Summary
Posttranslationelle modifikationer (PTM'er) ændrer proteinstrukturer og funktioner. Metoder til samtidig berigelse af flere PTM-typer kan maksimere dækningen i analyser. Vi præsenterer en protokol ved hjælp af dobbeltfunktionel Ti (IV) -immobiliseret metalaffinitetskromatografi efterfulgt af massespektrometri til samtidig berigelse og analyse af protein N-glycosylering og phosphorylering i bugspytkirtelvæv.
Abstract
Massespektrometri kan give dyb dækning af posttranslationelle modifikationer (PTM'er), selvom berigelse af disse modifikationer fra komplekse biologiske matricer ofte er nødvendig på grund af deres lave støkiometri sammenlignet med ikke-modificerede analytter. De fleste berigelsesarbejdsgange af PTM'er på peptider i bottom-up proteomics-arbejdsgange, hvor proteiner fordøjes enzymatisk, før de resulterende peptider analyseres, beriger kun en type modifikation. Det er imidlertid hele komplementet af PTM'er, der fører til biologiske funktioner, og berigelse af en enkelt type PTM kan savne en sådan krydstale af PTM'er. PTM-krydstale er blevet observeret mellem proteinglykosylering og phosphorylering, de to mest almindelige PTM'er i humane proteiner og også de to mest undersøgte PTM'er ved hjælp af massespektrometri-arbejdsgange. Ved hjælp af den samtidige berigelsesstrategi, der er beskrevet heri, beriges begge PTM'er fra post mortem humant bugspytkirtelvæv, en kompleks biologisk matrix. Dual-funktionel Ti (IV) -immobiliseret metalaffinitetskromatografi bruges til at adskille forskellige former for glycosylering og phosphorylering samtidigt i flere fraktioner i en bekvem spin tipbaseret metode, der muliggør downstream-analyser af potentielle PTM-krydstaleinteraktioner. Denne berigelsesarbejdsgang for glyco- og phosphopeptider kan anvendes på forskellige prøvetyper for at opnå dyb profilering af flere PTM'er og identificere potentielle målmolekyler til fremtidige undersøgelser.
Introduction
Protein posttranslationelle modifikationer (PTM'er) spiller en vigtig rolle i modulering af proteinstrukturer og dermed deres funktioner og downstream biologiske processer. Mangfoldigheden af det humane proteom stiger eksponentielt på grund af den kombinatoriske variabilitet, der ydes af forskellige PTM'er. Forskellige varianter af proteiner fra deres kanoniske sekvenser som forudsagt af genomet er kendt som proteoformer, og mange proteoformer stammer fra PTM'er1. At studere proteoform mangfoldighed i sundhed og sygdom er blevet et forskningsområde af stor interesse i de senere år 2,3.
Studiet af proteoformer og mere specifikt PTM'er med stor dybde er blevet mere letkøbt gennem udviklingen af massespektrometri (MS)-baserede proteomics-metoder. Ved hjælp af MS ioniseres analytter, fragmenteres og identificeres baseret på m / z af fragmenter. Berigelsesmetoder er ofte nødvendige på grund af den lave relative overflod af PTM'er sammenlignet med ikke-modificerede former for proteiner. Selvom analyse af intakte proteiner og deres PTM'er, kaldet top-down-analyser, er blevet mere rutinemæssig, er den enzymatiske fordøjelse af proteiner og analysen af deres komponentpeptider i bottom-up-analyser stadig den mest anvendte rute til PTM-analyse. De to mest undersøgte PTM'er, og de to mest almindelige PTM'er in vivo, er glykosylering og phosphorylering4. Disse to PTM'er spiller store roller i cellesignalering og genkendelse og er således vigtige ændringer at karakterisere i sygdomsforskning.
De kemiske egenskaber af forskellige PTM'er giver ofte ruter til berigelse af disse PTM'er på protein- og peptidniveauerne inden analysen. Glycosylering er en hydrofil PTM på grund af overflod af hydroxylgrupper på hvert monosaccharid. Denne egenskab kan bruges til at berige glycopeptider i hydrofil interaktionskromatografi (HILIC), som kan adskille flere hydrofile glycopeptider fra de hydrofobe ikke-modificerede peptider5. Phosphorylering tilføjer fosfatdelen, som er negativt ladet undtagen ved sur pH. På grund af denne ladning kan forskellige metalkationer, herunder titanium, bruges til at tiltrække og binde phosphopeptider, mens ikke-phosphorylerede arter vaskes væk. Dette er princippet om immobiliseret metalaffinitetskromatografi (IMAC). Yderligere diskussioner af disse og andre berigelsesstrategier for glykosylering og phosphorylering findes i nylige gennemgange 6,7.
Forholdsvis store mængder udgangspeptidmateriale (0,5 mg eller mere) er ofte nødvendige til berigelsesprotokoller på grund af den lave støkiometri af PTM'er på peptider. I scenarier, hvor denne mængde prøve måske ikke let opnås, såsom tumorkernebiopsi eller cerebrospinalvæskeanalyser, er det fordelagtigt at anvende letkøbte arbejdsgange, der resulterer i maksimal biomolekylær information. Nylige strategier udviklet af vores laboratorium og andre har fremhævet den samtidige og parallelle analyse af glykosylering og phosphorylering ved hjælp af den samme PTM-berigelsesarbejdsgang 8,9,10,11,12. Selvom de kemiske egenskaber ved disse to PTM'er kan variere, kan disse PTM'er analyseres i flere trin på grund af de innovative separationsteknikker og materialer, der anvendes. For eksempel overlejrer elektrostatisk frastødning-hydrofil interaktionskromatografi (ERLIC) separationer baseret på hydrofile interaktioner mellem analytter og den mobile fase med ladningsladningsinteraktioner mellem analytter og det stationære fasemateriale 13,14,15,16. Ved sur pH kan tiltrækningen af phosphorylerede peptider til den stationære fase forbedre deres retention og adskillelse fra ikke-modificerede peptider. Materiale bestående af Ti(IV) immobiliseret på hydrofile mikrosfærer kan anvendes til HILIC- og IMAC-baseret eluering til at adskille phosphopeptider og neutrale, sure og mannose-6-phosphorylerede glycopeptider17,18. Denne strategi er kendt som dobbeltfunktionel Ti(IV)-IMAC. Brug af disse strategier til berigelse af flere PTM'er i en enkelt arbejdsgang kan gøre analyser af potentielle PTM-krydstaleinteraktioner mere tilgængelige. Derudover er det samlede prøvemængde- og tidskrav mindre end de konventionelle tilsætningsmetoder, når de udføres parallelt (dvs. HILIC og IMAC på separate prøvealifkvoter).
For at demonstrere den dobbeltfunktionelle Ti (IV) -IMAC-strategi til samtidig analyse af proteinglykosylering og phosphorylering har vi anvendt den til at analysere post mortem humant bugspytkirtelvæv. Bugspytkirtlen producerer både fordøjelsesenzymer og regulatoriske hormoner, herunder insulin og glukagon. Bugspytkirtelfunktionen er nedsat i bugspytkirtelsygdom. I diabetes påvirkes reguleringen af blodsukkeret, hvilket fører til højere niveauer af glukose i blodet. I pancreatitis skyldes betændelse automatisk fordøjelse af organet3. Ændringer i PTM-profiler, herunder glykosylering og phosphorylering, kan, som det ofte er tilfældet, resultere i andre sygdomme.
Her beskriver vi en protokol for en spin-tip-baseret samtidig berigelsesmetode baseret på en dobbeltfunktionel Ti (IV) -IMAC-strategi for N-glycopeptider og phosphopeptider afledt af proteiner ekstraheret fra bugspytkirtelvæv. Protokollen omfatter proteinekstraktion og fordøjelse, berigelse, MS-dataindsamling og databehandling, som det kan ses i figur 1. Repræsentative data fra denne undersøgelse er tilgængelige via ProteomeXchange Consortium med identifikator PXD033065.
Figur 1: Arbejdsgang til samtidig analyse af N-glycopeptider og phosphopeptider fra humant bugspytkirtelvæv. Væv pulveriseres først til et fint pulver før proteinekstraktion ved hjælp af vaskemidlet natriumdodecylsulfat (SDS). Proteiner udsættes derefter for enzymatisk fordøjelse. De resulterende peptider aliquoteres inden berigelse ved anvendelse af dobbeltfunktionel Ti(IV)-IMAC. Rådata indsamles ved hjælp af nanoskala omvendt fase væskekromatografi-massespektrometri (nRPLC-MS) og analyseres ved hjælp af databasesøgningssoftware. Klik her for at se en større version af denne figur.
Denne protokol er beregnet til at gøre PTM-analyser mere tilgængelige og muliggøre mere udbredt analyse af flere PTM'er i samme arbejdsgang. Denne protokol kan anvendes på andre komplekse biologiske matricer, herunder celler og biofluider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev opnået samtykke til brug af bugspytkirtelvæv til forskning fra afdødes nærmeste familie, og der blev opnået en tilladelse fra University of Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board. IRB-tilsyn er ikke påkrævet, fordi det ikke involverer mennesker som anerkendt i 45 CFR 46.102 (f).
FORSIGTIG: Der skal udvises forsigtighed ved håndtering af de reagenser, der anvendes i denne protokol, som omfatter syrer (myresyre, eddikesyre, trifluoreddikesyre), baser (ammoniumhydroxid) og kryogener (flydende nitrogen). Læs sikkerhedsdatabladene for de reagenser, der anvendes til at blive fortrolige med de dermed forbundne farer og de nødvendige forholdsregler. Koncentrationer betegnet med procenter er volumen/totalvolumen (v/v) og fortyndes med vand.
1. Vævskryopulverisering, lysis og proteinekstraktion
- Fyld en dewar med flydende nitrogen. Forkøl de dele af vævspulvereren, der kommer i kontakt med bugspytkirtelvævet, nemlig kammeret, pulverisatoren og genopretningsskeen i en polystyrenbeholder.
- De frosne vævsstykker overføres til den forkølede prøveholder, og der tilsættes en skefuld flydende nitrogen til vævet.
- Anbring pulverisatoren i kammeret og slå den med en hammer fem til ti gange for at knuse prøven. Fjern pulverisatoren fra kammeret og skrab klæbende vævspulver og stykker af.
- Tilsæt en skefuld flydende nitrogen til kammeret, hvis væv begynder at smelte. Gentag pulveriseringsprocessen, indtil prøven er et fint pulver uden store vævsstykker. Prøverne hældes i ca. 100 mg alikvoter i forkølede rør.
- Forbered lysisbuffer indeholdende 4% natriumdodecylsulfat (SDS), 150 mM NaCl og 25 mM Tris (pH = 7,4). Opløs en tablet hver protease og fosfatasehæmmer i 500 μL vand for en 20x lager af hver. Der tilsættes det krævede volumen på 20x lager af hver inhibitor til lysisbufferen for en endelig 1x koncentration.
- Der tilsættes 600 μL lysisbuffer pr. 100 mg væv til røret, og der inkuberes ved 95 °C i en varmeblok i 10 minutter med omrystning ved 800 o/min. Fjern prøverne fra varmeblokken, og lad dem køle af til stuetemperatur.
- Soniker prøverne ved 60 W energi (20 kHz) i 45 s ved hjælp af 15 s impulser med en 30 s hvile imellem. Pellet prøverne ved 3.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten tilsættes til et 5x udfældningsopløsningsmiddel, 300 μL lysisbuffer til 1,5 ml udfældningsopløsningsmiddel, indeholdende 50% acetone, 49,9% ethanol og 0,1% eddikesyre. Chill natten over ved -20 °C.
- Pellet prøverne igen ved 3.000 x g i 15 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten. Vask pelleten ved at bryde op med en spatel og blande med den samme mængde udfældningsopløsningsmiddel. Pellet igen, gentag vasketrinet 2x.
- Prøven pelleteres ved 16.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Lufttør prøvepillen i en røghætte i 15 minutter og opbevares ved -80 °C, indtil den er klar til at fortsætte.
2. Proteinfordøjelse og afsaltning
- Proteinpellet genanvendes i 300 μL frisklavet fordøjelsesbuffer indeholdende 50 mM triethylammoniumbicarbonat (TEAB) og 8 M urinstof.
- Estimer proteinkoncentrationen af opløsningen ved hjælp af et proteinassay i henhold til producentens protokol.
- Til proteinet i opløsningen tilsættes dithiothreitol (DTT) til en slutkoncentration på 5 mM, blandes og reduceres ved stuetemperatur i 1 time. Derefter tilsættes iodoacetamid (IAS) til en slutkoncentration på 15 mM, blandes og alkyleres ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke. Sluk alkylering ved at gentage tilsætningen af DTT i samme volumen som før og bland.
- LysC/trypsin tilsættes i forholdet 1:100 mellem enzym og protein, og der inkuberes ved 37 °C i 4 timer. Derefter tilsættes 50 mM TEAB for at fortynde 8 M urinstof, der bruges til at < 1 M. Tilsæt trypsin ved 1:100 enzym: proteinforhold og inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Sluk fordøjelsen med tilsætning af trifluoreddikesyre (TFA) til 0,3% v/v. For hver 1 mg startprotein skal du konditionere en afsaltningspatron (1 cc, 10 mg) med 1 ml acetonitril (ACN) og 3x med 1 ml 0,1% TFA.
- Læg den fordøjede blanding på afsaltningspatronen. Blandingen vaskes 3x med 1 ml 0,1% TFA. Hvis elionen er langsom, skal du anvende positivt tryk, men undgå en strømningshastighed > en dråbe i sekundet.
- Elut peptider ved hjælp af 1 ml 60% ACN og 0,1% myresyre (FA) opløsning. Tør eluterede peptider ved ca. 35 °C ved hjælp af en centrifugalvakuumkoncentrator, indtil opløsningsmidlet er helt fordampet.
- Resuspend peptider i 300 μL vand og estimere peptidkoncentrationer ved hjælp af et peptidassay i henhold til producentens protokol. Del peptiderne i 500 μg aliquoter og tør fuldstændigt.
3. ERLIC N-glycopeptid berigelse
BEMÆRK: Nøjagtige centrifugehastigheder og -tider kan variere afhængigt af prøver og skal optimeres. Generelt er 300 x g i 2 min passende til konditionering og vask af materialet og 100 x g i 5 min til eluering.
- Afvej ca. 3 mg vat og pak det i en tom 200 μL pipettespids (spin-tip; se Materialetabel).
- Overfør stærkt anionbytterberigelsesmateriale til et rør og tilsæt 200 μL 0,1% TFA pr. 10 mg materiale. Til berigelse af 500 μg peptider anvendes 15 mg af materialet. Aktiver materialet ved at ryste i 15 min.
- Brug en røradapter til at placere spin-tippen over et 2 ml rør og tilsæt nok opslæmning til spidsen til 15 mg materiale. Fjern væsken ved at dreje i en bordcentrifuge.
- Konditioner materialet ved at centrifugere 3x med 200 μL ACN. Gentag tredobbelt konditioneringen med 100 mM ammoniumacetat (NH4Ac), 1% TFA og 80% ACN/0,1% TFA (belastningsbuffer).
- Resuspend 500 μg peptidprøver i ca. 200 μL belastningsbuffer og strømmer gennem spinspidsen. Genindlæs gennemstrømningen 2x for at sikre fuldstændig binding.
- Materialet vaskes ved at centrifugere 5x med 200 μL 80 % ACN/0,1 % TFA og derefter 2x med 200 μL 80 % ACN/0,1 % FA.
- Eluter peptiderne ved centrifugering med 200 μL af hver af følgende: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3) 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
- Materialet vaskes ved centrifugering 2x med 200 μL 80 % ACN/5 % NH4OH. Eluter de resterende peptider med 200 μL 10%NH4OH (E5).
- Alle legeringerne tørres fuldstændigt ved hjælp af en centrifugalvakuumkoncentrator ved ca. 35 °C.
- Udfør afsaltning af den grundlæggende eluering (E5) ved hjælp af en afsaltningstip i henhold til producentens protokol.
- Elionen tørres fra afsaltningsspidsen ved hjælp af en centrifugalvakuumkoncentrator ved ca. 35 °C for at fuldføre den.
4. Ti(IV)-IMAC-berigelse af phosphopeptid
BEMÆRK: Nøjagtige centrifugehastigheder og -tider kan variere afhængigt af prøver og skal optimeres. Generelt er 300 x g i 2 min passende til konditionering og vask af materialet og 100 x g i 5 min til eluering.
- Afvej ca. 3 mg vat og pakk det i en tom 200 μL pipettespids (spin-tip).
- Ti-IMAC phosphopeptid berigelsesmateriale til et rør og tilsæt 200 μL 0,1% TFA pr. 10 mg materiale. Til berigelse af 500 μg peptider anvendes 10 mg materiale.
- Brug en røradapter til at placere spin-tippen over et 2 ml rør og tilsæt nok gylle til spidsen til 10 mg materiale. Fjern væsken ved at dreje i en bordcentrifuge.
- Konditioner materialet med 200 μL 40% ACN/3% TFA ved hjælp af de samme centrifugeindstillinger som beskrevet ovenfor. Resuspend peptidprøver i 200 μL af 40% ACN/3% TFA og flow gennem spin-tip. Genindlæs gennemstrømningen to gange for at sikre mere komplet binding.
- Materialet vaskes ved centrifugering med 200 μL 50 % ACN, 6 % TFA og 200 mM NaCl opløsning, efterfulgt af vask 2x i 200 μL 30 % ACN og 0,1 % TFA opløsning.
- Elutpeptider med 200 μL 10% NH4OH. Tør elionen helt under vakuum. Udfør afsaltning ved hjælp af en afsaltningstip i henhold til producentens protokol. Tør elionen fra afsaltningsspidsen under vakuum til fuldstændighed.
5. Dobbeltfunktionel Ti(IV) samtidig berigelse
BEMÆRK: Nøjagtige centrifugehastigheder og -tider kan variere afhængigt af prøver og skal optimeres. Generelt er 300 x g i 2 min passende til konditionering og vask af materialet og 100 x g i 5 min til eluering.
- Væg ca. 3 mg bomuldsuld og pakk det i en tom spin-tip.
- Overfør ca. 1 g Ti(IV)-IMAC materiale til et rør. Der tilsættes 0,1 % TFA til en kendt koncentration af materiale, f.eks. 20 mg/200 μL (materiale kan opbevares i denne suspension ved 4 °C).
- Til berigelse fra 500 μg peptider tilsættes tilstrækkelig opslæmning til en spin-tip til overførsel af 20 mg materiale. Spinspidsen vaskes ved centrifugering med 200 μL 0,1 % TFA.
- Resuspender prøverne i 200 μL påfyldnings-/vaskeopløsningsmiddel (80% ACN og 3% TFA) og flow gennem spin-tippen. Genindlæs gennemstrømningen 2x.
- Centrifugeringsspidsen vaskes 6x ved centrifugering med 200 μL påfyldnings-/vaskeopløsningsmiddel. Centrifugeringsspidsen vaskes med 200 μL 80 % ACN/0,1 % FA-opløsning.
- Eluter peptiderne med 200 μL af hver af følgende: 60% ACN/0,1% FA (E1) og 40% ACN/0,1% FA (E2). Analyser hver eluering separat.
- Eluter peptiderne med 200 μL af hver af følgende: 20% ACN/0,1% FA og 0,1% FA. Kombiner de to elutioner og analyser som en prøve (E3).
- Eluter peptiderne med 200 μL af hver af følgende: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; og 30% ACN/0,1% TFA. Kombiner disse elutioner og analyser som en (E4) efter afsaltning ved hjælp af en pakket spids.
- Konditioner materialet til basisk pH ved hjælp af 200 μL 90% ACN/2,5% NH4OH i 3x. Kassér disse vaske.
- Eluter peptiderne med 200 μL af hver af følgende: 60% ACN/10% NH4OH (E5) og 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analyser disse elutioner separat efter afsaltning ved hjælp af en pakket spids.
- Eluter peptiderne med 200 μL af hver af følgende: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; og 10% NH4OH. Kombiner disse elutioner og analyser som en (E7) efter afsaltning ved hjælp af en pakket spids.
- Tør alle elueringerne helt under vakuum.
6. Nano-flow omvendt fase væskekromatografi-massespektrometri (nRPLC-MS)
BEMÆRK: MS dataindsamlings- og analysemetoder er forskellige, og derfor er kun en foreslået LC-MS-pipeline (og dens tilknyttede parametre) beskrevet her i følgende trin. Prøver genereret ved hjælp af de tidligere skitserede prøveforberedelses- og berigelsestrin kan analyseres ved hjælp af andre instrumentelle opsætninger, herunder ved hjælp af kommercielt tilgængelige kromatografiske kolonner, givet tilstrækkelig datakvalitet.
- Træk og pak en 15 cm lang kapillær (75 μm indvendig diameter) ved hjælp af C18-materiale som beskrevet i19. Forbered mobil fase A (0,1% FA i vand) og mobil fase B (0,1% FA i ACN).
- Rekonstituer berigede peptidprøver i 15 μL 3% mobil fase B. Læg 2 μL af prøven (~ 13% prøvevolumen) direkte på søjlen. Analyser hver prøve i teknisk duplikat.
- Elutpeptider ved hjælp af en gradient fra 3% til 30% mobil fase B over 90 minutter ved en strømningshastighed på 0,3 μL / min. Kolonnen vaskes med 75% B i 8 min efterfulgt af 95% B i 8 min, og afslut metoden med ækvilibrering ved 3% B i 12 min.
- Betjen massespektrometeret i positiv iontilstand ved hjælp af dataafhængig erhvervelse af de øverste 20 toppe med følgende parametre: sprøjtespænding 2 kV; MS 1-detektion i LC/MS fra 400-2.000 m/z ved 120.000 opløsning, 2E5 automatic gain control (AGC)-mål, 100 ms maksimal injektionstid, 30 % RF-objektiv, quadrupolisolering med 1,6 m/z vindue, for opladningstilstande 2-8 og ubestemt og 30 s dynamisk udelukkelse; MS 2-detektion i LC/MS ved hjælp af trinvis HCD-fragmentering ved 22%, 30% og 38%, fast første masse 120 m/z ved 30.000 opløsning, 5E4 AGC-mål og 2,5E4 minimumsintensitetskrav.
7. Analyse af ms-data
BEMÆRK: En dataanalysepipeline, der bruger to forskellige software til at analysere det samme datasæt, præsenteres her. Fosforylering og glykosylering kan søges på samme tid ved hjælp af en enkelt software i stedet for to separate software som beskrevet her, selvom softwaresøgningstiden generelt er proportional med søgerummet, dvs. antallet af PTM'er, der overvejes. Af denne grund anvendes to forskellige software parallelt med søgningen efter glycopeptider og phosphopeptider.
- Behandle rådatafiler ved hjælp af den relevante software (se Materialetabel).
- Søg spektre mod UniProts humane (eller relevante artsspecifikke) database. Indstil carbamidomethylering af Cys som en fast modifikation. Indstil det maksimale antal savnede enzymatiske spaltninger som to.
- I de rå datafiler, ved hjælp af en kommerciel software (se Tabel over materialer), søg efter glycopeptider, der skal analyseres20. Brug en 10 ppm forløbermassetolerance og en 0,01 Da fragmentmassetolerance med en mindste peptidlængde på fire rester.
- Søg ved hjælp af den softwareindlejrede N-glycan-database udvidet med typiske mannose-6-phosphat(M6P)glycaner, herunder HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1) og HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1).
- Indstil N-glycosylering som en almindelig modifikation. Indstil de maksimale samlede modifikationer pr. peptidspektral match (PSM) som en almindelig og to sjældne.
- Indstil følgende variable modifikationer: oxidation af Met (sjælden), deamidering ved Asn og Gln (sjælden) og phosphorylering ved Ser, Thr og Tyr (almindelig). Indstil følgende identifikationsfiltre: score cut-off > 150, |log prob| > 1, og delta mod score > 10.
- Eksportér og analysér søgeresultater under fanerne Proteiner og Peptidgruppe.
- Manuel screening af identifikationer indeholdende M6P-glycaner for tilstedeværelsen af PhosphoHex oxoniumion (243 m/z) i MS/MS-spektrene og fjern falske positive identifikationer, som ikke indeholder denne diagnostiske ion.
- I de rå datafiler, ved hjælp af en open source-software (se Materialetabel), skal du søge efter phosphopeptider, der skal analyseres21. Brug en 20 ppm første søgning peptid tolerance og en 4,5 ppm hoved søgning peptid tolerance.
- Indstil det maksimale antal modifikationer pr. peptid til 5. Indstil PSM og protein falsk opdagelseshastighed (FDR) til 1% og minimum peptidlængde til 7 rester.
- Indstil variable modifikationer som oxidation ved Met, N-terminal proteinacetylering og phosphorylering ved Ser, Thr og Tyr. Analyser søgeresultater ved hjælp af modifikationsspecifikationsfilerne.
- Bestem antallet af identifikationer af PTM'er på protein-, peptid- og modifikationsstedsniveauerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative massespektrometridata, herunder råfiler og søgeresultater, er blevet deponeret til ProteomeXchange Consortium via PRIDE-partnerlageret med datasætidentifikatoren PXD03306522.
I dette arbejde blev duplikatinjektionsreplikater analyseret for hver berigelseselvricitet. Identifikationer foretaget fra begge tekniske replikater blev indsamlet i den endelige analyse. På grund af den semi-stokastiske karakter af dataafhængig erhvervelse ved plukning af peptidprækursorer til MS / MS-fragmentering forventes identifikationsoverlap på ca. 70% -80% mellem tekniske duplikater. I applikationer, der bruger disse metoder, tilskyndes der til mindst to tekniske replikater. Ved downstream statistiske analyser bør der tages hensyn til biologiske replikater for forskellige forsøgsbetingelser. Afhængigt af den ønskede strenghed for datarapportering kan det være nyttigt at indstille filtre til identifikation, f.eks. identifikation i mindst x antal tekniske eller biologiske replikater, der skal rapporteres.
Et eksempel på total ionkromatogram (TIC) for hver eluering fra hver berigelse kan ses i supplerende figur S1, supplerende figur S2 og supplerende figur S3. Brug af strenge filtre under databasesøgning af rå MS-filer kan sikre mere nøjagtige og mere sikre identifikationer af MS / MS-spektre til peptidsekvenser med PTM'er. Som det fremgår af TIC'erne for hver eluering, er peptidprøverne stadig komplekse, selv efter fraktionering fra berigelsen. Nanoflowkromatografi kombineret med en høj opløsning, høj massenøjagtighed og hurtigscanningsmassespektrometer kan hjælpe med at analysere komplekse blandinger, såsom peptider fra en tryptisk fordøjelse, med stor følsomhed og dybde. Eksempler på MS/MS-spektre for glykosylerede og phosphorylerede spektre ses i figur 2. Velannoterede spektre som disse skyldes en rig fragmentering af prækursorer, hvilket øger tilliden til identifikationen som tildelt af databasesøgningssoftwaren.
Figur 3 illustrerer peptididentifikationerne foretaget ved hjælp af den dobbeltfunktionelle Ti (IV) -IMAC spin-tip berigelsesmetode over hver elueringsfraktion. Størstedelen af glycopeptider eluerer i de første fire fraktioner, mens størstedelen af phosphopeptider eluerer i de sidste tre fraktioner. Denne adskillelse af forskellige PTM'er blandt fraktionerne hjælper med at forhindre enhver interferens i ionisering, der kan opstå, hvis de ikke var så tilstrækkeligt adskilt på tværs af elutioner.
Figur 4 sammenligner glycoproteomics-resultaterne fra dual Ti-metoden sammenlignet med en ERLIC glycopeptid-kun berigelse. Som det kan ses i figur 4A, er mange identifikationer på protein-, glycoform-, PTM- og modifikationsstedsniveauer fælles for begge metoder. ERLIC har dog mere unikke identifikationer på alle niveauer sammenlignet med den dobbelte Ti-metode. Dette omfatter M6P (høj mannose glycaner med mindst en phosphatgruppe) glycoformer, som kræver yderligere manuel kuratering af dataene for at fjerne falske positive identifikationer. Endvidere er de typer glycaner, der er identificeret ved anvendelse af begge metoder, ens. Proportionerne af hver type glycan efter binning i seks kategorier baseret på deres sammensætninger er ens mellem begge metoder16.
Phosphoproteomics-resultater fra den dobbelte Ti-metode sammenlignes med en konventionel IMAC-phosphopeptid-kun berigelse i figur 5. Den dobbeltfunktionelle Ti (IV) berigelse fungerer på samme måde som konventionel IMAC som vist ved betydelig overlapning på protein-, peptid- og PTM-niveauerne. Ved hjælp af begge metoder er størstedelen af phosphorylerede aminosyrer serin og threonin, med omkring 1% phosphoryleret tyrosin identificeret også. Begge metoder kan også bruges til at identificere multi-phosphorylerede peptider.
Listerne over modificerede proteiner er kortlagt til gener og analyseret ved hjælp af genontologi (GO) berigelse som vist i figur 6 og figur 7. GO-analyser for de modificerede proteiner identificeret ved hjælp af ERLIC og IMAC er vist i supplerende figur S4 og supplerende figur S5. Det gratis, online Metascape-værktøj udfører berigelsen og skaber netværk baseret på berigede veje og processer, der forbinder dem ved lighed23. Nodeudtrykkene for hver GO-analyse findes i supplerende tabel S1, supplerende tabel S2, supplerende tabel S3 og supplerende tabel S4. Da glykosylering er et vigtigt protein PTM i den ekstracellulære matrix, er det ikke overraskende, at flere udtryk beriget ved anvendelse af listen over identificerede N-glycoproteiner er relateret til den ekstracellulære matrix. Fosforylering er involveret i cellesignalering, og dette kan ses i flere berigede termer fundet ved hjælp af listen over identificerede phosphoproteiner.
Figur 2: Kommenterede MS/MS-spektre med høj konfiden fra N-glycosylerede og phosphorylerede peptider. (A) Mannose-6-phosphoryleret peptid GSLSYLN(HexNAc(2)Hex(7)Phospho(1))VTR fra cathepsin D (CATD) identificeret fra retentionstiderne 53,08-53,33 min. fra den syvende berigelseselvstundring. Tilstedeværelsen af PhosphoHex oxoniumionen ved 243 m/z forbedrer tilliden til denne PTM-opgave. (B) Phosphoryleret peptid VEEEQEADEEDVS(Phospho)EEEAESK fra thioredoxinrelateret transmembranprotein 1 (TMX1) fra retentionstiderne 32,31-32,72 min. fra den sjette berigelseselvitation. Tilstedeværelsen af -98 (-H3PO4) neutrale tab mellem peptidfragmentioner og deres de-phosphorylerede varianter (betegnet med fragment *) forbedrer tilliden til denne PTM-opgave. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sammenligning af peptididentifikationer fra dobbeltfunktionel Ti (IV) -IMAC berigelse på tværs af syv elutioner. Antallet af identifikationer inkluderer peptider identificeret i mindst en af de to tekniske (injektion) replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sammenligning af glycoproteomics resultater fra dobbeltfunktionel Ti (IV) -IMAC berigelse sammenlignet med en konventionel ERLIC glycopeptid berigelse. (A) Venn diagrammer af glycoprotein, glycoform (protein, site, glycan), glycan sammensætning og glycosit identifikationer mellem berigelsesmetoder. (B) Cirkeldiagrammer over glycaner identificeret på peptid rygrader mellem berigelsesmetoder. Glycaner bineres i seks grupper baseret på deres sammensætning16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning af phosphoproteomics resultater fra dobbeltfunktionel Ti(IV)-IMAC berigelse sammenlignet med en konventionel Ti(IV)-IMAC phosphopeptidberigelse. (A) Venn diagrammer over phosphoprotein, phosphopeptid og phosphosit identifikationer mellem berigelsesmetoder. (B) Cirkeldiagrammer over sikkert lokaliserede (75% eller højere sandsynlighed) phosphositter opdelt efter aminosyrerest. (C) Stablet barplot af identificerede phosphopeptider binned af et antal phosphorylerede rester. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Geneontologisk berigelse af N-glycoproteiner identificeret ved anvendelse af dobbeltfunktionel Ti(IV)-IMAC-berigelse. N-glycoproteiner kortlægges tilbage til gener, og signifikant berigede veje og procestermer identificeres ved hjælp af hele genomet som baggrund. Forskellige farver bruges til at mærke klynger af udtryk, der er forbundet med termlighed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Geneontologisk berigelse af phosphoproteiner identificeret ved anvendelse af dobbeltfunktionel Ti(IV)-IMAC-berigelse. Fosfoproteiner kortlægges tilbage til gener, og signifikant berigede veje og procesudtryk identificeres ved hjælp af hele genomet som baggrund. Forskellige farver bruges til at mærke klynger af udtryk, som er forbundet med termlighed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Eksempel på samlede ionkromatogrammer (TIC'er) fra hver eluering fra dobbeltfunktionel Ti(IV)-IMAC (E1 til E7, paneler A-G) berigelse. Det samlede signal (ionstrøm) afbildes over dataindsamlingsperioden på 117 minutter. Intensiteten af basistoppen er givet ved værdien NL. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Eksempel på samlede ionkromatogrammer (TIC'er) fra hver eluering fra ERLIC (E1 til E5, panel A-E) berigelse. Det samlede signal (ionstrøm) afbildes over dataindsamlingsperioden på 117 minutter. Intensiteten af basistoppen er givet ved værdien NL. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Eksempel på total ionkromatogram (TIC) fra eluering fra Ti-IMAC-berigelse. Det samlede signal (ionstrøm) afbildes over dataindsamlingsperioden på 117 minutter. Intensiteten af basistoppen er givet ved værdien NL. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S4: Geneontologisk berigelse af N-glycoproteiner identificeret ved anvendelse af konventionel glycopeptidberigelse med ERLIC. N-glycoproteiner kortlægges tilbage til gener, og signifikant berigede veje og procestermer identificeres ved hjælp af hele genomet som baggrund. Forskellige farver bruges til at mærke klynger af udtryk, som er forbundet med termlighed. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S5: Geneontologiberigelse af phosphoproteiner identificeret ved anvendelse af konventionel phosphopeptidberigelse med Ti(IV)-IMAC. Fosfoproteiner kortlægges tilbage til gener, og signifikant berigede veje og procesudtryk identificeres ved hjælp af hele genomet som baggrund. Forskellige farver bruges til at mærke klynger af udtryk, som er forbundet med termlighed. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabeller S1-S4: Metascape-nodeoplysninger til genontologiberigelsesanalyser. Tabeller indeholder nodeoplysninger for lister over N-glycoproteiner og phosphoproteiner identificeret ved anvendelse af dobbelt Ti (tabel S1 og tabel S2), N-glycoproteiner ved anvendelse af ERLIC (tabel S3) og phosphoproteiner ved hjælp af IMAC (tabel S4). Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den dobbeltfunktionelle Ti(IV)-IMAC-strategi er nyttig til samtidig analyse af N-glycopeptider og phosphopeptider fra den samme prøve i en enkelt prøveforberedelsesarbejdsgang. ERLIC-baserede metoder har også vist sig at udføre samtidig berigelse af PTM'er. Begge strategier er tidligere blevet brugt til dyb dækning i PTM-analyser14,18. Ved at tilpasse den dobbelte Ti-metode til at reducere prøveinkubationstiden ved hjælp af spin-tips håber vi, at denne protokol er blevet mindre ressourceintensiv og dermed mere bredt tilgængelig.
Den samtidige analyse af flere PTM'er opnås gennem synergistiske interaktioner mellem analytter og de funktionelle grupper på overfladen af berigelsesmaterialet. I første pakning af spin-tips med bomuld øges retentionen af glycopeptider i en HILIC-tilstand på grund af forekomsten af hydroxylgrupper på cellulose24. Ved anvendelse af vand og acetonitril (et vandblandbart opløsningsmiddel) bevares glycopeptider og adskilles på grund af dannelsen af vand og organiske lag. Materialet til dobbeltfunktionel Ti(IV)-berigelse er afhængigt af de immobiliserede Ti(IV)-kationer til binding af phosphopeptider. De hydrofile egenskaber af materialets sidekæder anvendes til at fastholde glycopeptider i en HILIC-tilstand, som først elueres under anvendelse af sur eluering med stigende vandigt indhold. Materialet vaskes yderligere med konventionelle IMAC-phosphopeptidberigelsesbuffere til eluterede sialylerede glycopeptider, som har højere affinitet til den stationære fase end andre neutrale glycopeptider. Efter konditionering af materialet til basisk pH anvendes ammoniumhydroxid og ACN-opløsning til at bryde de elektrostatiske interaktioner, der holder fosfopeptider bundet til materialet. I mellemtiden tillader det faldende organiske indhold adskillelse af mono- og multi-phosphorylerede peptider og M6P glycopeptider.
Ved adskillelse af PTM'er ved hjælp af flere elueringstrin i samme arbejdsgang kan biomolekylær information maksimeres fra begrænsede prøver. En advarsel med sådanne dobbelte PTM-analysearbejdsgange er kravet om en relativt stor mængde prøve (0,5 mg peptider) som udgangsmateriale for hver berigelse, når mindst fem fraktioner opsamles. Ikke desto mindre giver den samtidige berigelsesstrategi, der præsenteres her, stadig betydelige besparelser af materialer sammenlignet med konventionelle strategier. Selv før berigelse er flere vigtige trin nødvendige for at sikre PTM-integritet og for at undgå artefaktuelt tab af PTM-information. Disse omfatter korrekt opbevaring af prøver ved lave temperaturer, når de ikke er i brug (ideelt -80 °C), anvendelse af protease- og fosfatasehæmmere under proteinekstraktion og anvendelse af en hydrofil peptidoprydningsmetode, såsom HLB-patronerne, der anvendes her.
Det er blevet observeret, at ERLIC (konventionel glycopeptidberigelse) resulterede i bedre glycoproteomdækning, mens dobbeltfunktionel Ti (IV) -IMAC blev overgået i unikke identifikationer af konventionelle Ti-IMAC i phosphoproteomics resultater. ERLIC-materialets fysiske struktur og øgede hydrofilicitet sammenlignet med det dobbelte Ti-berigelsesmateriale er sandsynligvis en vigtig faktor i den forbedrede glycoproteomdækning i ERLIC. Den øgede dækning af fosfoproteomet i konventionel IMAC kan være et resultat af nedsat ionundertrykkelse fra fjernelse af glycopeptider under de første elueringstrin og vasketrin. På trods af disse små fald i dækningen ved hjælp af den samtidige dual Ti-arbejdsgang opnås der stadig betydelig overlapning med konventionel enkelt PTM-berigelse med den ekstra fordel, at der kun udføres en berigelsesarbejdsgang i stedet for to.
Med hensyn til tidsbegrænsninger har ERLIC og konventionel Ti-IMAC færre fraktioner end den dobbelte Ti-arbejdsgang. Med hensyn til nødvendige ressourcer er det anionbyttemateriale, der er nødvendigt for ERLIC, billigere end det funktionaliserede materiale, der er nødvendigt til de dobbelte Ti- og konventionelle IMAC-arbejdsgange. I disse protokoller blev kun N-bundet og ikke O-bundet glykosylering analyseret. Enzymet PNGase F kan (og bør) bruges til at spalte N-glycaner for at begrænse antallet af falske positiver opnået ved søgning efter O-glycopeptider. Det har imidlertid vist sig, at denne strategi reducerer SPECIFICITETEN AF HILIC og ERLIC for glycopeptidberigelse25. I protokollen bruges en strategi ved hjælp af to separate software til at analysere rådatafiler. Byonic, en kommerciel software, betragtes som guldstandarden til analyse af glycoproteomics data. På grund af mangfoldigheden af N-glycanstrukturer øges peptidsøgningsrummet, hvilket øger søgetiderne. Fosforylering kan også tilføjes som en almindelig PTM ud over glykosylering under søgning, selvom søgetider kan skyrocket afhængigt af om peptidmultoforylering overvejes. MaxQuant, en open source-software, kan optimeres for at minimere FDR i fosfopriteomics-resultater, selvom kompleks glykosylering ikke er så letkøbt at søge. Der er også andre open source-muligheder for søgning efter glycoproteomiske data 26,27,28. Afhængigt af de eksperimentelle mål og tilgængelige ressourcer kan LC-MS og dataanalysepipelinen, der er beskrevet her, bruges som præsenteret eller ændres. Yderligere optimering af metoderne forventes at forbedre dækningen af PTM'erne.
PTM'er spiller en vigtig rolle i biokemiske processer på grund af de ændringer i proteinstrukturen, de giver. Det er ideelt, at alle proteomiske analyser tager højde for alle protein-PTM'er samtidigt. Betydningen af summen af al proteinglykosylering er for eksempel blevet betegnet meta-heterogenitet29. Målet om total PTM-analyse er dog endnu ikke muligt med de nuværende MS-baserede teknologier. Bottom-up proteomcs efterfulgt af PTM-specifik berigelse, dvs. HILIC og IMAC, er stadig guldstandarden for PTM-analyser, men ved at anvende samtidige berigelsesstrategier som dem, der er beskrevet her, kan biomolekylær information bedre belyses. Interaktioner på tværs af tal har vist sig at forekomme mellem forskellige PTM'er30,31, herunder glykosylering og phosphorylering32. Kvantitativ analyse af sådanne interaktioner i sygdom, for eksempel i bugspytkirtelsygdomme som diabetes og kræft, kan vise sig frugtbar for at øge vores forståelse af sygdomsmekanismer. Med optimering af ekstraktionsmetoder blandt forskellige prøvetyper kan berigelsesprotokollerne beskrevet her anvendes til dybdegående profilering af glycoproteomet og phosphoproteomet i komplekse biologiske matricer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev delvist støttet af tilskudsmidler fra NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 og R21AG065728) og Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B og SRA-2016-168-S-B). Data, der præsenteres her, blev også delvist opnået gennem støtte fra en NIH / NCATS UL1TR002373-pris gennem University of Wisconsin Institute for Clinical and Translational Research. Orbitrap-instrumenterne blev købt gennem støtte fra et NIH-delt instrumenttilskud (NIH-NCRR S10RR029531) og vicekanslerens kontor for forskning og kandidatuddannelse ved University of Wisconsin-Madison. Vi vil også gerne anerkende den generøse støtte fra University of Wisconsin Organ and Tissue Donation Organization, der leverede menneskelig bugspytkirtel til forskning og hjælp fra Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett og Prof. Jon Odorico for at levere prøverne til vores laboratorium. Vores forskerhold vil gerne rette en særlig tak til de familier, der donerede væv til denne undersøgelse. L.L. anerkender NIH-tilskud S10OD025084, et pancreas cancer pilot-tilskud fra University of Wisconsin Carbone Cancer Center (233-AAI9632) samt et Vilas Distinguished Achievement Professorship og Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship med finansiering fra Wisconsin Alumni Research Foundation og University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
References
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
- Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
- Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029 (2020).
- Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
- Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
- Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
- Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
- Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
- Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
- Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
- Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
- Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
- Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
- Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
- Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
- Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380 (2021).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
- Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).
- Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
- Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
- Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
- Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010 (2021).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129 (2021).
- Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).
