Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Lysindusert in situ transmisjonselektronmikroskopi for observasjon av interaksjonen mellom væske og myk materie

Published: July 26, 2022 doi: 10.3791/63742
Automatic Translation
1, 2
1Electron Microscopy Laboratory, Faculty of Mechanical Engineering, Wroclaw University of Science and Technology, 2Advanced Materials Engineering and Modelling Group, Faculty of Chemistry, Wroclaw University of Science and Technology

Summary

Denne protokollen beskriver transmisjonselektronmikroskop (TEM) modifikasjoner med et lysbelysningssystem, fabrikasjon av flytende celler og in situ TEM-observasjoner av lysinduserte interaksjoner mellom bakterieceller og en fotosensibilisator. Prøveprepareringsmetodene, elektronstråleskader og avbildning diskuteres også.

Abstract

Den nåværende protokollen beskriver modifikasjonene av transmisjonselektronmikroskopet (TEM) oppsett for in situ lysinduserte observasjoner. Et glass optisk fiber satt inn i elektronkolonnen over objektivlinsens polstykke, og en laser, en justerbar lyskilde, ble brukt til å fremstille enheten. Etter at belysningen er kalibrert ved hjelp av et eksternt målesystem, tillater det en å justere intensiteten av belysningen til behovene til den observerte prosessen. Dette belysningssystemet ble brukt til å avbilde antimikrobielle fotodynamiske terapifenomener, som for tiden er gjenstand for intens forskning. Prøven ble fremstilt ved å oppdage en suspensjon av bakterier på et karbon-, grafen- eller silisiumnitridsubstrat, blotting av overflødig løsning, spotting av fotosensibiliseringsløsningen, blotting av overflødig væske igjen og deretter montering av væskecellen med et andre substrat eller grafenfilm. Prosessen med selve bildeeksperimentet inkluderer å velge riktig sted for observasjon ved bruk av lav forstørrelse og en minimumsdose elektroner, og deretter syklisk aktivering av lyskilden for å ta påfølgende bilder med angitte intervaller med den minste mengden elektroner som er nødvendig. Elektrondosen av hver eksponering og tiden og intensiteten av belysningen som brukes, må registreres nøye på grunn av kompleksiteten til de observerte fenomenene, samtidig som prosessen er både lys- og elektrondrevet. Etter at selve eksperimentet er utført, må det gjøres ytterligere kontrollobservasjoner, der de samme dosene elektroner brukes, men uten ekstra lyspåvirkning og mindre doser elektroner brukes til høyere doser lys. Dette gjør det mulig å skille lysinduserte mikrostrukturelle effekter fra de som er forårsaket av elektroner innen både livs- og materialvitenskap.

Introduction

Lysinduserte fenomener i høy oppløsning er interessante på mange felt som nanoengineering 1,2,3, katalyse 4,5 og biofotonikk6. Noen originale design som tillater slike eksperimenter, finnes i litteraturen, inkludert modifikasjoner av prøveholderne 1,4,7,8,9 og den optiske fiberen festet til mikroskopet 10,11.

Kombinasjonen av lysbelysning, et flytende miljø og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) gir en flott mulighet for detaljerte, dynamiske studier av fotoinduserte prosesser. Imidlertid er høyvakuumtilstanden inne i mikroskopet ganske ugunstig for mange væsker, spesielt vannløsninger. Flytende innkapsling, som beskytter den mot miljøet, kan oppnås ved hjelp av noen få teknikker basert hovedsakelig på grafen12, silisiumnitrid13 eller karbon14 substrater. I tillegg til forskning innen materialvitenskap2, gir såkalte flytende celler muligheter for å gjennomføre ukonvensjonelle mikroskopiske observasjoner på biologiske prøver nær deres opprinnelige forhold15. Slike observasjoner er ekstremt krevende, spesielt for levende mikroorganismer som bakterieceller. Elektronstrålen som ioniserende stråling forårsaker irreversibel skade på de hydrerte prøvene, så elektrondosen må spesifiseres16. Dette er nødvendig for å minimere ugunstige effekter, kontrollere skaden og unngå forvirrende gjenstander. Den optimale maksimale elektrondosen som tillater observasjoner av levende celler er fortsatt et tvilsomt tema16, men dosen på 30 e−/nm2 ser ut til å være grenseverdien, i hvert fall for bakterier17.

Noen av fagene av interesse for slike mikroskopiske studier er prosesser under antimikrobiell fotodynamisk terapi (APDT)18. Kort sagt, terapien fortsetter som følger. Bakteriecellene er omgitt av den lysfølsomme væsken kalt fotosensibilisator. Når lysbelysning gis ved en bestemt bølgelengde, genereres de cytotoksiske reaktive oksygenartene (ROS) fra energi eller ladningsoverføring fra de eksiterte fotosensibilisatormolekylene til oksygenet som er naturlig tilstede i løsningen. Patogener utsatt for ROS blir raskt inaktivert med svært høy effektivitet, uten bivirkninger19. Responsen på terapien varierer for forskjellige mikrober - for eksempel kan virkningen av samme fotosensibilisator være ganske forskjellig for Gram-positive og Gram-negative bakterier20. Generelt har det blitt fastslått at hovedmålet for ROS er de ytre strukturer av celler, hvor skade resulterer i funksjonsforstyrrelser i cellemembranen og dermed fører til bakteriedød21,22. Imidlertid kan skade på nukleinsyrer og proteiner også betraktes som en årsak til inaktivering18, så det er fortsatt ukjent hvilke cellestrukturer som er hovedmålene under denne prosessen19. En dypere forståelse av de skadelige prosessene kan bidra til å forbedre denne definitive terapien. Sammenlignet med lysmikroskopimetodene som brukes i APDT-forskning23, gir TEM-teknikker flere muligheter til å se på APDT-mekanismen med høyere oppløsning og forstørrelse24. TEM har allerede blitt brukt til celleobservasjon under pågående behandling, noe som tillot oss å studere Gram-positive bakterieskader og beskrive endringene som forekommer i celleveggen i detalj 6,25.

Den nåværende protokollen presenterer et egnet eksperimentelt oppsett for høyoppløselig avbildning av lysindusert bakterieinaktivering ved bruk av TEM, som krever et riktig lysbelysningssystem, innkapsling av celler med væske og streng elektrondosekontroll. Bakteriene som ble brukt til observasjonen var Staphylococcus aureus, og en metylenblå løsning ble brukt som fotosensibilisator. Det spesielle lysbelysningsoppsettet består av en justerbar halvlederlaser koblet direkte til mikroskopkolonnen ved hjelp av lysfiberen. Denne utformingen gir jevn bestråling gjennom hele prøven på grunn av den nesten parallelle plasseringen av den optiske fiberen til mikroskopaksen. Monokromatisk lys med høy intensitet generert av laseren kan deretter brukes til å studere ulike fotokjemiske effekter. Lyset som ble brukt i forsøket hadde en bølgelengde lik 660 nm fordi metylenblått i det synlige området har absorpsjonstopper ved 613 nm og 664 nm26. Protokollen for flytende innkapsling er basert på karbonsubstrater, noe som gjør prosedyren rask og ukomplisert. Til slutt presenteres en metode for lavdose in situ TEM-observasjon av celler i væske. Vanskelighetene med prøvepreparering, elektrondoseeffekter på det følsomme prøven og rimelig bildetolkning diskuteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transmisjonselektronmikroskopmodifisering

  1. Endre transmisjonselektronmikroskopet ved å koble den optiske fiberen (se materialtabellen) til mikroskopkolonnen øverst på objektivlinsen. Tillat noen få centimeter mellomrom mellom objektivlinsen og kondensatorlinsen, pluss et gratis spor for tilbehør.
    MERK: En dedikert prøveholder4 eller en holder for katodoluminescerende observasjoner i omvendt konfigurasjon1 kan også brukes.
  2. Kontroller systemet for lekkasjer ved hjelp av grove vakuumpumper. Hvis systemet ikke viser en vakuumlekkasje, test systemet under et høyt vakuum.
    1. Kontroller at aktiveringen av vakuumsystemet ikke avviker fra standard ventilert mikroskopstart. I tilfelle problemer med utførelse, montering eller igangkjøring av modulen, kontakt autorisert servicepersonell eller enhetsprodusenten.
      MERK: Den riktig produserte og monterte belysningen vil ikke skjule elektronstrålen. Hvis strålen skifter suksessivt under mikroskopets drift, vil den ikke-ledende optiske fiberen ikke være tilstrekkelig dekket med et metallskjold og vil akkumulere en elektrisk ladning. I dette tilfellet skyver du den optiske fiberen dypt inn i den ledende jakken.
  3. Mål lysintensiteten ved hjelp av fotodiodekraftsensoren (se materialtabellen). Hvis mellomrommet mellom poldelene av objektivlinsen ikke tillater måling inne i mikroskopet, måler geometrien til prøven og belysningen og reproduserer disse forholdene i et eksternt måleoppsett.
  4. Hvis mikroskopet ikke er utstyrt med et elektrondosemålingssystem, utfør kalibreringen ved å måle strålestrømmen med en Faraday-kopp (se Materialtabell) og numerisk beregne tettheten av elektroner som treffer prøven27.

2. Innkapsling av bakterier med fotosensibilisatoren

  1. Plasser to ubehandlede TEM-rister dekket med amorft karbon mellom to kryssede pinsett som vender mot den karbonbelagte siden til toppen. Hold rutenettene så nær kanten som mulig.
    MERK: For visse substrat-, løsnings- og prøvekombinasjoner kan det være fordelaktig å bruke glødutladning på en eller begge masker for å fjerne urenheter fra fabrikken og oppnå en maksimal hydrofil overflate28. Ved å bruke eksemplet på S. aureus-bakterier og metylenblå løsning ble det bestemt at de beste og mest reproduserbare resultatene ble oppnådd på nytt, ikke-behandlet karbon på kobbergitter uten ytterligere glødutladning eller plasmarengjøring6.
  2. Sett 4 μL bakterieoppløsning på et av rutenettene. Den optiske tettheten til prøven må ligge i området 5-10.
    MERK: Bakteriene som ble brukt i studien ble renset fra kulturen og dispergert i PBS-buffer. Det anbefales på det sterkeste å kontrollere konsentrasjonen av bakterier i den ferske prøven hver gang du bruker den, for eksempel ved hjelp av negative fargemetoder, etter de etablerte protokollene som er tilgjengelige 29,30,31.
  3. Vent i 60 s og fjern væsken forsiktig ved hjelp av filterpapir. Prøv å spre væsken gjennom hele rutenettoverflaten under denne prosessen.
  4. Sett 4 μL fotosensibilisator på samme rutenett.
    MERK: Metylenblått i en konsentrasjon på 2 μg/ml ble brukt som fotosensibilisator for denne studien.
  5. Etter 5 s, fjern væsken. La et veldig tynt lag væske ligge på underlaget.
  6. Plasser raskt det tørre rutenettet på toppen av det som er dekket med væske.
  7. Flytt forsiktig det øvre rutenettet til kanten av den andre og klem underlagene i kantene ved hjelp av pinsett.
    MERK: Noe væske kan strømme ut av prøven på dette stadiet, noe som betyr at ikke nok ble drenert av. Dette betyr imidlertid ikke nødvendigvis at dannelsen av væskecellen vil mislykkes.
  8. Gjenta klemmen forsiktig.
    MERK: Det er lettere å utføre dette trinnet ved å rotere pinsetten 90° slik at de ligger vinkelrett på bordet og begge pinsettspissene forblir i samme høyde, ikke avhengig av åpen/lukket-posisjon.
  9. La væskecellen ligge mellom pinsetten i 1 min.
  10. Sett prøven inn i TEM-holderen rett etter at tilberedningen er fullført.
    MERK: Spenningen på holderens monteringsplate / ring vil hjelpe underlagene til å feste seg og holde væsken inne.
    1. Hvis mulig, pump prøveholderen inn i en ekstern pumpestasjon for å redusere forurensningen av mikroskopet ved å fordampe væske.

3. In situ TEM-observasjoner av bakterieceller i væske-elektrondose-effekt

  1. Sett prøven inn i mikroskopet.
  2. Start observasjonene i lav forstørrelsesmodus for å finne et passende observasjonsområde.
    MERK: Mørkere områder er mest sannsynlig flytende på grunn av elektronstrålespredning.
    1. Under observasjonene, hold elektrondosen så lav som mulig. Utvid eksponeringstiden (opptil 2 s for en akselerasjonsspenning på 150 kV og en forstørrelse på 5000x). Forstørrelsen på 5,000x for bunnmonteringskameraet (omtrentlig synsfelt er 10 μm) er tilstrekkelig til å avbilde bakterier med en diameter på ~ 1 μm.
      MERK: Noen ganger er det ikke lett å skille væsken, så i begynnelsen av observasjonene er det nyttig å fokusere elektronstrålen der det sannsynligvis vil være flytende. Væsken skal bevege seg på en fokusert elektronstråle, og boblene vises. Etter denne verifiseringen er det nødvendig å finne et annet område for videre observasjoner.
  3. Finn cellene omgitt av væske ved riktig forstørrelse med utvidet eksponeringstid og ta det første bildet umiddelbart. Hold elektrondosen konstant og samle bilder hver 30. s for å observere endringene.
  4. Undersøk bildene nøye og beregn den totale elektrondosen27 som tilsvarer de første synlige endringene i cellene.

4. In situ TEM-observasjoner av lysinduserte prosesser mellom bakterieceller og fotosensibilisator

  1. Før du starter eksperimentet, still inn laserlysintensiteten ved å justere gjeldende verdi. Velg riktig bølgelengde i henhold til absorpsjonsspekteret til fotosensibilisatoren. I henhold til forrige kalibreringsplott (trinn 1,4) velger du gjeldende verdi som tilsvarer den laveste lysintensiteten.
    MERK: Lysbølgelengden som ble brukt i denne studien var 660 nm.
  2. Sett prøven inn i mikroskopet og finn observasjonsområdet etter trinn 3.2. i forrige avsnitt.
  3. Ta det første bildet av cellen før du starter belysningen av prøven, og bruk stråleblankeren til å slå av elektronstrålen for å unngå effekten av elektronbestråling.
  4. Slå på laseren. Start med kort belysningstid (her 30 s) da laserlyset har relativt høy intensitet. Etter den tiden, slå av lyskilden.
  5. Slå av strålen blankere og ta bildet umiddelbart. Hvis mulig, bruk en automatisk algoritme for å eksponere prøven bare i den tiden som trengs for å ta bildet. Mål nøye elektronbestrålingstiden for å beregne elektrondosen27 som brukes til avbildning.
  6. Gjenta trinn 4.4. og trinn 4.5. for å oppnå forventet lysbelysningstid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det eksperimentelle oppsettet ble designet for å observere de lysinduserte prosessene som forekommer i en væske med høy oppløsning. Konkurranseanalysen av bildene tillot oss å skille skaden forårsaket av elektronstrålen fra endringer relatert til den fotokjemiske reaksjonen. Effekten av elektronstrålen på den følsomme prøven (i dette tilfellet cellene innkapslet med væske) var synlig over hele det bestrålte området da elektronene trengte jevnt gjennom det. Selvfølgelig avhenger effekten av elektrondosen, så mer signifikante endringer i prøvemorfologien kan observeres raskere for en mer fokusert stråle. Sammenlignet med denne alvorlige skaden oppstod de faktiske ødeleggende effektene av fotodynamisk inaktivering i bestemte deler av celler bare i områder omgitt av den opplyste fotosensibilisatoren.

I eksemplet med bakterieavbildning, og ifølge litteraturen, synes dosen på 30 e−/nm2 å være den dødelige grenseverdien for bakterier17, som ble overskredet i forfatternes tidligere studier 6,25. De synlige endringene i cellen ble imidlertid ikke lagt merke til før de nådde elektrondosen på 6000 e−/nm2. Resultatene viste en merkbar nedbrytning av det ytre laget av cellen forårsaket av den reaktive oksygenarten generert ved lysbestråling av fotosensibilisatoren etter 1 min (figur 1). Ytterligere lysbelysning gjorde endringene mer synlige (figur 1D, G).

Innkapslingen av cellene mellom karbonsubstratene var tilstrekkelig til å utføre konstante observasjoner i minst 1 time. Riktige observasjonspunkter med nok væske kan lett bli funnet ved lav forstørrelse, da disse områdene virker mørkere og uskarpe (indikert av rammene i figur 2A). De væskebelagte bakteriene er mindre synlige enn de tørre, men kan fortsatt skilles fra hverandre (figur 2B). Det er nyttig å se på væskegrensen under avbildningen, og bevegelsen kan lett oppdages, noe som innebærer at det valgte området kan være uegnet og ustabilt (figur 3). Et annet problem under observasjoner er fordampning av vannet og utfelling av løsningen, som kan forekomme i tilfeldige områder av prøven, inkludert områdene rundt bakteriene (figur 3B, C).

Figure 1
Figur 1: Eksempler på fotodynamisk behandling av bakterier. (A) Ordningen med flytende celle som inneholder bakterieceller og metylenblå. (B) Cellen før lysbelysning. (C) Cellen etter belysning i 1 min. (D) Cellen etter belysning i 10 min. (E-G) De forstørrede områdene fra (B-D). Elektrondosen var lik henholdsvis 1600 e−/nm 2, 2500 e−/nm 2 og 6000 e−/nm 2. Figuren er gjengitt fra Żak et al.25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: TEM-bilder av S. aureus innkapslet med metylenblått mellom to karbonfilmer . (A) Bilde med lav forstørrelse presenterer begge områdene med en høy mengde væske (indikert med de gule rammene) og tørre flekker. En rask undersøkelse av prøven ved denne forstørrelsen gir informasjon om innkapslingen var vellykket eller ikke. (B) Væskegrensen er tydelig synlig i det forstørrede området, og bakteriene dekket med fotosensibilisatoren kan skilles. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: TEM-bilder av ugunstige effekter som kan oppstå under avbildning . (A) I begynnelsen var cellen jevnt omgitt av væsken, som dekket det meste av observasjonsområdet. (B) Basert på den konstante elektronstrålebestrålingen, kan bevegelsen og fordampningen av væsken og starten av nedbøren fra løsningen bli lagt merke til. (C) Fortsettelsen av prosessene fører til irreversibel bevegelse, skumming og oppløsning av fotosensibilisatoren, noe som gjør ytterligere observasjoner umulige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: De ugunstige effektene som fører til feil konklusjoner . (A) Den krystalliserte væsken. (B) Forurensningen la seg på cellen. (C) Skumdannelse forårsaket av elektronstrålen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Installasjon og igangkjøring av belysningen krever grunnleggende servicekunnskap og kan skade mikroskopet. Den enkleste måten å introdusere lyset til mikroskopet er å koble den optiske fiberen fra toppen av objektivlinsen, der det vanligvis er plass til TEM-avbøyningsspolene og ekstra detektorer. Mer ledig plass kan også forventes fra eldre toppinngangsenheter, der samme sted huser prøvevakuumlåsen og prøveinstallasjonsmekanismen. Denne konfigurasjonen er mye beskrevet i en tidligere rapport25, som inneholder en eksemplarisk belysningsdesign. Hvis det indre av mikroskopet ikke tillater installasjon av den optiske fiberen over objektivlinsen, kan belysningen installeres inne i objektivlinsens polstykke fra side32. Andre løsninger forutsetter bruk av en dedikert prøveholder4 eller omvendt bruk av holderen for katodoluminescerende observasjoner1.

Generelt er fremstilling av væskeprøver for TEM komplisert og krever erfaring og manuelle ferdigheter. Det kritiske trinnet i flytende cellepreparasjon er trinn 2.6. i protokollen. Det er viktig å plassere det andre rutenettet raskt for å unngå fordampning av væsken. Metoden som presenteres her er enkel og krever ikke uvanlige materialer; Det kan imidlertid ikke passe alle væsker. I noen tilfeller er det gunstig å rengjøre substratet med plasma for å øke dets hydrofilitet. For væskeprøver, spesielt vannløsninger, som ikke inneholder partikler og / eller celler som kan tjene som avstandsstykke mellom karbonfilmene, kan innkapslingen mislykkes da all væsken kan strømme ut mellom de flate overflatene. Ved hjelp av en grafen flytende celle fremstilt ved hjelp av et holey substrat, som skaper små "lommer" for væske, kan være mer egnet33.

TEM-observasjoner utført i væske kan forstyrres av noen få faktorer relatert til prøveprepareringen og de ugunstige effektene forårsaket av elektronstrålen. Den første inkluderer løsrivelse av substrater og bevegelse av væsken, ofte etterfulgt av brudd på karbonfilmen, som oppstår for høye væskevolumer i området og / eller ved elektronbestråling. Dette kan unngås ved å minimere væskevolumet i trinn 2.5. i protokollen.

Bestrålingen med svært energiske elektroner fører til energioverføring, noe som resulterer i oppvarming eller radiolyse. Etter interaksjon med stråling dekomponerer vann til radikaler (H · og OH ·), H2 og oppløste elektroner. Disse artene deltar i ytterligere reaksjoner, og genererer dermed forskjellige produkter og forårsaker skade på prøven34. Derfor er det svært viktig å holde elektrondosen lav under observasjonene (trinn 3.2.), spesielt for følsomme prøver som celler. Andre effekter forårsaket av elektronstrålen er utfelling fra løsningen (figur 4A) og skumdannelse av væsken (figur 4C). Senking av elektrondosen bidrar til å unngå disse to negative effektene, men noen ganger er det ikke mulig å eliminere dem. Det kan også være noe strålingsfølsom forurensning i løsningen, som legger seg på cellen (figur 4B) og endringer ved elektronstrålepåvirkning. Dette er ugunstig da urenheten kan tas som en del av cellen, som er skadet på lysbestrålingen, noe som fører til feil konklusjoner. Den beste måten å få pålitelige bilder på er å finne et uforurenset område og holde elektrondosen så lav som mulig.

Pålitelige in situ TEM-studier av fotoreaksjoner krever en god sammenligning mellom prosessene indusert av lys med de som er forårsaket av elektronstrålen. Bortsett fra å senke elektrondosen beskrevet i trinn 3.2., er det nyttig å slå av elektronkilden for lysbelysningstiden slik at de uforstyrrede resultatene kan observeres, som understreket i trinn 4.3. i protokollen.

Denne protokollen kan brukes til å observere lysinduserte reaksjoner (spesielt i væske), for eksempel lys på metall nanoclusters2, lysinduserte katalyseprosesser1, og påvirkning av lys på biologiske prøver (f.eks. Celler med fotosensibilisator, kloroplaster).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskningen ble støttet av Miniatura-stipendet (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbon film on 200 mesh copper grid Agar Scientific AGS160 The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers Dumont N5 The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor ThorLabs S130C The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber Thorlabs FG400UEP Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope Hitachi H-800 Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser CNI MRL-III-660D The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
  2. Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
  3. Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
  4. Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).
  5. Tung, C. -W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).
  6. Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).
  7. Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
  8. Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
  9. Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
  10. Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
  11. Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
  12. Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
  13. Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
  14. Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
  15. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  16. De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
  17. Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
  18. Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
  19. Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
  20. Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
  21. Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
  22. Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
  23. Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
  24. Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).
  25. Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).
  26. Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
  27. Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
  28. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
  29. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  30. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  31. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
  32. Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
  33. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  34. Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).

Tags

Prosjektering utgave 185
Lysindusert <em>in situ</em> transmisjonselektronmikroskopi for observasjon av interaksjonen mellom væske og myk materie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Żak, A., Kaczmarczyk, O.… More

Żak, A., Kaczmarczyk, O. Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction. J. Vis. Exp. (185), e63742, doi:10.3791/63742 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter