Summary
Las modificaciones post-traduccionales (PTM) cambian las estructuras y funciones de las proteínas. Los métodos para el enriquecimiento simultáneo de múltiples tipos de PTM pueden maximizar la cobertura en los análisis. Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía de afinidad metálica inmovilizada ti(IV) de doble funcionalidad seguida de espectrometría de masas para el enriquecimiento y análisis simultáneo de la proteína N-glicosilación y fosforilación en tejidos pancreáticos.
Abstract
La espectrometría de masas puede proporcionar una cobertura profunda de las modificaciones post-traduccionales (PTM), aunque el enriquecimiento de estas modificaciones a partir de matrices biológicas complejas es a menudo necesario debido a su baja estequiometría en comparación con los analitos no modificados. La mayoría de los flujos de trabajo de enriquecimiento de PTM en péptidos en flujos de trabajo de proteómica de abajo hacia arriba, donde las proteínas se digieren enzimáticamente antes de que se analicen los péptidos resultantes, solo enriquecen un tipo de modificación. Sin embargo, es todo el complemento de PTM lo que conduce a las funciones biológicas, y el enriquecimiento de un solo tipo de PTM puede pasar por alto dicha diafonía de PTM. Se ha observado diafonía de PTM entre la glicosilación de proteínas y la fosforilación, los dos PTM más comunes en proteínas humanas y también los dos PTM más estudiados utilizando flujos de trabajo de espectrometría de masas. Utilizando la estrategia de enriquecimiento simultáneo descrita en este documento, ambos PTM se enriquecen a partir de tejido pancreático humano post mortem, una matriz biológica compleja. La cromatografía de afinidad metálica inmovilizada ti(IV) de doble funcionalidad se utiliza para separar varias formas de glicosilación y fosforilación simultáneamente en múltiples fracciones en un método conveniente basado en punta de espín, lo que permite análisis aguas abajo de posibles interacciones de diafonía PTM. Este flujo de trabajo de enriquecimiento para glicopéptidos y fosfopéptidos se puede aplicar a varios tipos de muestras para lograr un perfil profundo de múltiples PTM e identificar posibles moléculas objetivo para futuros estudios.
Introduction
Las modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTM) desempeñan un papel importante en la modulación de las estructuras proteicas y, en consecuencia, en sus funciones y procesos biológicos posteriores. La diversidad del proteoma humano aumenta exponencialmente debido a la variabilidad combinatoria que ofrecen varios PTM. Diferentes variantes de proteínas de sus secuencias canónicas predichas por el genoma se conocen como proteoformas, y muchos proteoformas surgen de PTM1. El estudio de la diversidad proteoforma en salud y enfermedad se ha convertido en un área de investigación de gran interés en los últimos años 2,3.
El estudio de proteoformas y más específicamente PTM con gran profundidad se ha vuelto más fácil a través del desarrollo de métodos proteómicos basados en espectrometría de masas (EM). Usando EM, los analitos se ionizan, fragmentan e identifican en función de los m /z de los fragmentos. Los métodos de enriquecimiento a menudo son necesarios debido a la baja abundancia relativa de PTM en comparación con las formas no modificadas de proteínas. Aunque el análisis de proteínas intactas y sus PTM, llamados análisis de arriba hacia abajo, se han vuelto más rutinarios, la digestión enzimática de las proteínas y el análisis de sus péptidos componentes en los análisis de abajo hacia arriba sigue siendo la ruta más utilizada para el análisis de PTM. Los dos PTM más ampliamente estudiados, y los dos PTM más comunes in vivo, son la glicosilación y la fosforilación4. Estos dos PTM desempeñan un papel importante en la señalización y el reconocimiento celular y, por lo tanto, son modificaciones importantes para caracterizar en la investigación de enfermedades.
Las propiedades químicas de varios PTM a menudo proporcionan rutas hacia el enriquecimiento de estos PTM a nivel de proteínas y péptidos antes del análisis. La glicosilación es un PTM hidrófilo debido a la abundancia de grupos hidroxilo en cada monosacárido. Esta propiedad se puede utilizar para enriquecer glicopéptidos en cromatografía de interacción hidrófila (HILIC), que puede separar más glicopéptidos hidrófilos de los péptidos hidrofóbicos no modificados5. La fosforilación agrega la fracción de fosfato, que está cargada negativamente excepto a pH ácido. Debido a esta carga, se pueden usar varios cationes metálicos, incluido el titanio, para atraer y unir fosfopéptidos mientras que las especies no fosforiladas se eliminan. Este es el principio de la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC). Se pueden encontrar más discusiones sobre estas y otras estrategias de enriquecimiento para la glicosilación y la fosforilación en revisiones recientes 6,7.
A menudo se necesitan cantidades comparativamente grandes de material peptídico de partida (0,5 mg o más) para los protocolos de enriquecimiento debido a la baja estequiometría de los PTM en los péptidos. En escenarios en los que esta cantidad de muestra puede no obtenerse fácilmente, como la biopsia del núcleo tumoral o los análisis del líquido cefalorraquídeo, es beneficioso utilizar flujos de trabajo fáciles que den como resultado la máxima información biomolecular. Las estrategias recientes desarrolladas por nuestro laboratorio y otros han destacado el análisis simultáneo y paralelo de la glicosilación y la fosforilación utilizando el mismo flujo de trabajo de enriquecimiento de PTM 8,9,10,11,12. Aunque las propiedades químicas de estos dos PTM pueden diferir, estos PTM pueden analizarse en múltiples pasos debido a las innovadoras técnicas de separación y materiales utilizados. Por ejemplo, la cromatografía de interacción repulsión-hidrofílica electrostática (ERLIC) superpone separaciones basadas en interacciones hidrófilas entre analitos y la fase móvil con interacciones carga-carga entre analitos y el material de fase estacionaria 13,14,15,16. A pH ácido, la atracción de péptidos fosforilados a la fase estacionaria puede mejorar su retención y separación de péptidos no modificados. El material que consiste en Ti(IV) inmovilizado en microesferas hidrofílicas se puede utilizar para la elución basada en HILIC e IMAC para separar fosfopéptidos y glicopéptidos neutros, ácidos y manosa-6-fosforilados17,18. Esta estrategia se conoce como Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad. El uso de estas estrategias para enriquecer varios PTM en un solo flujo de trabajo puede hacer que los análisis de las posibles interacciones de diafonía de PTM sean más accesibles. Además, la cantidad total de muestra y los requisitos de tiempo son menores que los métodos de enriquecimiento convencionales cuando se realizan en paralelo (es decir, HILIC e IMAC en alícuotas de muestra separadas).
Para demostrar la estrategia dual-funcional Ti(IV)-IMAC para el análisis simultáneo de la glicosilación y fosforilación de proteínas, la hemos aplicado para analizar tejidos pancreáticos humanos post-mortem. El páncreas produce tanto enzimas digestivas como hormonas reguladoras, incluyendo insulina y glucagón. La función pancreática se ve afectada en la enfermedad pancreática. En la diabetes, la regulación del azúcar en la sangre se ve afectada, lo que lleva a niveles más altos de glucosa en la sangre. En la pancreatitis, la inflamación resulta de la autodigestión del órgano3. Los cambios en los perfiles de PTM, incluida la glicosilación y la fosforilación, pueden resultar, como suele ser el caso, en otras enfermedades.
Aquí, describimos un protocolo para un método de enriquecimiento simultáneo basado en punta de espín, basado en una estrategia Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad, para N-glicopéptidos y fosfopéptidos derivados de proteínas extraídas del tejido pancreático. El protocolo incluye extracción y digestión de proteínas, enriquecimiento, recopilación de datos de EM y procesamiento de datos, como se puede ver en la Figura 1. Los datos representativos de este estudio están disponibles a través de ProteomeXchange Consortium con el identificador PXD033065.
Figura 1: Flujo de trabajo para el análisis simultáneo de N-glicopéptidos y fosfopéptidos de tejidos pancreáticos humanos. Los tejidos primero se criopulforizan en un polvo fino antes de la extracción de proteínas utilizando el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). Las proteínas se someten a digestión enzimática. Los péptidos resultantes se alicitan antes del enriquecimiento utilizando Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad. Los datos brutos se recopilan utilizando cromatografía líquida de fase inversa a nanoescala-espectrometría de masas (nRPLC-MS) y se analizan utilizando un software de búsqueda de bases de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Este protocolo está destinado a hacer que los análisis ptm sean más accesibles y permitir un análisis más generalizado de múltiples PTM en el mismo flujo de trabajo. Este protocolo se puede aplicar a otras matrices biológicas complejas, incluidas las células y los biofluidos.
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Protocol
Se obtuvo el consentimiento para el uso de tejidos pancreáticos para la investigación de los familiares del fallecido y se obtuvo una autorización de la Junta de Revisión Institucional de Ciencias de la Salud de la Universidad de Wisconsin-Madison. La supervisión del IRB no es necesaria porque no involucra sujetos humanos como se reconoce en 45 CFR 46.102 (f).
PRECAUCIÓN: Se debe tener cuidado al manipular los reactivos utilizados en este protocolo, que incluyen ácidos (fórmico, acético, trifluoroacético), bases (hidróxido de amonio) y criógenos (nitrógeno líquido). Lea las hojas de datos de seguridad de los reactivos utilizados para familiarizarse con los peligros asociados y las precauciones necesarias. Las concentraciones denotadas usando porcentajes son volumen/volumen total (v/v) y se diluyen con agua.
1. Criopulforación tisular, lisis y extracción de proteínas
- Llena un dewar con nitrógeno líquido. Enfríe previamente las partes del pulverizador de tejido que entrarán en contacto con los tejidos pancreáticos, a saber, la cámara, el pulverizador y la cuchara de recuperación en un recipiente de poliestireno.
- Transfiera las piezas de tejido congelado al soporte de muestra preenfriado y agregue una cucharada de nitrógeno líquido al tejido.
- Coloque el pulverizador en la cámara y golpee con un mazo de cinco a diez veces para aplastar la muestra. Retire el pulverizador de la cámara y raspe el polvo y los trozos de tejido adherente.
- Agregue una cucharada de nitrógeno líquido a la cámara si los tejidos comienzan a derretirse. Repita el proceso de pulverización hasta que la muestra sea un polvo fino sin grandes trozos de tejido. Divida las muestras en aproximadamente 100 mg de alícuotas en tubos preenfriados.
- Prepare un tampón de lisis que contenga 4% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 150 mM de NaCl y 25 mM de Tris (pH = 7.4). Disolver un comprimido de proteasa e inhibidor de la fosfatasa en 500 μL de agua para un stock 20x de cada uno. Agregue el volumen requerido de 20x stock de cada inhibidor al tampón de lisis para una concentración final de 1x.
- Añadir 600 μL de tampón de lisis por cada 100 mg de tejido al tubo e incubar a 95 °C en un bloque calefactor durante 10 min con agitación a 800 rpm. Retire las muestras del bloque calefactor y déjelas enfriar a temperatura ambiente.
- Sonicar las muestras a 60 W de energía (20 kHz) durante 45 s utilizando pulsos de 15 s con un descanso de 30 s en el medio. Pellet las muestras a 3.000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Agregue el sobrenadante a un disolvente de precipitación 5x, 300 μL de tampón de lisis a 1,5 ml de disolvente de precipitación, que contiene 50% de acetona, 49,9% de etanol y 0,1% de ácido acético. Enfriar durante la noche a -20 °C.
- Vuelva a gletizar las muestras a 3.000 x g durante 15 min a 4 °C y retire el sobrenadante. Lave el pellet rompiendo con una espátula y mezclándolo con la misma cantidad de disolvente de precipitación. Pellet de nuevo, repitiendo el paso de lavado 2x.
- Pellet la muestra a 16.000 x g durante 15 min a 4 °C. Seque al aire el pellet de muestra en una campana extractora de humos durante 15 minutos y guárdelo a -80 °C hasta que esté listo para continuar.
2. Digestión y desalinización de proteínas
- Resuspenda el pellet de proteína en 300 μL de tampón de digestión recién hecho que contiene 50 mM de bicarbonato de trietilamonio (TEAB) y 8 M de urea.
- Estimar la concentración de proteínas de la solución utilizando un ensayo de proteínas de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- A la proteína en la solución, agregue ditiotreitol (TDT) a una concentración final de 5 mM, mezcle y reduzca a temperatura ambiente durante 1 h. Luego, agregue yodoacetamida (IAA) a una concentración final de 15 mM, mezcle y alquile a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Apague la alquilación repitiendo la adición de TDT en el mismo volumen que antes y mezcle.
- Añadir LysC/tripsina en una proporción enzima:100 enzima/proteína e incubar a 37 °C durante 4 h. Luego, agregue 50 mM TEAB para diluir la urea de 8 M utilizada para < 1 M. Agregue tripsina en una proporción de enzima: proteína 1: 100 e incube a 37 ° C durante la noche.
- Apague la digestión con la adición de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,3% v / v. Por cada 1 mg de proteína de partida, acondicionar un cartucho desalinizante (1 cc, 10 mg) con 1 ml de acetonitrilo (ACN) y 3x con 1 ml de TFA al 0,1%.
- Cargue la mezcla digerida en el cartucho de desalinizante. Lavar la mezcla 3x usando 1 mL de TFA al 0.1%. Si la elución es lenta, aplique presión positiva pero evite un caudal > una gota por segundo.
- Péptidos eluto utilizando 1 ml de 60% de ACN y 0,1% de solución de ácido fórmico (FA). Seque los péptidos eluidos a aproximadamente 35 °C utilizando un concentrador de vacío centrífugo hasta que el disolvente se haya evaporado por completo.
- Resuspend péptidos en 300 μL de agua y estimar las concentraciones de péptidos utilizando un ensayo de péptidos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Divida los péptidos en alícuotas de 500 μg y séquelos por completo.
3. Enriquecimiento ERLIC N-glicopéptido
NOTA: Las velocidades y los tiempos exactos de la centrífuga pueden diferir según las muestras y deben optimizarse. En general, 300 x g durante 2 min es apropiado para el acondicionamiento y lavado del material y 100 x g para 5 min para eluir.
- Pesar aproximadamente 3 mg de algodón y empacarlo en una punta de pipeta vacía de 200 μL (punta de espín; ver Tabla de materiales).
- Transfiera un fuerte material de enriquecimiento de intercambio aniónico a un tubo y agregue 200 μL de TFA al 0,1% por cada material de 10 mg. Para el enriquecimiento de 500 μg de péptidos, use 15 mg del material. Activar el material agitando durante 15 min.
- Usando un adaptador de tubo, coloque la punta de centrifugado sobre un tubo de 2 ml y agregue suficiente suspensión a la punta para 15 mg de material. Retire el líquido girando en una centrífuga de sobremesa.
- Acondicionar el material centrifugando 3x con 200 μL de ACN. Repita el acondicionamiento por triplicado con acetato de amonio de 100 mM (NH4Ac), 1% de TFA y 80% de ACN/0,1% de TFA (tampón de carga).
- Resuspend 500 μg muestras de péptidos en aproximadamente 200 μL de tampón de carga y flujo a través de la punta de espín. Vuelva a cargar el flujo 2x para garantizar un enlace completo.
- Lave el material centrifugando 5x usando 200 μL de 80% ACN/0.1% TFA, y luego 2x usando 200 μL de 80% ACN/0.1% FA.
- Eluir los péptidos centrifugando con 200 μL de cada uno de los siguientes: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% AF (E2); 0,1% AFC (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
- Lave el material centrifugando 2x con 200 μL de 80% ACN/5% NH4OH. Eluir los péptidos restantes con 200 μL de 10% NH4OH (E5).
- Seque todas las eluciones completamente utilizando un concentrador de vacío centrífugo a aproximadamente 35 °C.
- Realice la desalinización de la elución básica (E5) utilizando una punta de desalinización de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Seque la elución de la punta de desalinización utilizando un concentrador de vacío centrífugo a aproximadamente 35 °C hasta completarla.
4. Enriquecimiento fosfopéptido Ti(IV)-IMAC
NOTA: Las velocidades y los tiempos exactos de la centrífuga pueden diferir según las muestras y deben optimizarse. En general, 300 x g durante 2 min es apropiado para el acondicionamiento y lavado del material y 100 x g para 5 min para eluir.
- Pesar aproximadamente 3 mg de algodón y empacarlo en una punta de pipeta vacía de 200 μL (spin-tip).
- Transfiera el material de enriquecimiento de fosfopéptidos Ti-IMAC a un tubo y agregue 200 μL de TFA al 0,1% por cada material de 10 mg. Para el enriquecimiento de péptidos de 500 μg, use 10 mg de material.
- Usando un adaptador de tubo, coloque la punta de centrifugado sobre un tubo de 2 ml y agregue suficiente suspensión a la punta para obtener material de 10 mg. Retire el líquido girando en una centrífuga de sobremesa.
- Acondicione el material con 200 μL de 40% ACN/3% TFA utilizando la misma configuración de centrífuga descrita anteriormente. Muestras de péptidos de resuspend en 200 μL de ACN al 40% /TFA al 3% y flujo a través de la punta de espín. Vuelva a cargar el flujo dos veces para garantizar un enlace más completo.
- Lave el material centrifugando con 200 μL de 50% de ACN, 6% de TFA y 200 mM de solución de NaCl, seguido de un lavado 2x en 200 μL de 30% de ACN y 0.1% de solución de TFA.
- Péptidos eluto con 200 μL de 10% NH4OH. Secar la elución completamente al vacío. Realice la desalinización utilizando una punta de desalinización de acuerdo con el protocolo del fabricante. Seque la elución de la punta de desalinización al vacío hasta completarla.
5. Enriquecimiento simultáneo de Ti(IV) de doble funcionalidad
NOTA: Las velocidades y los tiempos exactos de la centrífuga pueden diferir según las muestras y deben optimizarse. En general, 300 x g durante 2 min es apropiado para el acondicionamiento y lavado del material y 100 x g para 5 min para eluir.
- Pesar aproximadamente 3 mg de algodón y empacarlo en una punta de espín vacía.
- Transfiera aproximadamente 1 g de material Ti(IV)-IMAC a un tubo. Añadir 0,1% de AGT a una concentración conocida de material, por ejemplo, 20 mg/200 μL (el material puede almacenarse en esta suspensión a 4 °C).
- Para el enriquecimiento a partir de péptidos de 500 μg, agregue suficiente suspensión a una punta de espín para transferir 20 mg de material. Lavar la punta de centrifugado centrifugando con 200 μL de TFA al 0,1%.
- Resuspender las muestras en 200 μL de disolvente de carga/lavado (80% ACN y 3% TFA) y fluir a través de la punta de centrifugado. Vuelva a cargar el flujo a través de 2x.
- Lave la punta de centrifugado 6x centrifugando con 200 μL de disolvente de carga/lavado. Lave la punta de centrifugado con 200 μL de solución de ACN al 80%/0,1% de FA.
- Eluye los péptidos con 200 μL de cada uno de los siguientes: 60% ACN/0.1% FA (E1) y 40% ACN/0.1% FA (E2). Analice cada elución por separado.
- Elute los péptidos con 200 μL de cada uno de los siguientes: 20% ACN/0.1% FA y 0.1% FA. Combine las dos eluciones y analice como una muestra (E3).
- Eluir los péptidos con 200 μL de cada uno de los siguientes: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; y 30% ACN/0,1% TFA. Combine estas eluciones y analice como una (E4) después de desalinizar con una punta empaquetada.
- Acondicionar el material a pH básico utilizando 200 μL de 90% ACN/2.5% NH4OH para 3x. Deseche estos lavados.
- Eluye los péptidos con 200 μL de cada uno de los siguientes: 60% ACN/10% NH4OH (E5) y 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analice estas eluciones por separado después de desalinizar con una punta empaquetada.
- Eluir los péptidos con 200 μL de cada uno de los siguientes: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; y 10% NH4OH. Combine estas eluciones y analice como una (E7) después de desalinizar usando una punta empaquetada.
- Secar todas las eluciones completamente al vacío.
6. Cromatografía líquida de fase inversa de nanoflujo-espectrometría de masas (nRPLC-MS)
NOTA: Los métodos de adquisición y análisis de datos de MS son diversos y, por lo tanto, solo se describe aquí una canalización LC-MS sugerida (y sus parámetros asociados) en los siguientes pasos. Las muestras generadas utilizando los pasos de preparación y enriquecimiento de muestras descritos anteriormente se pueden analizar utilizando otras configuraciones instrumentales, incluido el uso de columnas cromatográficas disponibles comercialmente, dada la calidad suficiente de los datos.
- Tire y empaque un capilar de 15 cm de largo (75 μm de diámetro interior) utilizando material C18 como se describe en19. Preparar la fase A móvil (0,1% FA en agua) y la fase B móvil (0,1% FA en ACN).
- Reconstituir muestras de péptidos enriquecidos en 15 μL de fase B móvil al 3%. Carga 2 μL de la muestra (~13% de volumen de muestra) directamente sobre la columna. Analizar cada muestra en duplicado técnico.
- Péptidos elutivos utilizando un gradiente de fase B móvil del 3% al 30% durante 90 min a un caudal de 0,3 μL/min. Lavar la columna usando 75% B durante 8 min seguido de 95% B durante 8 min, terminando el método con equilibrio a 3% B durante 12 min.
- Operar el espectrómetro de masas en el modo de iones positivos utilizando la adquisición dependiente de datos de los 20 picos superiores con los siguientes parámetros: voltaje de pulverización 2 kV; Detección de MS1 en LC/MS de 400-2.000 m/z a 120.000 de resolución, objetivo de control automático de ganancia (AGC) 2E5, tiempo máximo de inyección de 100 ms, lente RF al 30%, aislamiento cuadrupolo con ventana de 1,6 m/z , para estados de carga 2-8 e indeterminados, y exclusión dinámica de 30 s; Detección de MS2 en lc/MS utilizando fragmentación escalonada de HCD al 22%, 30% y 38%, primera masa fija de 120 m/z a una resolución de 30,000, objetivo de AGC 5E4 y requisito de intensidad mínima de 2.5E4.
7. Análisis de datos de EM
NOTA: Aquí se presenta una canalización de análisis de datos que utiliza dos software diferentes para analizar el mismo conjunto de datos. La fosforilación y la glicosilación se pueden buscar al mismo tiempo utilizando un solo software en lugar de dos software separados como se describe aquí, aunque en general, el tiempo de búsqueda del software es proporcional al espacio de búsqueda, es decir, el número de PTM considerados. Por esta razón, se utilizan dos programas diferentes en paralelo a la búsqueda de glicopéptidos y fosfopéptidos.
- Procese archivos de datos sin procesar utilizando el software apropiado (consulte la Tabla de materiales).
- Buscar espectros en la base de datos humana UniProt (o apropiada para cada especie). Establecer la carbamidometilación de Cys como una modificación fija. Establezca el número máximo de escisiones enzimáticas perdidas como dos.
- En los archivos de datos en bruto, utilizando un software comercial (ver Tabla de Materiales), busque glicopéptidos para ser analizados20. Utilice una tolerancia de masa de precursor de 10 ppm y una tolerancia de masa de fragmento de 0,01 Da con una longitud mínima de péptido de cuatro residuos.
- Busque utilizando la base de datos de N-glicanos integrada en software ampliada con los típicos glicanos de manosa-6-fosfato(M6P),incluidos HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1) y HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1).
- Establezca la N-glicosilación como una modificación común. Establezca las modificaciones totales máximas por coincidencia espectral peptídica (PSM) como una común y dos raras.
- Establezca las siguientes modificaciones variables: oxidación de Met (raro), desamidación en Asn y Gln (raro) y fosforilación en Ser, Thr y Tyr (común). Establezca los siguientes filtros de identificación: corte de puntuación > 150, |problema de registro| > 1, y la puntuación delta mod > 10.
- Exporte y analice los resultados de búsqueda en las pestañas Proteínas y Grupo de péptidos.
- Examinar manualmente las identificaciones que contienen glicanos M6P para detectar la presencia del ion fosfohex oxonio (243 m/z) en los espectros MS/MS y eliminar las identificaciones de falsos positivos, que no contienen este ion diagnóstico.
- En los archivos de datos en bruto, utilizando un software de código abierto (ver Tabla de Materiales), busque fosfopéptidos para ser analizados21. Utilice una tolerancia al péptido de primera búsqueda de 20 ppm y una tolerancia al péptido de búsqueda principal de 4,5 ppm.
- Establezca el número máximo de modificaciones por péptido en 5. Establezca la tasa de falso descubrimiento de PSM y proteínas (FDR) en 1% y la longitud mínima del péptido en 7 residuos.
- Establezca modificaciones variables como la oxidación en Met, la acetilación de proteínas N-terminales y la fosforilación en Ser, Thr y Tyr. Analice los resultados de búsqueda mediante los archivos modificationSpecificPeptides.
- Determine el número de identificaciones de PTM a nivel de proteína, péptido y sitio de modificación.
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Representative Results
Los datos representativos de espectrometría de masas, incluidos los archivos sin procesar y los resultados de búsqueda, se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador del conjunto de datos PXD03306522.
En este trabajo, se analizaron réplicas de inyección duplicadas para cada elución de enriquecimiento. Las identificaciones realizadas a partir de ambas réplicas técnicas se recopilaron en el análisis final. Debido a la naturaleza semiestocástica de la adquisición dependiente de datos en la selección de precursores de péptidos para la fragmentación de EM / EM, se espera una superposición de identificación de aproximadamente 70% -80% entre duplicados técnicos. En las aplicaciones que utilizan estos métodos, se recomiendan al menos dos réplicas técnicas. Para los análisis estadísticos posteriores, se deben tener en cuenta las réplicas biológicas para diferentes condiciones experimentales. Dependiendo de la rigurosidad deseada para la notificación de datos, puede ser útil establecer filtros para las identificaciones, por ejemplo, la identificación en al menos x número de réplicas técnicas o biológicas que se notificarán.
Un ejemplo de cromatograma iónico total (TIC) para cada elución de cada enriquecimiento se puede ver en la Figura Suplementaria S1, la Figura Suplementaria S2 y la Figura Suplementaria S3. El uso de filtros estrictos durante la búsqueda en la base de datos de archivos MS sin procesar puede garantizar identificaciones más precisas y seguras de espectros MS / MS a secuencias peptídicas con PTM. Como es evidente en las TIC para cada elución, las muestras peptídicas siguen siendo complejas incluso después del fraccionamiento del enriquecimiento. La cromatografía de nanoflujo acoplada a un espectrómetro de masas de alta resolución, alta precisión de masa y escaneo rápido puede ayudar a analizar mezclas complejas, como péptidos de un digesto tríptico, con gran sensibilidad y profundidad. Ejemplo de espectros MS/MS para espectros glicosilados y fosforilados se puede ver en la Figura 2. Los espectros bien anotados como estos son el resultado de una rica fragmentación de precursores que aumentan la confianza en la identificación asignada por el software de búsqueda de bases de datos.
La Figura 3 ilustra las identificaciones peptídicas realizadas utilizando el método de enriquecimiento de punta de espín Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad sobre cada fracción de elución. La mayoría de los glicopéptidos eluyen en las primeras cuatro fracciones, mientras que la mayoría de los fosfopéptidos eluyen en las últimas tres fracciones. Esta separación de diferentes PTM entre las fracciones ayuda a prevenir cualquier interferencia en la ionización que pueda resultar si no estuvieran tan adecuadamente separados a través de eluciones.
La Figura 4 compara los resultados de la glicoproteómica del método Ti dual en comparación con un enriquecimiento solo con glicopéptidos ERLIC. Como se puede ver en la Figura 4A, muchas identificaciones a nivel de proteína, glicoformo, PTM y sitio de modificación son comunes a ambos métodos. Sin embargo, ERLIC tiene identificaciones más únicas en todos los niveles en comparación con el método Ti dual. Esto incluye glicoformas M6P (glicanos altos en manosa con al menos un grupo fosfato), que requieren una curación manual adicional de los datos para eliminar las identificaciones de falsos positivos. Además, los tipos de glicanos identificados utilizando cualquiera de los métodos son similares. Las proporciones de cada tipo de glicano después de agruparse en seis categorías en función de sus composiciones son similares entre ambos métodos16.
Los resultados de la fosfoproteómica del método Dual Ti se comparan con un enriquecimiento convencional de fosfopéptidos IMAC solo en la Figura 5. El enriquecimiento de Ti(IV) de doble funcionalidad funciona de manera similar al IMAC convencional, como lo demuestra la superposición sustancial a nivel de proteína, péptido y PTM. Usando cualquiera de los métodos, la mayoría de los aminoácidos fosforilados son serina y treonina, con alrededor del 1% de tirosina fosforilada identificada también. Ambos métodos también se pueden utilizar para identificar péptidos multifosforilados.
Las listas de proteínas modificadas se asignan a los genes y se analizan utilizando el enriquecimiento de la ontología génica (GO) como se muestra en la Figura 6 y la Figura 7. Los análisis de GO para las proteínas modificadas identificadas utilizando ERLIC e IMAC se muestran en la Figura Suplementaria S4 y la Figura Suplementaria S5. La herramienta gratuita en línea Metascape realiza el enriquecimiento y crea redes basadas en vías y procesos enriquecidos, vinculándolos por similitud23. Los términos de nodo para cada análisis go se pueden encontrar en la Tabla suplementaria S1, la Tabla suplementaria S2, la Tabla suplementaria S3 y la Tabla suplementaria S4. Dado que la glicosilación es una proteína importante PTM en la matriz extracelular, no es sorprendente que varios términos enriquecidos utilizando la lista de N-glicoproteínas identificadas estén relacionados con la matriz extracelular. La fosforilación está involucrada en la señalización celular y esto se puede ver en varios términos enriquecidos encontrados utilizando la lista de fosfoproteínas identificadas.
Figura 2: Espectros de MS/MS anotados de alta confianza de péptidos N-glicosilados y fosforilados. (A) Péptido manosa-6-fosforilado GSLSYLN(HexNAc(2)Hex(7)Fosfo(1))VTR de catepsina D (CATD) identificado a partir de tiempos de retención 53.08-53.33 min a partir de la séptima elución de enriquecimiento. La presencia del ion fosfohexo oxonio a 243 m/z mejora la confianza en esta asignación de PTM. (B) Péptido fosforilado VEEEQEADEEDVS(Phospho)EEEAESK de la proteína transmembrana relacionada con tiorredoxina 1 (TMX1) de tiempos de retención 32.31-32.72 min desde la sexta elución de enriquecimiento. La presencia de pérdidas neutras -98 (-H3PO4) entre los iones de fragmentos peptídicos y sus variantes desfosforiladas (denotadas por fragmento*) mejora la confianza en esta asignación de PTM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de identificaciones peptídicas a partir del enriquecimiento ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad en siete eluciones. El número de identificaciones incluye péptidos identificados en al menos una de las dos réplicas técnicas (inyección). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación de los resultados de la glicoproteómica del enriquecimiento ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad en comparación con un enriquecimiento convencional de glicopéptidos ERLIC. (A) Diagramas de Venn de glicoproteína, glicoformo (proteína, sitio, glicano), composición de glicanos e identificaciones de glicositios entre los métodos de enriquecimiento. (B) Gráficos circulares de glicanos identificados en espinas dorsales de péptidos entre métodos de enriquecimiento. Los glicanos se agrupan en seis grupos según su composición16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Comparación de la fosfoproteómica resulta del enriquecimiento de Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad en comparación con un enriquecimiento convencional de fosfopéptidos Ti(IV)-IMAC. (A) Diagramas de Venn de identificaciones de fosfoproteínas, fosfopéptidos y fosfositos entre métodos de enriquecimiento. (B) Gráficos circulares de fosfositios localizados con confianza (75% o más de probabilidad) desglosados por residuos de aminoácidos. (C) Diagrama de barras apiladas de fosfopéptidos identificados unidos por una serie de residuos fosforilados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Enriquecimiento ontológico génico de N-glicoproteínas identificadas mediante enriquecimiento Ti(IV)-IMAC multifuncional dual. Las N-glicoproteínas se asignan a los genes y se identifican vías y términos de proceso significativamente enriquecidos utilizando la totalidad del genoma como fondo. Se utilizan varios colores para etiquetar grupos de términos que están conectados por similitud de términos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Enriquecimiento ontológico génico de fosfoproteínas identificadas mediante enriquecimiento Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad. Las fosfoproteínas se asignan a los genes y se identifican vías y términos de proceso significativamente enriquecidos utilizando la totalidad del genoma como fondo. Se utilizan varios colores para etiquetar grupos de términos, que están conectados por similitud de términos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Ejemplo de cromatogramas iónicos totales (TIC) de cada elución del enriquecimiento ti(IV)-IMAC (E1 a E7, paneles A-G) de doble funcionalidad. La señal total (corriente iónica) se traza durante el período de recopilación de datos de 117 minutos. La intensidad del pico base viene dada por el valor NL. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Ejemplo de cromatogramas de iones totales (TIC) de cada elución del enriquecimiento ERLIC (E1 a E5, paneles A-E). La señal total (corriente iónica) se traza durante el período de recopilación de datos de 117 minutos. La intensidad del pico base viene dada por el valor NL. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Ejemplo de cromatograma iónico total (TIC) a partir de la elución del enriquecimiento de Ti-IMAC. La señal total (corriente iónica) se traza durante el período de recopilación de datos de 117 minutos. La intensidad del pico base viene dada por el valor NL. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S4: Enriquecimiento ontológico génico de N-glicoproteínas identificadas mediante enriquecimiento convencional de glicopéptidos con ERLIC. Las N-glicoproteínas se asignan a los genes y se identifican vías y términos de proceso significativamente enriquecidos utilizando la totalidad del genoma como fondo. Se utilizan varios colores para etiquetar grupos de términos, que están conectados por similitud de términos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S5: Enriquecimiento ontológico génico de fosfoproteínas identificadas mediante enriquecimiento convencional de fosfopéptidos con Ti(IV)-IMAC. Las fosfoproteínas se asignan a los genes y se identifican vías y términos de proceso significativamente enriquecidos utilizando la totalidad del genoma como fondo. Se utilizan varios colores para etiquetar grupos de términos, que están conectados por similitud de términos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tablas suplementarias S1-S4: Información del nodo Metascape para análisis de enriquecimiento de ontología génica. Las tablas contienen información de nodos para listas de N-glicoproteínas y fosfoproteínas identificadas usando Ti dual (Tabla S1 y Tabla S2), N-glicoproteínas usando ERLIC (Tabla S3) y fosfoproteínas usando IMAC (Tabla S4). Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
La estrategia Ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad es útil para el análisis simultáneo de N-glicopéptidos y fosfopéptidos de la misma muestra en un solo flujo de trabajo de preparación de muestras. También se ha demostrado que los métodos basados en ERLIC realizan un enriquecimiento simultáneo de PTM. Ambas estrategias se han utilizado previamente para la cobertura profunda en los análisis de PTM14,18. Al adaptar el método Ti dual para disminuir el tiempo de incubación de la muestra mediante el uso de puntas de espín, esperamos que este protocolo se haya vuelto menos intensivo en recursos y, por lo tanto, más accesible.
El análisis simultáneo de múltiples PTM se logra a través de interacciones sinérgicas entre los analitos y los grupos funcionales en la superficie del material de enriquecimiento. En el primer empaquetado de puntas de espín con algodón, la retención de glicopéptidos en modo HILIC aumenta debido a la prevalencia de grupos hidroxilo en la celulosa24. Mediante el uso de agua y acetonitrilo (un disolvente miscible en agua), los glicopéptidos se retienen y separan debido a la formación de agua y capas orgánicas. El material para el enriquecimiento de Ti(IV) de doble funcionalidad depende de los cationes Ti(IV) inmovilizados para la unión de fosfopéptidos. Las propiedades hidrofílicas de las cadenas laterales del material se utilizan para retener glicopéptidos en modo HILIC, que se eluyen primero utilizando elución ácida con contenido acuoso creciente. El material se lava aún más con tampones convencionales de enriquecimiento de fosfopéptidos IMAC para eluir glicopéptidos sialilados, que tienen una mayor afinidad a la fase estacionaria que otros glicopéptidos neutros. Después de acondicionar el material al pH básico, se utiliza hidróxido de amonio y solución de ACN para romper las interacciones electrostáticas que mantienen los fosfopéptidos unidos al material. Mientras tanto, la disminución del contenido orgánico permite la separación de péptidos mono y multifosforilados y glicopéptidos M6P.
Al separar ptM utilizando múltiples pasos de elución en el mismo flujo de trabajo, la información biomolecular se puede maximizar a partir de muestras limitadas. Una advertencia con estos flujos de trabajo de análisis dual de PTM es el requisito de una cantidad relativamente grande de muestra (0,5 mg de péptidos) como material de partida para cada enriquecimiento cuando se recolectan al menos cinco fracciones. No obstante, la estrategia de enriquecimiento simultáneo presentada aquí todavía ofrece un ahorro significativo de materiales en comparación con las estrategias convencionales. Incluso antes del enriquecimiento, se necesitan varios pasos importantes para garantizar la integridad de PTM y evitar la pérdida artificiosa de información de PTM. Estos incluyen el almacenamiento adecuado de muestras a bajas temperaturas cuando no están en uso (idealmente -80 ° C), el uso de inhibidores de proteasa y fosfatasa durante la extracción de proteínas, y el uso de un método de limpieza de péptidos hidrófilos, como los cartuchos HLB utilizados aquí.
Se ha observado que ERLIC (enriquecimiento convencional de glicopéptidos) resultó en una mejor cobertura de glicoproteomas, mientras que ti(IV)-IMAC de doble funcionalidad fue superado en identificaciones únicas por Ti-IMAC convencional en resultados de fosfoproteómica. La estructura física y el aumento de la hidrofilicidad del material ERLIC en comparación con la del material de enriquecimiento dual de Ti es probablemente un factor importante en la mejora de la cobertura del glicoproteoma en ERLIC. El aumento de la cobertura del fosfoproteoma en el IMAC convencional puede ser el resultado de una disminución de la supresión de iones por la eliminación de glicopéptidos durante los primeros pasos de elución y lavado. A pesar de estas ligeras disminuciones en la cobertura utilizando el flujo de trabajo ti dual simultáneo, todavía se logra una superposición significativa con el enriquecimiento PTM único convencional con el beneficio adicional de realizar solo un flujo de trabajo de enriquecimiento en lugar de dos.
En cuanto a las limitaciones de tiempo, ERLIC y Ti-IMAC convencional tienen menos fracciones que el flujo de trabajo ti dual. En cuanto a los recursos necesarios, el material de intercambio de aniones necesario para ERLIC es más barato que el material funcionalizado necesario para los flujos de trabajo duales de Ti e IMAC convencionales. En estos protocolos, solo se analizó la glicosilación ligada a N y no a la O. La enzima PNGasa F puede (y debe) ser utilizada para escindir N-glicanos para limitar el número de falsos positivos obtenidos si se buscan O-glicopéptidos. Se ha demostrado, sin embargo, que esta estrategia reduce la especificidad de HILIC y ERLIC para el enriquecimiento de glicopéptidos25. En el protocolo, se utiliza una estrategia que utiliza dos software separados para analizar archivos de datos sin procesar. Byonic, un software comercial, se considera el estándar de oro en el análisis de datos de glicoproteómica. Debido a la diversidad de estructuras de N-glicano, el espacio de búsqueda de péptidos aumenta, lo que aumenta los tiempos de búsqueda. La fosforilación también se puede agregar como un PTM común además de la glicosilación durante la búsqueda, aunque los tiempos de búsqueda pueden dispararse dependiendo de si se considera la multifosforilación peptídica. MaxQuant, un software de código abierto, se puede optimizar para minimizar FDR en los resultados de fosfoproteómica, aunque la glicosilación compleja no es tan fácil de buscar. También hay otras opciones de código abierto para buscar datos glicoproteómicos 26,27,28. Dependiendo de los objetivos experimentales y los recursos disponibles, el LC-MS y la canalización de análisis de datos descritos aquí se pueden utilizar tal como se presentan o modificarse. Se espera que una mayor optimización de los métodos mejore la cobertura de los PTM.
Los PTM juegan un papel importante en los procesos bioquímicos debido a los cambios en la estructura de las proteínas que imparten. Es ideal que todos los análisis proteómicos tengan en cuenta todos los PTM de proteínas simultáneamente. La importancia de la suma de toda la glicosilación proteica, por ejemplo, se ha denominado meta-heterogeneidad29. Sin embargo, el objetivo del análisis total de PTM aún no es posible con las tecnologías actuales basadas en EM. La proteómica de abajo hacia arriba seguida por el enriquecimiento específico de PTM, es decir, HILIC e IMAC, sigue siendo el estándar de oro para los análisis de PTM, aunque mediante el uso de estrategias de enriquecimiento simultáneas como las descritas aquí, la información biomolecular se puede dilucidar mejor. Se ha encontrado que las interacciones de diafonía ocurren entre varios PTM30,31, incluyendo glicosilación y fosforilación32. El análisis cuantitativo de tales interacciones en la enfermedad, por ejemplo, en enfermedades pancreáticas como la diabetes y el cáncer, puede resultar fructífero para aumentar nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Con la optimización de los métodos de extracción entre diferentes tipos de muestras, los protocolos de enriquecimiento descritos aquí se pueden utilizar para el perfil en profundidad del glicoproteoma y el fosfoproteoma en matrices biológicas complejas.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada en parte por fondos de subvención de los NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 y R21AG065728) y juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B y SRA-2016-168-S-B). Los datos presentados aquí también se obtuvieron en parte a través del apoyo de un premio NIH / NCATS UL1TR002373 a través del Instituto de Investigación Clínica y Traslacional de la Universidad de Wisconsin. Los instrumentos Orbitrap se compraron a través del apoyo de una subvención de instrumentos compartidos de los NIH (NIH-NCRR S10RR029531) y la Oficina del Vicerrector de Investigación y Educación de Posgrado de la Universidad de Wisconsin-Madison. También nos gustaría agradecer el generoso apoyo de la Organización de Donación de Órganos y Tejidos de la Universidad de Wisconsin que proporcionó páncreas humano para la investigación y la ayuda de Dan Tremmel, la Dra. Sara D. Sackett y el Prof. Jon Odorico por proporcionar las muestras a nuestro laboratorio. Nuestro equipo de investigación desea dar un agradecimiento especial a las familias que donaron tejidos para este estudio. L.L. reconoce la subvención de los NIH S10OD025084, una subvención piloto de cáncer de páncreas del Centro oncológico Carbone de la Universidad de Wisconsin (233-AAI9632), así como una Cátedra Vilas distinguished Achievement y la Cátedra Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair con fondos proporcionados por la Wisconsin Alumni Research Foundation y la Facultad de Farmacia de la Universidad de Wisconsin-Madison.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
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