Describimos un protocolo para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético.
Artículo de método
Describimos un protocolo para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético.
La exploración del potencial terapéutico de las células madre mesenquimales depende de la facilidad de aislamiento, la potencia hacia la diferenciación y la confiabilidad y robustez de la fuente. Describimos aquí un protocolo gradual para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano (uMSC), su inmunofenotipado y la propagación de dichos cultivos en varios pasajes. En este procedimiento, la viabilidad de las uMSCs es alta porque no hay digestión enzimática. Además, la eliminación de los vasos sanguíneos, incluidas las arterias del cordón umbilical y la vena, garantiza que no haya contaminación de las células de origen endotelial. Usando citometría de flujo, las uMSCs tras el aislamiento son CD45−CD34−, lo que indica una ausencia de células del linaje hematopoyético. Es importante destacar que expresan marcadores de superficie clave, CD105, CD90 y CD73. Tras el establecimiento de cultivos, este artículo describe un método eficiente para inducir la diferenciación en estas uMSC en el linaje del músculo esquelético. Un análisis detallado de la progresión miogénica en uMSCs diferenciadas revela que las uMSCs expresan Pax7, un marcador para progenitores miogénicos en las etapas iniciales de diferenciación, seguido de la expresión de MyoD y Myf5, y, finalmente, un marcador de diferenciación terminal, la cadena pesada de miosina (MyHC).
Se ha acreditado que el cordón umbilical humano posee un reservorio robusto de células madre mesenquimales, que actualmente se están explorando para terapias regenerativas debido a sus robustas tasas de proliferación y diferenciación, propiedades inmunomoduladoras y capacidad para generar células a partir de las tres capas germinales1. El tejido del cordón umbilical consta de múltiples compartimentos como la sangre del cordón umbilical, el subendotelio de la vena umbilical y la gelatina de Wharton (WJ), que en sí misma abarca tres regiones indistintas: la zona perivascular, la zona intervascular y el subamnio o el revestimiento del cordón umbil....
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El uso de tejido del cordón umbilical en este estudio fue aprobado por el Comité Institucional para la Investigación con Células Madre (IC-SCR), el Comité de Ética Institucional, el Instituto traslacional de Ciencia y Tecnología de la Salud (IEC-THSTI), el Comité de Ética Institucional del Hospital Civil, Gurugram, Haryana, y el Comité Institucional de Bioseguridad, THSTI. Las muestras de tejido del cordón humano se recolectaron de partos a término en el momento del nacimiento. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos. Todos los métodos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices y reglamentos pertinentes.
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El éxito del aislamiento de las uMSC del tejido del cordón umbilical es del >95%, a diferencia de las bajas tasas de éxito de la sangre total del cordón umbilical. Tras el aislamiento exitoso de las uMSC, el análisis FACS revela que todas las células son CD34−CD45−CD105+CD90+. Sin embargo, en el análisis comparativo, las uMSC aisladas de la sangre del cordón umbilical muestran poblaciones heterogéneas, en las que una proporción de células muestra CD34 + CD45 .......
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Pasos críticos
Un paso crítico en este protocolo es la recolección de tejido en condiciones asépticas, desde el momento de la entrega hasta el mantenimiento de cultivos estériles, durante toda la propagación. Durante la recolección del cordón, es esencial que el cordón no toque ninguna superficie no esterilizada y se frote externamente con etanol al 70% antes de la recolección en tubos que contengan PBS suplementado con antibióticos. Es importante limitar el tiempo entre la recolección del cordón umbi.......
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Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Agradecemos al Sr. Ojas Tikoo por su ayuda con la filmación y producción de video. También reconocemos la ayuda recibida del personal de GARBH-Ini (Grupo Interdisciplinario sobre Investigación Avanzada y Resultado del Nacimiento-DBT India), enfermeras y oficiales superiores de investigación en el Hospital Civil Gurugram y el Dr. Pallavi Kshetrapal por su ayuda con la logística. Este trabajo fue apoyado por subvenciones otorgadas a Suchitra Gopinath del Departamento de Biotecnología, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Anfotericina B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Solución antibiótica 100x Líquido, endotoxina probada (10,000 U de penicilina y 10 mg de estreptomicina/mL en solución salina normal al 0.9%) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anticuerpo anti-GAPDH | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anticuerpo anti-MyHC (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anticuerpo anti-MyoD (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anticuerpo anti-miogenina (clon F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anticuerpo anti-Pax7 | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Ratón anti-humano clon CD90 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Colágeno Tipo 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucosa | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexametasona | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II o FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Suero fetal bovino, calificado Brasil | GIBCO | 10270106 | no ser inactivado por calor |
| FITC Ratón anti-humano clon CD106 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Ratón anti-humano clon CD14 M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Ratón anti-humano clon CD31 WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Ratón anti-humano clon CD34 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Ratón anti-humano clon CD45 HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Ratón anti-humano CD49D clon 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Ratón anti-humano CD90 clon 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Ratón anti-humano HLA-A,B,C clon G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Ratón anti-humano clon de IgG G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicina | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Suero de caballo | HiMedia | RM1239 | |
| Hidrocortisona | Merck | H4001 | |
| Laminina | Merck | L2020 | |
| MEM Modificación alfa sin L-glutamina, ribo- y desoxirribonucleósidos | Hyclone | SH30568. FS | Medio basal para uMSCs |
| PE Ratón anti-humano CD105 clon 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Ratón anti-humano CD44 clon 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Ratón anti-humano CD49E clon llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Ratón antihumano clon de IgG G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Ratón antihumano CLON CD73 AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH=7,4 | HiMedia | M1866 | |
| Solución de tripsina/EDTA (1x 0,25% de tripsina y 0,02% EDTA en solución salina equilibrada Hanks (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
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