदों का गठन सुनिश्चित करने के लिए प्राइम साइकिल को दोहराएं।
    4. सुनिश्चित करें कि सभी पोर्टेबल मॉड्यूल प्राइमेड हैं और दृश्यमान मीडिया बूंदें हैं।
  3. प्रवाह का परिचय
    नोट: आंतों के उपकला कोशिकाओं को झिल्ली से दृढ़ता से संलग्न करने की अनुमति देने के लिए ऑर्गेनोइड टुकड़ों को बोने के बाद प्रवाह आमतौर पर 24 घंटे शुरू किया जाता है।
    1. किसी भी बुलबुले या सेल मलबे को हटाने के लिए संबंधित मीडिया के 200 μL के साथ वरीयता प्राप्त चिप्स के दोनों चैनलों को धो लें। धोने के बाद बंदरगाहों पर मीडिया की छोटी बूंदों को छोड़ दें। पोर्टेबल मॉड्यूल (चित्रा 1 सी) में चिप वाहक स्लाइड।
    2. पोर्टेबल मॉड्यूल ट्रे पर रखें, और फिर संस्कृति मॉड्यूल में। उपयुक्त अंग चिप संस्कृति की स्थिति (प्रवाह दर और खिंचाव) को प्रोग्राम करने के लिए संस्कृति मॉड्यूल की स्क्रीन पर नियंत्रण का उपयोग करें।
      नोट: मानक ग्रहणी और बृहदान्त्र चिप संस्कृति की स्थिति के लिए, ऊपर और नीचे दोनों चैनलों के लिए प्रवाह दर क्रमशः 30 μL / h15 और 60 μL / h16 पर सेट करें। हालांकि, प्रत्येक चैनल के लिए प्रवाह दर स्वतंत्र रूप से नियंत्रित की जाती है और इसे 0-1,000 μL / घंटा के बीच सेट किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में लामिना के प्रवाह को पेश करने के लिए यहां प्रस्तुत संस्कृति मॉड्यूल के बजाय सिरिंज या पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, ट्यूबिंग और कनेक्टर्स का उपयोग करके चिप्स और पंपों के बीच विश्वसनीय द्रव कनेक्शन की स्थापना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकती है जब कई चिप्स के एक साथ छिड़काव की आवश्यकता होती है।
    3. "विनियमित चक्र" (2 घंटे लंबा) शुरू करें जो हवा के बुलबुले के न्यूक्लिएशन को रोकने के लिए पोर्टेबल मॉड्यूल और चिप में संस्कृति मीडिया पर दबाव डालता है। विनियमित चक्र के पूरा होने के बाद क्रमादेशित शर्तें फिर से शुरू हो जाएंगी।
  4. मीडिया में बदलाव
    1. दोनों चैनलों के लिए ताजा मीडिया तैयार करें और इनलेट जलाशयों (चित्रा 1 सी) में ताजा माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़कर हर 48 घंटे में उन्हें फिर से भरें।
    2. संस्कृति मॉड्यूल को रोकें और ट्रे को बीएससी में लाएं। सभी जलाशयों में एस्पिरेट मीडिया और ताजा मीडिया के साथ फिर से भरना। ट्रे को वापस लाएं और प्रवाह को पुनरारंभ करें।
  5. खिंचाव का परिचय
    नोट: चक्रीय तनाव के आवेदन से पहले कोशिकाओं को 100% संगम तक बढ़ने की अनुमति दें। खिंचाव आमतौर पर 3 दिन बाद बोने या द्रव संस्कृति की दीक्षा के 48 घंटे बाद पेश किया जाता है। ग्रहणी 11 और बृहदान्त्र 24 आंत चिप के लिए क्रमशः 0.2 या0.15 हर्ट्ज की आवृत्ति पर 2% चक्रीय तनाव, प्रारंभिक24 घंटे के लिए लागू किया जाता है। फिर विवो (चित्रा 1 डी) 25 में आंतों के उपकला कोशिकाओं द्वारा अनुभव किए गए चक्रीय तनाव से मिलता जुलता आंत चिप संस्कृति की शेष अवधि के लिए इसे 10% तक बढ़ाया जाता है। संस्कृति मॉड्यूल 2% -12% चक्रीय तनाव और 0.4 हर्ट्ज तक की आवृत्ति के आवेदन का समर्थन कर सकता है।
    1. चल रहे तरल संस्कृति में खिंचाव पेश करने के लिए, संस्कृति मॉड्यूल को रोकें। स्क्रीन पर नियंत्रण का उपयोग करके, खिंचाव सेटिंग्स को 2% खिंचाव, 0.2 या 0.15 हर्ट्ज आवृत्ति में बदलें, और संस्कृति मॉड्यूल को पुनरारंभ करें।
    2. 24 घंटे के बाद, 10% खिंचाव, 0.2 या 0.15 हर्ट्ज आवृत्ति लागू करने के लिए चरण 7.5.1 दोहराएं।

8. ग्रहणी चिप में प्रोटोटाइप सीवाईपी इंड्यूसर का उपयोग करके सीवाईपी 450 प्रेरण

नोट: साइटोक्रोम पी 450 (सीवाईपी 450) प्रेरण परख यह आकलन करने में सक्षम बनाता है कि परीक्षण यौगिक विशिष्ट सीवाईपी 450 एंजाइमों के एमआरएनए स्तर और / यहां, हम उद्योग मानक और नियामक द्वारा सीवाईपी 3 ए 4 प्रेरण के मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो इन विट्रो सीवाईपी इंड्यूसर, रिफैम्पिसिन (आरआईएफ) और 1,2-डायहाइड्रॉक्सी विटामिन डी 3 (वीडी 3) में अनुशंसित है। प्रस्तुत विधि का उपयोग मानव आंतों के ऊतकों में सीवाईपी 450 के विभिन्न आइसोफॉर्म को प्रेरित करने के लिए विभिन्न परीक्षण यौगिकों की क्षमता की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। प्राइमरों और जांच सब्सट्रेट के विशिष्ट सेट का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्येक एंजाइम आइसोफॉर्म का चयन करने की आवश्यकता होगी।

  1. सीवाईपी इंड्यूसर के लिए एक्सपोजर
    1. बाँझ डीएमएसओ का उपयोग करके 20 एमएम आरआईएफ, 100 एमएम वीडी 3 और 200 एमएम टेस्टोस्टेरोन (सामग्री की तालिका) के स्टॉक समाधान तैयार करें।
      सावधानी: टेस्टोस्टेरोन एक अनुसूची III नियंत्रित पदार्थ है। हैंडलिंग के दौरान नियामक प्रक्रियाओं का पालन करें।
    2. 20 μM RIF, 100 एनएमओएल / एल वीडी 3 प्राप्त करने के लिए पूर्ण ऑर्गेनोइड विकास माध्यम और एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम में स्टॉक समाधान को पतला करके सीवाईपी इंड्यूसर के साथ खुराक मीडिया तैयार करें। डीएमएसओ के 0.1% को प्राप्त करने के लिए संबंधित मीडिया में डीएमएसओ को पतला करके वाहन नियंत्रण तैयार करें।
    3. संस्कृति मॉड्यूल को रोकें और ट्रे को बीएससी में लाएं। इंड्यूसर या वाहन नियंत्रण के साथ खुराक मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ सभी इनलेट जलाशयों में मीडिया को बदलें। पोर्टेबल मॉड्यूल को संस्कृति मॉड्यूल पर वापस लौटाएं और 30 μL /
    4. 24 घंटे के बाद, उत्प्रेरण समाधान के साथ मीडिया को बदलें, और चरण 8.1.2-8.1.3 दोहराएं। उत्प्रेरण समाधान ताजा दैनिक तैयार किया जाना चाहिए और प्रयोग के दौरान हर 24 घंटे में फिर से भरना चाहिए, जो आमतौर पर 48-72 घंटे लंबा होता है।
  2. एक प्रोटोटाइप सब्सट्रेट (टेस्टोस्टेरोन) के साथ इनक्यूबेशन
    1. फसल के दिन, 200 μM की अंतिम एकाग्रता उपज के लिए उन्नत DMEM / F12 में इसी प्रेरक के साथ टेस्टोस्टेरोन की जांच सब्सट्रेट समाधान तैयार करें।
    2. ट्रे को बीएससी में लाएं, और सभी जलाशयों से खुराक माध्यम की आकांक्षा करें। एफ 12 मध्यम और एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम के साथ क्रमशः ऊपर और नीचे इनलेट जलाशयों को धोएं और बदलें।
    3. जलाशयों से धोने के माध्यम को निकालें और इसे चरण 8.2.1 में तैयार जांच सब्सट्रेट समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें। 5 मिनट के लिए 1,000 μL / घंटा की उच्च प्रवाह दर पर चिप्स को परफ्यूज करें और ऊपर और नीचे आउटलेट जलाशयों दोनों की आकांक्षा करें। चिप्स को संस्कृति मॉड्यूल में लौटाएं और 300 μL / घंटा के निरंतर प्रवाह के तहत 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. डेटा विश्लेषण
    1. एलसीएमएस विश्लेषण के लिए नमूना संग्रह
      1. पूर्व-लेबल 1.5 एमएल ट्यूबों में 0.1% फॉर्मिक एसिड के साथ एसिटोनाइट्राइल युक्त स्टॉप समाधान के विभाज्य 200 μL और उन्हें बर्फ पर रखें। एलसीएमएस स्टॉप समाधान की संरचना सब्सट्रेट के आधार पर भिन्न हो सकती है जिसका विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है।
      2. उपचार के 1 घंटे पूरा होने के बाद, प्रवाह को रोकें और ट्रे को बीएससी में वापस लाएं। शीर्ष आउटलेट जलाशय से प्रवाह के 100 μL ले लीजिए, और यह रोक समाधान (चित्रा 2 ए) युक्त इसी ट्यूब में जोड़ें। ट्यूबों को तुरंत सूखी बर्फ पर रखें। विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।
      3. एमएस तकनीकों का उपयोग करके नमूनों को निकालें और विश्लेषण करें, मेटाबोलाइट -6β-हाइड्रोक्सीटेस्टोस्टेरोन (6β-ओएच-टी) के गठन की निगरानी करें। सीवाईपी एंजाइम गतिविधि को पीएमओएल / मिनट / मिलीग्राम प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है जहां पीएमओएल प्रतिक्रिया के दौरान गठित मेटाबोलाइट (6β-ओएच-टी) की मात्रा को संदर्भित करता है। चिप प्रति कुल प्रोटीन सामग्री (प्रोटीन; मिलीग्राम) चरण 8.3.2 में वर्णित ब्रैडफोर्ड परख प्रदर्शन करके निर्धारित किया जाता है।
        Equation 1
        गुना प्रेरण गतिविधि की गणना की जाती है: सीवाईपी गतिविधि (प्रेरित) / सीवाईपी गतिविधि (वाहन)।
      4. यदि एमआरएनए विश्लेषण के लिए नमूने एकत्र कर रहे हैं, तो चरण 8.3.3 देखें।
    2. प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का लसीका
      नोट: चिप पर कोशिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण एक प्रोटीन लाइसिस बफर का उपयोग करके किया जाता है, प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों (सामग्री की तालिका) के साथ पूरक होता है। निकाले गए प्रोटीन को ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की जाती है और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में उपयोग किया जाता है।
      1. पोर्टेबल मॉड्यूल से चिप्स को अलग करें और उन्हें पेट्री डिश में रखें। बाँझ डीपीबीएस के 200 μL के साथ दोनों चैनलों को धो लें।
      2. एक 200 μL फिल्टर विंदुक टिप के साथ नीचे चैनल आउटलेट ब्लॉक। नीचे चैनल के माध्यम से पृथक्करण समाधान के 50 μL परफ्यूज और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
      3. एंडोथेलियल कोशिकाओं की पूर्ण टुकड़ी की पुष्टि करने के लिए निरीक्षण करें। पिपेट ऊपर और नीचे 1-2 बार और चैनल से पृथक्करण समाधान को हटा दें। धोएं दोहराएं।
      4. एक 200 μL फिल्टर विंदुक टिप के साथ शीर्ष चैनल आउटलेट ब्लॉक। शीर्ष चैनल के माध्यम से प्रोटीन लाइसिस बफर के 75 μL परफ्यूज। शीर्ष चैनल इनलेट को अवरुद्ध करने और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं, डाला विंदुक टिप छोड़ दें। पिपेट ऊपर और नीचे 5-10 बार और एक पूर्व लेबल 1.5 एमएल ट्यूब में सेल लाइसेट्स इकट्ठा।
      5. चरण 8.3.2.4 दोहराएँ। जब तक कोशिकाओं की पूरी टुकड़ी नहीं देखी जाती है। एक ही 1.5 एमएल ट्यूब में सेल लाइसेट्स ले लीजिए और विश्लेषण तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      6. मानक तरीकों के अनुसार प्रोटीन अंश निकालें और ब्रैडफोर्ड परख (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें।
    3. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का लसीका
      नोट: आरएनए निष्कर्षण के लिए ऑन-चिप सेल लाइसिस को आरएनए लाइसिस बफर का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, जो 0.1% 2-मर्कैप्टोइथेनॉल (सामग्री की तालिका) के साथ पूरक है। वैकल्पिक रूप से, एक फिनोल-आधारित आरएनए लाइसिस बफर का उपयोग किया जा सकता है यदि एनजीएस और माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की उच्च पैदावार की आवश्यकता होती है।
      1. लाइसिस के लिए आंत चिप तैयार करने के लिए 8.3.2.1 से 8.3.2.2 चरणों का पालन करें।
      2. एक 200 μL फिल्टर विंदुक टिप का उपयोग कर शीर्ष चैनल के आउटलेट ब्लॉक। शीर्ष चैनल के माध्यम से आरएनए लाइसिस बफर के 150 μL परफ्यूज करें। शीर्ष चैनल के इनलेट को अवरुद्ध करने के लिए डाले गए पिपेट टिप को छोड़ दें। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते हैं। फिनोल-आधारित आरएनए लाइसिस बफर का उपयोग करके लाइसिस के लिए, अभिकर्मक के 350 μL का उपयोग करें।
      3. पिपेट ऊपर और नीचे 5-10 बार और एक पूर्व लेबल 1.5 एमएल ट्यूब में सेल लाइसेट्स इकट्ठा। आरएनए लाइसिस बफर के एक और 150 μL के साथ कदम दोहराएँ और इकट्ठा करें। विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल लाइसेट्स स्टोर करें। बाद के आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के मामले में, लाइजिंग के बाद 1 महीने के भीतर विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।
      4. आरएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके सेल लाइसेट्स से कुल आरएनए निकालें।
      5. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट का उपयोग करके सीडीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्राइब करें और वास्तविक समय पीसीआर साइक्लर और उपयुक्त प्राइमर और बफर का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर करें। 2-ΔΔCt विधि का उपयोग करके परिणामों की मात्रा निर्धारित करें।

9. बृहदान्त्र चिप में प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स का उपयोग करके उपकला बाधा का विघटन

नोट: यह प्रोटोकॉल साइटोकिन इंटरफेरॉन गामा (आईएफएनα)26,27,28,29 द्वारा आंतों के उपकला बाधा के विघटन का वर्णन करता है। साइटोकिन को आंतों के उपकला कोशिकाओं पर आईएफएन रिसेप्टर की बेसोलेटरल अभिव्यक्ति को देखते हुए बृहदान्त्र चिप के निचले चैनल में खुराक दी जाती है।  प्रोइंफ्लेमेटरी उत्तेजना संस्कृति के दिन 5 पर चिप में पेश की जाती है, जैसे ही पीऐप को 0.5 x 10-6 सेमी / इसी तरह की खुराक का उपयोग अन्य प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स और बाधा विघटनकारी एजेंटों के लिए किया जा सकता है।

  1. आईएफएन α के साथ उत्तेजना
    1. बाँझ सेल संस्कृति पानी में आईएफएनα (सामग्री की तालिका) के स्टॉक समाधान का एक 100 μg / प्रयोग के दौरान -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर करें। प्रत्येक प्रयोग के लिए, हमेशा IFNγ के एक ताजा स्टॉक का उपयोग करें और तीन से अधिक फ्रीज और पिघलना चक्रों से बचें।
    2. एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए डीगैस्ड एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम में स्टॉक समाधान को पतला करके आईएफएन α खुराक समाधान तैयार करें।
    3. ट्रे को बीएससी में लाएं और नीचे चैनल इनलेट जलाशयों से माध्यम को हटा दें और इसे आईएफएनα युक्त माध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें। आईएफएन α खुराक माध्यम को दैनिक ताज़ा करें।
    4. ट्रे को संस्कृति मॉड्यूल में रखें और आईएफएनα उपचार शुरू करने के लिए 5 मिनट के लिए 1,000 μL / घंटा की उच्च प्रवाह दर पर चिप्स को छिड़कें। प्रवाह दर को वापस 60 μL/h पर स्विच करें और द्रव संस्कृति जारी रखें।
  2. डेटा विश्लेषण
    1. उपकला बाधा समारोह का मूल्यांकन। उपकला स्पष्ट पारगम्यता (पीऐप), या बाधा फ़ंक्शन, दोनों चैनलों के इनलेट और आउटलेट जलाशयों के प्रवाह मीडिया में आईएफएनα के साथ उपचार के बाद संस्कृति के विभिन्न समय बिंदुओं पर मापा जा सकता है। फ्लोरोसेंट ट्रेसर को पीऐप के मूल्यांकन से 4 घंटे पहले शीर्ष चैनल ऑर्गेनोइड विकास माध्यम में जोड़ा जाना चाहिए। आमतौर पर, 3 केडीए डेक्सट्रान कैस्केड ब्लू का उपयोग फ्लोरोसेंट ट्रेसर के रूप में किया जाता है और इसे 24 घंटे पहले माध्यम में जोड़ा जाता है।
      1. संस्कृति मॉड्यूल को रोकें और ट्रे को बीएससी में लाएं।
      2. लेबल और अच्छी तरह से प्रति डीपीबीएस के 100 μL के साथ एक 96 अच्छी तरह से काली दीवारवाली प्लेट तैयार करें। एक 200 μL मल्टी चैनल विंदुक का उपयोग कर, इकट्ठा करने और संबंधित कुओं (चित्रा 2 बी) के लिए सभी जलाशयों से बहिःस्राव के 50 μL जोड़ें।
      3. मानक वक्र तैयार करने के लिए, डीपीबीएस में 3 केडीए डेक्सट्रान कैस्केड ब्लू 1: 3 के 100 μg / एमएल युक्त माध्यम को पतला करें। इसके बाद डीपीबीएस में एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम के तीन गुना कमजोर पड़ने का उपयोग करके सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
      4. एक प्लेट रीडर का उपयोग करके 375 एनएम उत्तेजना और 420 एनएम उत्सर्जन पर प्रतिदीप्ति पढ़ें। निम्नानुसार स्पष्ट पारगम्यता (पीऐप) की गणना करने के लिए मापा गया ओडी मानों का उपयोग करें:
        Equation 2
    2. ऑन-चिप कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना
      1. प्रत्येक चैनल के लिए डीपीबीएस के 200 μL का उपयोग करके तीन बार धो लें।
      2. प्रत्येक चैनल में फिक्सेटिव समाधान (डीपीबीएस में 4% पीएफए) के 200 μL परफ्यूज करें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
      3. धोने के चरण 9.2.2.1 को दोहराएं। इस स्तर पर, धोए गए चिप्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
      4. प्रत्येक चैनल के लिए पारगम्यीकरण समाधान (डीपीबीएस में 10% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस) में 0.1% ट्राइटन-एक्स 100) के 200 μL का उपयोग करके कोशिकाओं को पारगम्य करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। धोने के चरण 9.2.2.1 को दोहराएं।
      5. प्रत्येक चैनल के लिए अवरुद्ध समाधान (डीपीबीएस में 10% एनडीएस) के 200 μL का उपयोग करके चिप पर कोशिकाओं को ब्लॉक करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
      6. एंटीबॉडी समाधान (डीपीबीएस में 5% एनडीएस) में प्राथमिक एंटीबॉडी को निम्नानुसार पतला करें: एंटी-ज़ोनुला ओक्लूडेंस 1 (ज़ो -1) (1: 100, उपकला तंग जंक्शन मार्कर), एंटी-ऑक्लुडिन (1: 100, उपकला तंग जंक्शन मार्कर), एंटी-क्लाउडिन 4 (1: 100, उपकला तंग जंक्शन मार्कर), एंटी-ई-कैडरिन प्रत्येक चैनल के माध्यम से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 μL परफ्यूज करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं। धोने के चरण 9.2.2.1 को दोहराएं।
      7. एंटीबॉडी समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें (1: 300, डीपीबीएस में 5% एनडीएस)। प्रत्येक चैनल के माध्यम से इस समाधान के 200 μL परफ्यूज़ करें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं। धोने के चरण 9.2.2.1 को दोहराएं। यदि वांछित है, तो फालोइडिन, एक साइटोस्केलेटल मार्कर, माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में जोड़ा जा सकता है।
      8. डीपीबीएस में 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) समाधान का 50 μg / एमएल तैयार करें और प्रत्येक चैनल के माध्यम से 200 μL को सुगंधित करने के लिए इसका उपयोग करें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। धोने के चरण को दोहराएं। इस बिंदु पर, दाग चिप्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर 14 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. कैस्पेस 3 दरार का आकलन
      1. चरण 8.3.2 में वर्णित उपकला कोशिकाओं के प्रोटीन की कुल मात्रा को अलग और परिमाणित करें। धोने के चरण 8.3.2.1 को छोड़ दें। एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए डीपीबीएस के साथ नमूनों को पतला करें।
      2. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद कैस्पेज 3 डिटेक्शन किट का उपयोग करके कुल और क्लीव्ड कैस्पेस 3 के स्तर को निर्धारित करें।
    4. प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स स्राव का आकलन
      1. निर्माता द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, स्रावित तीव्र चरण प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स को मापने के लिए बृहदान्त्र चिप के दोनों चैनलों के आउटलेट से एकत्र किए गए अपशिष्टों का उपयोग करें। वी-प्लेक्स संवहनी चोट पैनल 2 मानव किट के लिए 5 गुना कमजोर पड़ने और वी-पीएलईएक्स मानव प्रोइंफ्लेमेटरी पैनल द्वितीय के लिए दो गुना कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।

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Representative Results

चित्रा 1 डी आंत चिप संस्कृति की समयरेखा को सारांशित करता है और चिप पर बोने से पहले और बाद में आंतों के एंडोथेलियल कोशिकाओं और ऑर्गेनोइड को दर्शाता है। इसके अलावा, यह ग्रहणी और बृहदान्त्र चिप्स के बीच अलग-अलग रूपात्मक अंतर को दर्शाता है, ग्रहणी चिप में विली जैसी संरचनाओं की उपस्थिति और छोटे आंतों की वास्तुकला के प्रतिनिधि द्वारा हाइलाइट किया गया है।

चित्रा 3 ए, बी तीन अलग-अलग ऑर्गेनोइड दाताओं से ग्रहणी चिप में गुना सीवाईपी 3 ए 4 प्रेरण प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करता है। चिप्स को 48 घंटे के लिए 20 μM RIF या 100 एनएम वीडी 3 के संपर्क में लाया गया था और इसका उपयोग सीवाईपी 450 एंजाइम के एमआरएनए स्तर (ए) और / या गुना उत्प्रेरक गतिविधि (बी) का आकलन करने के लिए किया गया था। टेस्टोस्टेरोन मेटाबोलाइट के बढ़े हुए स्तर, 6β-हाइड्रॉक्सीटेस्टोस्टेरोन (6β-ओएच-टी), ऊंचा सीवाईपी 3 ए 4 एमआरएनए जीन अभिव्यक्ति के अनुरूप आरआईएफ और वीडी 3 के संपर्क में ग्रहणी चिप में देखा गया था जो परीक्षण किए गए सभी तीन दाताओं में उचित प्रेरण प्रतिक्रियाओं का संकेत देता है। एन = 3 जैविक रूप से स्वतंत्र चिप्स के एसईएम ± साधन दिखाए गए हैं।

चित्रा 4 बृहदान्त्र चिप में टपका हुआ आंत सिंड्रोम के मॉडलिंग के लिए प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाता है, जिसमें (ए, सी) उपकला सेल आकृति विज्ञान और तंग जंक्शन अखंडता में परिवर्तन, (बी) बाधा समारोह में कमी, (डी) एपोप्टोसिस का प्रेरण और (ई) आईएफएन α उपचार के जवाब में साइटोकिन स्राव में वृद्धि हुई है।

चित्रा 4 ए बृहदान्त्र चिप के नियंत्रण और आईएफएन-इलाज (50 एनजी / एमएल, 48 एच) उपकला मोनोलेयर के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों को दर्शाता है। चिप्स को संस्कृति मॉड्यूल से हटा दिया गया था और उपकला आकृति विज्ञान का मूल्यांकन दैनिक माइक्रोस्कोप के तहत किया गया था। छवियों को एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप और 10x उद्देश्य का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था। आईएफएनα के साथ इलाज किए गए बृहदान्त्र चिप्स एक समझौता सेल आकृति विज्ञान और स्तंभ उपकला के नुकसान को दर्शाते हैं।

चित्रा 4 बी आधारभूत परिस्थितियों में सुसंस्कृत बृहदान्त्र चिप्स पर या आईएफएनα के साथ उत्तेजना पर प्रदर्शन स्पष्ट पारगम्यता परख का एक प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करता है। एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए शीर्ष चैनल जलाशय में 3 केडीए डेक्सट्रान कैस्केड ब्लू ट्रेसर जोड़ा गया था। एमएल की अंतिम एकाग्रता पर आईएफएनα संस्कृति के 5 वें दिन नीचे चैनल में खुराक दी गई थी। चिप्स को 60 एमएल / घंटा पर सुगंधित किया गया था। अगला, मीडिया को ऊपर और नीचे दोनों चैनलों के इनलेट और आउटलेट जलाशयों से दैनिक (दिन 72 घंटे पोस्ट-एक्सपोजर तक) एकत्र किया गया था। प्रत्येक नमूने के 50 μL एकत्र किया गया था, प्रोटोकॉल के चरण 9.2.1 में वर्णित के रूप में संसाधित, और एक प्लेट रीडर का उपयोग कर375-420 एनएम पर प्रतिदीप्ति के लिए जांच की। उपकला पैरासेल्युलर पारगम्यता की एक महत्वपूर्ण वृद्धि आईएफएन α उत्तेजना के 48 घंटे के बाद देखी गई थी।

चित्रा 4 सी उपकला तंग (ज़ोनुला ओक्लूडेन्स 1 - ज़ो -1, ओक्लुडिन, क्लाउडिन -4) और नियंत्रण में अनुयायियों (ई-कैडरिन) जंक्शनों और आईएफएन-उपचारित (50 एनजी / चिप्स कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ तय किए गए थे और प्रोटोकॉल के चरण 9.2.2 में वर्णित के रूप में आगे संसाधित किया गया था। छवियों को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और 20x लंबी दूरी के उद्देश्य का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार फिजी संस्करण 2.0 का उपयोग करके संसाधित किया गया था। आईएफएनओ के साथ उपचार ज़ो -1 और क्लाउडिन -4 के विस्थापन और ऑक्लुडिन और ई-कैडरिन के आंतरिककरण को ट्रिगर करता है, जैसा कि बढ़े हुए साइटोप्लाज्मिक सिग्नल द्वारा दिखाया गया है।

चित्रा 4 डी एपोप्टोसिस सक्रियण के संकेत आईएफएनα के 50 एनजी / एमएल के जवाब में बृहदान्त्र चिप में कैस्पेज 3 दरार के समय-पाठ्यक्रम का प्रतिनिधित्व करता है। चिप्स पर उपकला कोशिकाओं को लाइज़ किया गया था और मानक विधियों के अनुसार प्रोटीन के नमूनों को शुद्ध किया गया था। प्रोटोकॉल के चरण 9.2.3 में वर्णित के रूप में कुल और क्लीव्ड कैस्पेज 3 की इंट्रासेल्युलर सामग्री को मापा गया था। आईएफएनα एपोप्टोसिस की सक्रियता को प्रेरित करता है, जैसा कि पहले29 वर्णित है, चिप पर सुसंस्कृत कोलोनिक उपकला कोशिकाओं में, उत्तेजना के 48 घंटे के बाद।

चित्रा 4 ई 50 एनजी / एमएल आईएफएनα के साथ उत्तेजना पर बृहदान्त्र चिप से साइटोकिन के स्राव के समय-पाठ्यक्रम को दर्शाता है। ऊपर और नीचे दोनों चैनलों के आउटलेट जलाशयों से प्रतिदिन 200 μL प्रवाह मीडिया एकत्र किए गए थे। बहिःस्राव के नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे पर संग्रहीत किया गया था, इससे पहले कि विश्लेषण 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पिघल गया था। चिप संस्कृति मीडिया में साइटोकिन के स्तर का मूल्यांकन प्रोटोकॉल के चरण 9.2.4 में वर्णित मेसो स्केल डिस्कवरी तकनीक का उपयोग करके किया गया था। आईएफएनα बृहदान्त्र चिप में प्रोइंफ्लेमेटरी अणुओं के ध्रुवीकृत स्राव को प्रेरित किया, जैसा कि संवहनी सेल आसंजन प्रोटीन 1 (वीसीएएम -1) और इंटरल्यूकिन 6 (आईएल -6) के बेसोलेटरल स्राव और इंटरसेल्युलर आसंजन अणु 1 (आईसीएएम -1) और सीरम एमिलॉयड प्रोटीन ए (एसएए) के एपिकल स्राव द्वारा दिखाया गया है। वीसीएएम -1, आईसीएएम -1, आईएल -6 और एसएए के घुलनशील रूपों के सीरम स्तर का उपयोग नैदानिक प्रयोगशालाओं में सूजन30,31 के संकेतक के रूप में किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: आंत चिपकी स्थापना 15,16. (ए) चिप सक्रियण और कोटिंग की योजनाबद्ध। संक्षेप में, चिप्स को एक चिप पालना में रखा जाता है, ईआर 1 समाधान के साथ सुगंधित किया जाता है और यूवी प्रकाश के तहत सक्रिय किया जाता है। इसके बाद, चिप्स को ईआर 2 और डीपीबीएस के साथ धोया जाता है। अंत में, चिप्स को एक बर्फ-ठंडा ईसीएम समाधान के साथ लेपित किया जाता है, जो प्रत्येक सेल प्रकार के लिए विशिष्ट होता है, और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ऊष्मायन किया जाता है। ऑर्गेनोइड को 24-अच्छी तरह से प्लेट से एक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है और घुलनशील बीएमएम से ऑर्गेनोइड को पुनर्प्राप्त करने के लिए बीएमएम पृथक्करण समाधान की उपस्थिति में बर्फ पर ऊष्मायन किया जाता है। ऑर्गेनोइड निलंबन को तब सेंट्रीफ्यूज किया जाता है और घुलनशील बीएमएम अवशेषों की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया जाता है। यदि बीएमएम की एक पारदर्शी परत अभी भी सेल गोली के ऊपर दिखाई दे रही है, तो प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए। यदि एक अच्छी तरह से परिभाषित गोली को बिना किसी दृश्यमान जेल अवशेषों के मनाया जाता है, तो ऑर्गेनोइड को एंजाइमेटिक रूप से अलग किया जाता है और चिप के शीर्ष चैनल (नीले) में पेश किया जाता है। चिप के निचले चैनल (मैजेंटा) को ऊतक-विशिष्ट माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ वरीयता दी जाती है। (सी) योजनाबद्ध संस्कृति मॉड्यूल के लिए चिप्स के कनेक्शन को दर्शाता है, जो मीडिया प्रवाह और चक्रीय पेरिस्टलसिस जैसे खिंचाव का समर्थन करता है। भड़काना चक्र चिप बंदरगाहों पर और पोर्टेबल मॉड्यूल प्रतिरोधों के अंत में सेल संस्कृति मध्यम बूंदों की पीढ़ी को सक्षम बनाता है। यह चिप और पोर्टेबल मॉड्यूल के बीच तरल-तरल इंटरफ़ेस के निर्माण को सुनिश्चित करता है, जिससे चिप मॉड्यूल और उनके सुरक्षित कनेक्शन में फिसलने की सुविधा मिलती है। अंत में, पोर्टेबल मॉड्यूल ट्रे में रखे जाते हैं, और ट्रे को संस्कृति मॉड्यूल में डाला जाता है। (डी) ग्रहणी और बृहदान्त्र चिप सहित बायोप्सी-व्युत्पन्न आंत चिप मंच की स्थापना के लिए प्रमुख चरणों को उजागर करने वाली प्रायोगिक समयरेखा। ब्राइटफील्ड छवियां चिप में बोने से पहले और बाद में दिन 0 पर एंडोथेलियल और ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न कोशिकाओं को चित्रित करती हैं, साथ ही चिप संस्कृति के दिन 8 पर संगम और 3 डी उपकला ऊतक का गठन करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: आंत चिप से बहिःस्राव मीडिया का संग्रह (ए) पोर्टेबल मॉड्यूल से मीडिया प्रवाह के संग्रह को दर्शाते हुए योजनाबद्ध। मीडिया को ऊपर और नीचे चैनल के आउटलेट जलाशयों से एकत्र किया जाता है और आगे एलिसा या एलसी-एमएस / एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। (बी) योजनाबद्ध एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके बहिःस्राव के नमूनों के संग्रह और उपकला स्पष्ट पारगम्यता (पीऐप) के डाउनस्ट्रीम मूल्यांकन के लिए 96-अच्छी तरह से काली दीवारवाली प्लेट में उनके हस्तांतरण को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ग्रहणी चिप में सीवाईपी 3 ए 4 प्रेरण15. (ए) ग्रहणी चिप में सीवाईपी 3 ए 4 एमआरएनए स्तरों का प्रेरण 20 μM आरआईएफ और 100 एनएम वीडी 3 के लिए 48 घंटे के जोखिम से। दाता, दो-तरफा एनोवा, टुकी के पोस्ट हॉक परीक्षण, **** पी < 0.0001 (डीएमएसओ नियंत्रणों की तुलना में) ± मतलब है। (बी) प्रोब सब्सट्रेट मेटाबोलाइट के एलसी-एमएस /एमएस परिमाणीकरण द्वारा मूल्यांकन किए गए प्रोटोटाइपिकल इंड्यूसर के संपर्क में ग्रहणी चिप में सीवाईपी 3 ए 4 गतिविधि का प्रेरण: 6β-हाइड्रॉक्सीटेस्टोस्टेरोन। सीवाईपी 3 ए 4 गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि 48 घंटे के लिए 20 μM आरआईएफ या 100 एनएम वीडी 3 के साथ इलाज किए गए ग्रहणी चिप में देखी गई थी। दाता, दो-तरफ़ा एनोवा, टुकी के पोस्ट हॉक परीक्षण, **** पी < 0.0001 ± मतलब है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: आईएफएनα16 का उपयोग कर बृहदान्त्र चिप में उपकला बाधा का विघटन. (ए) ब्राइटफील्ड छवियां आधारभूत परिस्थितियों में उपकला कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को दिखाती हैं और 48 घंटे के लिए 50 एनजी / स्केल बार: 100 μm. (B) आईएफएनα के 50 एनजी / एमएल के साथ 72 घंटे की उत्तेजना के दौरान 3 केडीए डेक्सट्रान के लिए उपकला बाधा की स्पष्ट पारगम्यता। स्थिति, दो-तरफ़ा एनोवा, टुकी के पोस्ट हॉक परीक्षण, **** पी < 0.0001 ± मतलब है। (सी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां उपकला तंग के विघटन को दर्शाती हैं और 48 घंटे के लिए आईएफएनα के 50 एनजी / एमएल के साथ उत्तेजना पर जंक्शनों का पालन करती हैं ज़ोनुला ऑक्लूडेंस 1 (जेडओ -1) (लाल) तंग जंक्शन, ई-कैडरिन (लाल) अनुयायी जंक्शन, ऑक्लुडिन (लाल) तंग जंक्शन, क्लाउडिन -4 (लाल) तंग जंक्शन, 4', 6 स्केल बार: 50 μm. (D) आईएफएनα के 50 एनजी / एमएल के साथ उपचार द्वारा बृहदान्त्र चिप में कैस्पेज 3 दरार का प्रेरण। एक्सपोजर के 72 घंटे में चार अलग-अलग समय बिंदुओं का मूल्यांकन किया गया था। स्थिति, दो-तरफ़ा एनोवा, टुकी के पोस्ट हॉक परीक्षण, **** पी < 0.0001 ± मतलब है। (ई) साइटोकिन्स के स्राव में वृद्धि: संवहनी सेल आसंजन प्रोटीन 1 (वीसीएएम -1) और इंटरल्यूकिन 6 (आईएल -6), नीचे चैनल में, और इंटरसेल्युलर आसंजन अणु 1 (आईसीएएम -1) और सीरम अमाइलॉइड प्रोटीन ए (एसएए) शीर्ष चैनल प्रवाह मीडिया में, 50 एनजी / स्थिति, दो-तरफा एनोवा, टुकी ± के पोस्ट हॉक टेस्ट, *: पी < 0.05, **: पी < 0.01, ***: पी < 0.001, ***: पी < 0.001, **** पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ऑर्गन-ऑन-ए-चिप तकनीक और आंतों के ऑर्गेनोइड का संयोजन मानव आंतों के शरीर विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी के सटीक मॉडलिंग के लिए वादा करता है। यहां, हम बायोप्सी-व्युत्पन्न छोटे आंतों या कोलोनिक उपकला और आंतों के माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं युक्त आंत चिप की स्थापना के लिए एक सरल और मजबूत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल ( चित्रा 1 में उल्लिखित) प्रदान करते हैं। मानव आंत के इस चिप-आधारित सिमुलेशन में शारीरिक, ल्यूमिनल और संवहनी प्रवाह और पेरिस्टलसिस जैसी गति शामिल है। इसके अलावा, हम महत्वपूर्ण आंतों के कार्यों के मूल्यांकन के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं, जैसे ग्रहणी चिप में दवा चयापचय और बृहदान्त्र चिप में बाधा समारोह।

उपकला-एंडोथेलियल सेलुलर इंटरैक्शन को दोहराने के लिए, जो आंत होमियोस्टेसिस के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं और इसलिए चिप पर आंतों के ऊतकों का सटीक मॉडलिंग, पीडीएमएस झिल्ली के दोनों किनारों पर कार्यात्मक और बरकरार सेल मोनोलेयर स्थापित करना महत्वपूर्ण है। सफल चिप बोने की दिशा में पहला कदम पीडीएमएस सतह का रासायनिक सक्रियण है जो पीडीएमएस सतह और ईसीएम प्रोटीन के बीच एक स्थिर लिंकेज के विकास की अनुमति देता है। अनुचित सक्रियण कोशिकाओं के लगाव में बाधा डाल सकता है और इसके परिणामस्वरूप अपूर्ण सेलुलर मोनोलेयर का गठन हो सकता है। सक्रियण समाधान को ताजा तैयार किया जाना चाहिए क्योंकि यह प्रकाश संवेदनशील है और गिरावट के लिए प्रवण है। यूवी सक्रियण और बाद में ईसीएम कोटिंग के दौरान, प्रत्येक चैनल के भीतर अभिकर्मकों का एक समान वितरण सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। ऊपर और नीचे के चैनलों को कोट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधानों की विशिष्ट संरचना और एकाग्रता को क्रमशः उपकला और एंडोथेलियल कोशिकाओं की आवश्यकताओं के अनुरूप अनुकूलित किया गया है। यदि आंत चिप की सेलुलर संरचना में परिवर्तन की आवश्यकता होती है, तो इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए ईसीएम स्थितियों को फिर से अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

ईसीएम कोटिंग के बाद, पीडीएमएस झिल्ली के निचले हिस्से पर एक पूर्ण और समरूप मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए उच्च सेल सीडिंग घनत्व (8 x 106 कोशिकाओं / एमएल) पर एचआईएमईसी को बीज देना महत्वपूर्ण है। यदि पूर्ण सेल संगम प्राप्त नहीं किया जा रहा है, तो बोने के दौरान एंडोथेलियल सेल निलंबन के घनत्व को और बढ़ाने या चिप के शीर्ष चैनल में ऑर्गेनोइड टुकड़ों के बोने में देरी करने की सलाह दी जाती है जब तक कि एचआईएमईसी पूरी तरह से संगम न हो जाए। ऑर्गेनोइड के एंजाइमी पाचन के माध्यम से प्राप्त एकल कोशिकाओं के निलंबन के बजाय खंडित ऑर्गेनोइड का उपयोग, पहले आंत चिप14 के भीतर आंतों के मोनोलेयर गठन की सफलता और प्रजनन क्षमता में सुधार करने के लिए दिखाया गया था। इसलिए, एंजाइम के साथ इनक्यूबेशन के इष्टतम समय को सुनिश्चित करने के लिए ऑर्गेनोइड पाचन प्रक्रिया की बारीकी से निगरानी करने की दृढ़ता से सलाह दी जाती है, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 10-30 कोशिकाओं (आकार में 40-100 μm) से बने ऑर्गेनोइड टुकड़े होते हैं। अपर्याप्त पृथक्करण के परिणामस्वरूप वांछित मोनोलेयर के बजाय माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में सिस्टिक ऑर्गेनोइड संरचना का सुधार हो सकता है। इसके अलावा, एकल कोशिकाओं में अत्यधिक ऑर्गेनोइड पृथक्करण से बचना महत्वपूर्ण है जो चिप के भीतर संगम मोनोलेयर बनाने में कम सेल अस्तित्व, वसूली और विफलता का कारण बन सकता है।

संस्कृति मॉड्यूल का उपयोग करके समर्थित आंत चिप संस्कृति में द्रव प्रवाह (कतरनी तनाव) और चक्रीय तनाव का समावेश, कार्यात्मक आंतों की बाधा के गठन को बढ़ाने और उपकला ऊतक13 के 3 डी वास्तुकला के सहज विकास को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, ऑर्गन-ऑन-चिप्स के उपयोग के साथ माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग करते समय, चैनलों में माइक्रोबबल्स के गठन से बचने के लिए उपयोग करने से पहले सेल कल्चर मीडिया को प्री-वार्म और डिगास करना महत्वपूर्ण है जिससे सेलुलर तनाव या झिल्ली से टुकड़ी भी हो सकती है।

यहां दिखाए गए विशिष्ट अनुप्रयोगों के अलावा, आंत चिप मॉडल का उपयोग बुनियादी विज्ञान से लेकर उपन्यास दवाओं या दवा वितरण प्रौद्योगिकियों की खोज और परीक्षण तक विभिन्न वैज्ञानिक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। यह मानव आंतों के विकास, स्टेम सेल परिपक्वता और उपकला कोशिका समारोह के अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकता है; विशेष रूप से आंतों के ऊतकों के विकास और होमियोस्टेसिस में यांत्रिकी की भूमिका का मूल्यांकन करने के संदर्भ में। हाल की खोजों से पता चला है कि स्वस्थ आंतों के उपकला का गतिशील संतुलन विभिन्न बलों को ठीक से समन्वयित करने की क्षमता पर निर्भर करता है जो क्रिप्ट-विली वास्तुकला को परिभाषित करते हैं, सेल प्रकारों को विभाजित करते हैं, प्रत्यक्ष सेल माइग्रेशन, और अंतरिक्ष और समय में सेल पहचान, प्रसार और मृत्यु को विनियमित करते हैं। आंत चिप यांत्रिक बलों (जैसे, तनाव या कतरनी तनाव), सेल भाग्य, और आंतों के मैकेनोबायोलॉजी के उभरते क्षेत्र में बने रहने वाले कई आकर्षक सवालों के जवाब देने के लिए कार्य के बीच परस्पर क्रिया को बेहतर ढंग से स्पष्ट करने का अवसर प्रदान करती है। इसके अलावा, यह हार्मोन-स्रावित एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाओं की उपस्थिति और विभिन्न पोषक तत्व ट्रांसपोर्टरों15,16 के सही स्थानीयकरण के लिए संवेदन और आंतों के परिवहन प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति दे सकता है। आंत चिप मॉडल को आंत भड़काऊ विकारों, मेजबान-रोगज़नक़ और मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन पर अध्ययन के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ-साथ कमेंसल या रोगजनक सूक्ष्मजीवों को शामिल करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, साथ ही इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी उत्पादों की ऑफ-टारगेट विषाक्तता की सटीक भविष्यवाणी करने के लिए, जैसा कि पहले 17,20,33,34,35 दिखाया गया था।

इसके अलावा, विशिष्ट जीनोटाइपिक और फेनोटाइपिक विशेषताओं वाले व्यक्तियों से नैदानिक बायोप्सी नमूनों का उपयोग रोगी-विशिष्ट रोग तंत्र के विश्लेषण के साथ-साथ उपचारों की प्रतिक्रिया को सक्षम कर सकता है, जिससे भविष्य में व्यक्तिगत दवा को आगे बढ़ाने में मदद मिलती है।

इस पद्धति की प्रमुख सीमा यह है कि प्रत्येक चिप पर एक संगम आंतों के उपकला बनाने के लिए बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड (~ 60-80) के टुकड़ों की आवश्यकता होती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि ऑर्गेनोइड टुकड़ों को यह सुनिश्चित करने के लिए उच्च घनत्व वाले बोने की आवश्यकता होती है कि मोनोलेयर के प्रसार विस्तार और 3 डी ऊतक वास्तुकला की स्थापना का समर्थन करने के लिए पर्याप्त संख्या में आंतों की स्टेम कोशिकाएं मौजूद हैं। एक चिप पर एक पूरी तरह से विभेदित आंतों के उपकला में सभी प्रमुख आंतों के उपकला कोशिका प्रकार (अवशोषक एंटरोसाइट्स, पनेथ कोशिकाएं, गोबलेट कोशिकाएं और एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाएं) और ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल इन विवो समकक्ष के समान होती हैं। हालांकि, वर्तमान मॉडल में अभी भी जीवित आंत के अन्य महत्वपूर्ण घटकों का अभाव है, जिसमें आंतों के फाइब्रोब्लास्ट, निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाएं (जैसे, मैक्रोफेज, इंट्राएपिथेलियल लिम्फोसाइट्स और डेंड्राइटिक कोशिकाएं), और आंत्र तंत्रिका तंत्र शामिल हैं।

हालांकि ये संभावित कमियां हैं, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ऑर्गन-ऑन-ए-चिप प्रौद्योगिकी दृष्टिकोण की शक्ति विवो ऊतकों के विभिन्न घटकों और उनके सूक्ष्म वातावरण को उत्तरोत्तर एकीकृत करके मानव अंगों की संरचनात्मक और कार्यात्मक जटिलता का अनुकरण करने की क्षमता में निहित है। इन विट्रो ऊतक इंजीनियरिंग के लिए यह सिंथेटिक जीव विज्ञान दृष्टिकोण सिस्टम जटिलता के विभिन्न स्तरों पर अंग-स्तरीय शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं के लिए व्यक्तिगत सेलुलर और आणविक घटकों के योगदान का अध्ययन करने का एक तरीका प्रदान करता है। इसके अलावा, यह बातचीत करने वाले ऊतकों के जैव रासायनिक, आनुवंशिक और सूक्ष्म विश्लेषण को व्यक्तिगत रूप से और वास्तविक समय में करने की अनुमति देता है, इस बात की अंतर्दृष्टि प्राप्त करता है कि अंतरकोशिकीय संकेत और ऊतक-ऊतक इंटरैक्शन विशिष्ट अंग-स्तरीय व्यवहार में कैसे योगदान करते हैं। आंत चिप प्रौद्योगिकी की एक और उल्लेखनीय विशेषता बहुमुखी प्रतिभा है। सूक्ष्म पर्यावरणीय तत्वों पर सटीक नियंत्रण मानव शरीर में कोशिकाओं द्वारा अनुभव की जाने वाली प्राकृतिक शक्तियों को पुन: उत्पन्न करने के लिए मीडिया प्रवाह दरों और तनाव मापदंडों की ठीक ट्यूनिंग को सक्षम बनाता है, जैसे रक्त प्रवाह के संपर्क में एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा महसूस किया गया कतरनी तनाव और आंतों के ऊतकों की चक्रीय पेरिस्टाल्टिक गति। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड और ऑर्गन-ऑन-चिप्स की सहक्रियात्मक इंजीनियरिंग आंतों के ऊतकों के विभिन्न क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने वाले संवहनी अंगों-ऑन-चिप्स के निर्माण को सक्षम बनाती है जिन्हें छोटी और बड़ी आंतों के बीच शारीरिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक दूसरे के साथ तरल रूप से जोड़ा जा सकता है। इस प्रकार, हम मानते हैं कि आंत चिप आंतों के उपकला के एक बेहतर मॉडल का प्रतिनिधित्व करती है और बुनियादी विज्ञान के साथ-साथ प्रीक्लिनिकल और नियामक सेटअप में 3 आर (कमी, शोधन और प्रतिस्थापन) सिद्धांत को लागू करने में मदद कर सकती है।

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Disclosures

गौरी कुलकर्णी, अथानेशिया अपोस्टोलू, लोर्ना इवार्ट, कैरोलिना लुचेसी और मगदलेना कासेंद्र एमिमलेट इंक के वर्तमान या पूर्व कर्मचारी हैं और इक्विटी रख सकते हैं। अनुकरण इंक वह कंपनी है जो अंग चिप उपकरणों का निर्माण करती है और इस लेख में बताए गए काम से संबंधित पेटेंट प्रकाशित की है।

Acknowledgments

हम चिप, पोर्टेबल और संस्कृति मॉड्यूल के वैज्ञानिक चित्रों को डिजाइन करने के लिए आंतों की बायोप्सी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड और ब्रेट क्लेयर प्रदान करने के लिए प्रोफेसर मार्क डोनोविट्ज़ को धन्यवाद देते हैं। बाकी सभी वैज्ञानिक चित्र बायोरेंडर का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE15 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE16 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
Biopsy-derived Human Duodenal Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Biopsy-derived Human Colonic Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Zoë CM-1™ Culture Module Emulate Inc. - Culture module
Orb-HM1™ Hub Module Emulate Inc. - 5% CO2, vacuum stretch, and power supply
Chip-S1™ Stretchable Chip Emulate Inc. - Organ-Chip
Pod™ Portable Modules Emulate Inc. - Portable module
UV Light Box Emulate Inc. - -
Chip Cradle Emulate Inc. - 1 per square culture dish
Steriflip®-HV Filters EMD Millipore SE1M003M00 0.45 μm PVDF filter
Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) VWR 82051-068 -
Handheld vacuum aspirator Corning 4930  -
Aspirating pipettes Corning / Falcon 357558 2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips  - Sterile (autoclaved)
Serological pipettes  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Pipette P20, P200, P1000 and standard multichannel
Pipette tips  P20, P200, and P1000.
Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) Eppendorf 0030122216; 0030122240 15 mL, 50 mL tubes
Eppendorf Tubes® lo-bind Eppendorf 022431081 1.5 mL tubes
96 wells black walled plate - - for epithelial permeability analysis
Microscope (with camera) - - For bright-field imaging
Water bath (or beads) - - Set to 37°C
Vacuum set-up  - - Minimum pressure: -70 kPa
Cell scrapers Biotium 220033
T75 flasks BD Falcon 353136 Cell culture flask
Emulate Reagent-1 (ER-1) Emulate Inc. - Chip coating solution
Emulate Reagent-2 (ER-2) Emulate Inc. - Chip coating solution
Dulbecco’s PBS (DPBS) Corning 21-031-CV 1X
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV
Trypan blue Sigma 93595 For cell counting
TryplE Express ThermoFisher Scientific 12604013 Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634028 Medium
IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell technologies 06010 Organoid Growth Medium
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 Promocell C-22121 Endothelial medium
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F4135 Serum
Primocin™  InvivoGen ANT-PM-1 antimicrobial agent
Attachment Factor™ Cell Systems 4Z0-210 coating solution for flask
Matrigel - Growth Factor Reduced Corning 356231 Solubilized basement membrane matrix
Collagen IV Sigma C5533 ECM component
Fibronectin Corning 356008 ECM component
Y-27632 Stem Cell technologies 72304 organoid media supplement
CHIR99021 Reprocell 04-0004-10 organoid media supplement
Cell Recovery Solution Corning 354253 Basement mebrane matrix dissociationsolution
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9576 30%, Sterile
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV Sterile, Water
DMSO Sigma D2650 solvent
3KDa Dextran Cascade Blue Invitrogen D7132 10 mg powder
Rifampicin (RIF) Sigma Cat# R3501 CYP inducer
Testosterone hydrate Sigma T1500 CYP substrate
1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) Sigma Cat# D1530 CYP inducer
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid Sigma 159002 LCMS stop solution
IFNγ Peprotech 300-02
4% Paraformaldehyde (PFA) EMS 157-4 Fixative
Triton-X 100 Sigma T8787
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma 566460
anti-Occludin ThermoFisher Scientific 33-1500 tight junctions marker
anti-Claudin 4 ThermoFisher Scientific 36-4800 tight junctions marker
anti-E-cadherin Abcam ab1416 epithelial adherens junctions marker
anti-VE-cadherin Abcam ab33168 endothelial adherent junctions marker
anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) Thermo Fischer 339194 tight junctions marker
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 nuclear stain
2-mercaptoethanol Sigma M6250
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183020 RNA lysis, isolation and purification kit
SuperScript™ IV VILO™ Master Mix Invitrogen 11756050 reverse transcriptase kit
TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Applied Biosystems 4444557 qPCR reagent
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28573 Real-time PCR cycler
18S primer ThermoFisher Scientific Hs99999901_s1 Eukaryotic 18S rRNA
CYP3A4 primer ThermoFisher Scientific Hs00604506_m1 Cytochrome  family 3 subfamily A member 4
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit ThermoFisher Scientific 23236 Protein quantification kit
MSD Tris lysis buffer Meso Scale Diagnostics R60TX-3 Protein lysis buffer
Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit Meso Scale Diagnostics K15140D Caspase 3 detection kit
V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit Meso Scale Diagnostics K15198D
V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) Meso Scale Diagnostics K15053D
Zeiss LSM 880 Zeiss - Confocal microscope
Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 Zeiss - 20X long-distance objective lenses
Zeiss AXIOvert.A1 Zeiss - Brightfield microscope
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 Zeiss - 10X objective lenses

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 183
आंतों के क्षेत्र-विशिष्ट कार्यक्षमता को मॉडल करने के लिए मानव ऑर्गेनोइड और ऑर्गन-ऑन-ए-चिप प्रौद्योगिकी का संयोजन
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Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart,… More

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart, L., Lucchesi, C., Kasendra, M. Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality. J. Vis. Exp. (183), e63724, doi:10.3791/63724 (2022).

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