Artículo de método

Preparación de proteómica unicelular para análisis de espectrometría de masas utilizando lisis por congelación y calor y un portador isobárico

DOI:

10.3791/63802

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9 de diciembre de 2022

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Barnett Institute, Northeastern University, 3Department of Biology, Northeastern University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este protocolo, describimos cómo preparar células de mamíferos para el análisis proteómico unicelular mediante espectrometría de masas utilizando reactivos y equipos disponibles comercialmente, con opciones para pipeteo manual y automático.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El análisis proteómico unicelular requiere métodos sensibles, cuantitativamente precisos, ampliamente accesibles y robustos. Para cumplir con estos requisitos, el protocolo Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) se desarrolló como un método de segunda generación para cuantificar cientos o miles de proteínas de muestras limitadas, hasta el nivel de una sola célula. Los experimentos que utilizan este método han logrado cuantificar más de 3.000 proteínas en 1.500 células de mamíferos individuales (500-1.000 proteínas por célula) en 10 días de tiempo de instrumento de espectrómetro de masas. SCoPE2 aprovecha un ciclo de congelación y calor para la lisis celular, evitando la necesidad de limpiar celdas individuales y, en consecuencia, reduciendo las pérdidas de muestra, al tiempo que acelera la preparación de muestras y simplifica su automatización. Además, el método utiliza un portador isobárico, que ayuda a la identificación de proteínas y reduce las pérdidas de muestra.

Este protocolo de video proporciona una guía detallada para permitir la adopción del análisis automatizado de proteínas unicelulares utilizando solo equipos y reactivos que son ampliamente accesibles. Demostramos pasos críticos en el procedimiento de preparación de células individuales para el análisis proteómico, desde la recolección hasta la inyección y el análisis de cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS). Además, los espectadores son guiados a través de los principios del diseño experimental con el portador isobárico, el control de calidad para las preparaciones de portador isobárico y de una sola célula, y los resultados representativos con una discusión de las limitaciones del enfoque.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El análisis unicelular es ampliamente utilizado para estudiar el nivel de heterogeneidad dentro de los sistemas biológicos que de otro modo serían indiscernibles por mediciones masivas 1,2,3. Tal diversidad celular puede tener consecuencias funcionales que pueden promover la comprensión de los procesos biológicos integrales, desde la resistencia terapéutica de las células cancerosas 4,5,6 hasta la heterogeneidad de célula a célula en la diabetes 7,8,9,10. Muchas investigaciones se han centrado en la medición de ácidos nucleicos en células individuales, mediante la medición de niveles genéticos o transcriptómicos y han permitido la clasificación de tipos y estados celulares. Sin embargo, tal progreso en el espacio de los ácidos nucleicos no puede llenar el vacío de conocimiento de la regulación post-transcripcional11, impulsando la necesidad de mediciones de proteínas de alto rendimiento similares en células individuales12,13,14,15.

Hemos desarrollado SCoPE216,17 para abordar la demanda de proteómica unicelular rigurosa y robusta de sistemas de mamíferos. Es un método multiplexado, que permite un mayor rendimiento al etiquetar y analizar muchas celdas en paralelo18, en contraste con los mthods sin etiqueta que analizan una celda a la vez19,20. La metodología de preparación de muestras, el enfoque de espectrometría de masas y los pasos posteriores de análisis de datos permiten una cuantificación precisa de cientos a miles de proteínas por célula individual. Este método hace posible el análisis por espectrometría de masas de células individuales a través del portador isobárico21, una pequeña muestra masiva de células (generalmente 25-200) que es biológicamente similar a la población unicelular de interés. Este material portador se multiplexa en un conjunto con un canal de referencia del mismo material y celdas individuales mediante el uso de etiquetas de masa en tándem (etiquetas TMT). El canal portador reduce la pérdida de muestras en las áreas de superficie y proporciona los fragmentos de la columna vertebral de iones para una identificación exitosa del péptido. El canal de referencia, que se prepara a granel y posteriormente se diluye hasta 5-10 equivalentes de celda para cada conjunto de una sola celda, ayuda a controlar la variabilidad técnica en el análisis. Específicamente, la referencia permite la normalización de la variabilidad causada por los efectos relacionados con LC-MS / MS, como el muestreo de iones y las eficiencias de ionización. Por lo general, los canales de referencia y portadores están hechos de la misma población celular.

Este protocolo de preparación de muestras es un método de segunda generación basado en SCoPE-MS22 mediante múltiples mejoras sinérgicas. Las mejoras incluyen un método de lisis celular que evita la limpieza de la muestra, que es un paso común de las preparaciones de proteómica de la EM. Utiliza mPOP (minimum ProteOmic sample Preparation)23, que es un método de lisis por congelación-calor. Este método permitió la lisis de celdas individuales en volúmenes más pequeños y en placas de múltiples pocillos en lugar de en viales, lo que facilitó una mayor tasa de rendimiento y automatización por parte de los termocicladores. En conjunto, este método ha reducido el costo por celda individual y ha aumentado la precisión cuantitativa en comparación con SCoPE-MS 16,24.

Este protocolo describe cómo preparar células individuales para el análisis proteómico, incluida la forma de preparar el portador y los canales de referencia utilizando etiquetas isobáricas TMTpro 18-plex. Las células de mamíferos que están en suspensión de una sola célula y que pueden aislarse en placas de 384 pocillos probablemente sean susceptibles a este protocolo. También se incluyen resultados representativos de conjuntos exitosos de una sola celda, que muestran varias gráficas de control de calidad generadas por una aplicación R Shiny, DO-MS25. Otras herramientas de software publicadas 26,27 y directrices experimentales 17,21 han mejorado la adopción de este protocolo. Esperamos que esta guía visual ayude aún más a los investigadores a realizar experimentos de proteómica unicelular.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: En este protocolo, la temperatura ambiente (RT) es de 18-22 °C.

1. Generación de material portador y de referencia

  1. Aislamiento celular
    1. Recoja células de interés en suspensiones celulares en PBS helado 1x.
      NOTA: Si es posible, el portador y el material de referencia deben prepararse a partir de la(s) población(es) celular(es) elegida(s) para ser estudiadas a nivel de una sola célula. Un número similar de células de las diferentes condiciones experimentales (como las células inmunes estimuladas y no estimuladas) debe constituir el portador y la referencia. En situaciones en las que no se puede cosechar un número suficientemente grande de estas células, se debe seleccionar una población celular adecuada en función de la similitud biológica.
    2. Usando un hemocitómetro u otro medio de conteo celular (como FACS), cuente el número de células en la suspensión.
    3. Girar y resuspender 22.000 células de cada tipo de célula en 11 μL de agua de grado HPLC, por separado en tubos de PCR (tubos de PCR estándar de 250 μL).
      NOTA: El número de celdas aconsejadas aquí es suficiente para los portadores y referencias para el número de conjuntos que se pueden preparar a partir de una placa de 384 pocillos llena de celdas individuales. La entrada de celda en este paso y las cantidades de reactivo en pasos posteriores se pueden escalar proporcionalmente para un mayor número de conjuntos. La velocidad de giro depende de las prácticas de cultivo celular del laboratorio. Un giro típico: 300 × g durante 5 min.
    4. Transfiera las muestras a un congelador a -80 °C durante al menos 30 minutos.
      PUNTO DE PAUSA: Las muestras pueden permanecer congeladas durante varios meses sin consecuencias para los datos de una sola célula.
  2. Lisis celular
    1. Caliente el tubo de PCR con las células a 90 °C durante 10 min (con la tapa del termociclador ajustada a 105 °C) y, a continuación, deje que los tubos se enfríen a 12 °C inmediatamente después del ciclo de calentamiento.
    2. Vortex el tubo brevemente, y luego girar hacia abajo en un tubo de PCR de sobremesa giratorio en RT para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo.
    3. En un sonicador de baño de agua, sonicar los tubos durante 5 minutos, luego colocarlos en hielo en RT.
  3. Digestión de tripsina
    1. Agregue 2.2 μL de la mezcla maestra (consulte la Tabla 1 para los componentes) a cada tubo de muestra mientras está en hielo.
      PRECAUCIÓN: La tripsina puede causar irritación de la piel, respiratoria y ocular. Asegúrese de usar equipo de protección personal. Mango debajo de una campana extractora de humos químicos.
    2. Vortex los tubos brevemente para mezclar y girar hacia abajo en un tubo de PCR de sobremesa en RT para recoger todo el líquido en la parte inferior de cada tubo.
    3. Calentar las muestras a 37 °C durante 3 h (con la tapa del termociclador a 52 °C).
  4. Reacción de etiquetado TMT
    1. Gire las muestras después de la digestión en un hilandero de tubo de PCR de sobremesa en RT.
    2. Divida cada muestra en dos volúmenes iguales de 6,6 μL cada uno, de modo que cada tubo contenga 11.000 células.
    3. A los tubos destinados al portador, agregue 3,3 μL de etiqueta TMT 126 que ha sido resuspendido a una concentración de 85 mM.
    4. A los tubos destinados a la referencia, añadir 3,3 μL de etiqueta TMT 127N que ha sido resuspendida a una concentración de 85 mM.
    5. Vortex los tubos brevemente y gire hacia abajo en un tubo de PCR giratorio de sobremesa en RT para recoger el líquido en la parte inferior.
    6. Dejar los tubos en RT durante 1 h.
  5. Enfriamiento de la reacción de etiquetado TMT
    1. Agregue 1.65 μL de hidroxilamina al 0.5% a cada tubo.
      PRECAUCIÓN: La hidroxilamina puede causar irritación de la piel. Asegúrese de usar equipo de protección personal.
    2. Vortex los tubos brevemente y gire hacia abajo en un tubo de PCR giratorio de sobremesa en RT para recoger el líquido en la parte inferior.
    3. Deje los tubos en RT durante 30 min.
  6. Combinación de portador y referencia
    1. Si las muestras que constituirán el portador han sido etiquetadas por separado, mézclelas en proporciones iguales.
    2. Si las muestras que constituirán la referencia se han etiquetado por separado, mezclarlas en proporciones iguales.
    3. Mezclar el portador y la referencia de modo que la concentración final del portador sea de 100-200 células/μL, y la concentración de referencia sea de 5-10 células/μL.
    4. Evalúe la calidad del portador y los materiales de referencia antes de combinarlos con conjuntos de una sola celda.
      NOTA: El control de calidad del soporte y el material de referencia se puede llevar a cabo mediante una variedad de métodos, pero se recomienda utilizar el software DO-MS, disponible en eldo-ms.slavovlab.net 17. Las mediciones críticas de calidad incluyen la tasa de escisión (<25%, una métrica calculada como el número de péptidos identificados con confianza con una escisión perdida dividida por el número de péptidos identificados con confianza en total) y la eficiencia del etiquetado (>99%, una métrica calculada como el número de sitios de etiquetado, a saber, el péptido N-terminal y lisina, con una etiqueta dividida por el número total de sitios de etiquetado).
      PUNTO DE PAUSA: El soporte y los materiales de referencia se pueden almacenar a -80 °C hasta que sea necesario.
ComponenteConcentración de mezclaConcentración final por tubo
Tripsina Oro50 ng/μL8,33 ng/μL
TEAB, pH = 8.5500 mM83,33 mM
Benzonasa nucleasa1.2 unidades0.2 unidades

Tabla 1: Cantidad de reactivo de la mezcla maestra. Se enumeran las concentraciones finales de reactivos necesarios para la digestión de tripsina.

2. Preparación de muestras SCoPE2

  1. Aislamiento celular
    1. Complemente el agua de grado HPLC con 25 fmol por péptido por μL de una solución peptídica sintética.
      NOTA: La solución peptídica Waters MassPrep es un ejemplo de lo que se puede usar. Está compuesto por siete péptidos que no se ionizan muy bien. Este es un aspecto clave de esta solución: estos péptidos no interfieren con la cuantificación precisa de la espectrometría de masas de células individuales. Cualquier mezcla altamente purificada de unos pocos péptidos que probablemente no esté en las muestras de interés será apropiada.
    2. Agregue 1 μL de esta mezcla a cada pocillo de una placa de 384 pocillos usando un robot dispensador de líquidos o una pipeta manual.
    3. Selle la placa y gírela hacia abajo en un spinner de placa de sobremesa en RT para recoger el líquido en la parte inferior.
      PUNTO DE PAUSA: Las placas con esta solución se pueden almacenar a -80 °C hasta que sea necesario.
    4. Obtener una suspensión de celdas no fijas que se desagregan.
      NOTA: La forma exacta en que se obtiene la suspensión celular se basa en el tipo de célula de interés. Aquí hay ejemplos amplios:
      1. Células en suspensión: gire las células en un pellet y retire el medio de cultivo celular.
      2. Células adherentes: eliminan las células del plato o matraz mediante tripsinización o raspado. Luego, gírelos hacia abajo para eliminar el medio de cultivo celular.
    5. Lave la suspensión celular dos veces con 1x PBS helado. Deje las celdas suspendidas en 1x PBS después del segundo lavado.
    6. Si la placa de 384 pocillos estaba congelada, descongélela en RT. Gírela hacia abajo para asegurarse de que todo el líquido esté en el fondo de los pozos.
    7. Utilice un clasificador de celdas u otros medios disponibles, como la selección manual manual, para distribuir celdas individuales en los pozos respectivos.
      NOTA: Agregue celdas individuales a los pozos dejando algunos pozos vacíos para controles negativos y positivos (ver discusión). Cuando utilice la citometría de flujo, utilice el caudal más bajo posible para el citómetro de flujo. Se cree que un caudal más bajo es más suave para el manejo celular. Además, el tamaño de la boquilla debe ser apropiado para su uso con las células de interés. Se recomienda colaborar con una instalación de citometría de flujo.
    8. Agregue controles positivos de lisado equivalente de 2-5 celdas a pozos seleccionados pipeteados manualmente o con robots de manejo de líquidos.
    9. Selle y gire la placa con celdas clasificadas en un hilandero de placa de sobremesa en RT para recoger el líquido en la parte inferior. Congelar la placa a -80 °C lo antes posible.
      PUNTO DE PAUSA: Las placas con celdas individuales clasificadas se pueden almacenar a -80 °C hasta que sea necesario.
  2. Lisis celular
    1. Tome la placa de 384 pocillos con las celdas individuales clasificadas y colóquela en el termociclador lo más rápido posible.
    2. Caliente la placa a 90 °C durante 10 min (con la temperatura de la tapa ajustada a 105 °C) y, a continuación, deje que la placa se enfríe a 12 °C.
    3. Gire la placa brevemente en un spinner de placa de sobremesa en RT.
    4. En un sonicador de baño de agua, sonicar la placa durante 5 minutos en RT, luego colocarla en hielo.
  3. Digestión de tripsina
    1. Prepare 100 μL de la mezcla maestra (consulte la Tabla 1 para los componentes) por placa de 384 pocillos.
    2. A cada pocillo de la placa de 384 pocillos, añadir 0,2 μL de la mezcla maestra preparada en el paso 2.3.1 utilizando un manipulador de líquidos.
      NOTA: Utilice volúmenes más grandes si se utiliza el pipeteo manual, asegurándose de que las concentraciones finales de reactivos sigan siendo las mismas por pocillo.
    3. Selle la placa, el vórtice durante 5 s y gire hacia abajo en un spinner de placa de sobremesa en RT.
    4. Calentar la placa de 384 pocillos a 37 °C (con la temperatura de la tapa ajustada a 52 °C) durante 3 h.
  4. Reacción de etiquetado TMT
    1. Saque las existencias de 85 mM de etiquetas TMT (128N a 135N) del congelador de -80 °C. Caliente los tubos a temperatura ambiente antes de abrirlos.
    2. Diluir las etiquetas a 22 mM en acetonitrilo anhidro.
      PRECAUCIÓN: El acetonitrilo es un líquido inflamable. Puede irritar la piel, los ojos, las vías respiratorias y el sistema nervioso central. Asegúrese de usar equipo de protección personal. Mango debajo de una campana extractora de humos químicos.
    3. Usando esta estrategia de etiquetado, agregue 0.5 μL de etiquetas TMT diluidas a cada pocillo de la placa de 384 pocillos. Utilice un robot dispensador de líquidos (si utiliza un manipulador de líquidos, asegúrese de utilizar un equipo asociado que sea adecuado para disolventes orgánicos) o una pipeta manual.
      NOTA: Consulte la Tabla 2 para conocer la estrategia de etiquetado. Consulte la Tabla 3 para ver un ejemplo de diseño de placa.
    4. Selle la placa, el vórtice durante 5 s y gire hacia abajo en un spinner de placa de sobremesa en RT.
    5. Deje que la reacción de etiquetado proceda a RT durante 1 h.
  5. Enfriamiento de la reacción de etiquetado TMT
    1. A cada pocillo de la placa de 384 pocillos, agregue 0.2 μL de hidroxilamina al 0.5% (diluida en agua de grado HPLC) usando un manipulador de líquidos.
      NOTA: Utilice volúmenes más grandes si se utiliza el pipeteo manual, asegurándose de que las concentraciones finales de reactivos sigan siendo las mismas por pocillo.
    2. Selle la placa, el vórtice durante 5 s y gire hacia abajo en un spinner de placa de sobremesa en RT.
    3. Mantenga el plato en RT durante 30 min.
  6. Preparación para el análisis LC-MS/MS: combinación de celdas individuales y pocillos de control con material portador/de referencia
    1. Retire el material portador/de referencia combinado del congelador a -80 °C.
    2. Para cada serie, pipetear 1 μL de portador y material de referencia en el primer pocillo que formará parte de un solo conjunto. Pipetear el volumen completo del primer pozo al pozo siguiente. Continuar pipeteando el volumen completo de una celda a la siguiente hasta que todos los pozos que se incluirán en un solo conjunto se hayan combinado en el pozo final.
      NOTA: El portador y el material de referencia deben estar en una concentración de equivalentes de 200 y 5 celdas, respectivamente, pero como se discutió anteriormente21, estas cantidades pueden variar. Cada conjunto, como se describe en la estrategia de etiquetado (ver Tabla 2), debe contener portador, referencia y hasta 12 o 14 muestras de celda única o de control cuando se usa TMTpro-16plex o TMTpro-18plex, respectivamente (ver paso 2.4.3).
    3. Para cada serie, agregue 5 μL de acetonitrilo al 50% (diluido en agua de grado HPLC) al primer pocillo de una sola célula que se incluirá en cada serie. Pipet el volumen completo desde el primer pozo hasta el pozo siguiente. Continuar pipeteando el volumen completo de una celda a la siguiente hasta que todos los pozos que se incluirán en un solo conjunto se hayan combinado en el pozo final.
      NOTA: Este paso de lavado puede ayudar en la recuperación de muestras de los pozos.
    4. Transfiera cada juego a sus insertos de vidrio de muestreador automático individuales.
      NOTA: Estos conjuntos también pueden combinarse en pocillos individuales de una placa de 384 pocillos y colocarse directamente en el muestreador automático para inyección28.
    5. Una vez que todos los juegos estén combinados y colocados en insertos de vidrio, seque las muestras.
      PUNTO DE PAUSA: Los conjuntos secos pueden almacenarse a -80 °C durante al menos 1 semana antes de funcionar con un espectrómetro de masas.
    6. Antes del análisis LC-MS/MS, agregue 1,2 μL de ácido fórmico al 0,1% (diluido en agua de grado HPLC) a cada conjunto para resuspender los péptidos marcados.
      PRECAUCIÓN: El ácido fórmico es un líquido inflamable. Puede causar daño ocular grave o quemaduras en la piel. Asegúrese de usar equipo de protección personal. Mango en un área bien ventilada.
    7. Coloque los insertos del muestreador automático en viales de muestreador automático de vidrio y cierre cada muestra con una tapa.
    8. Vortex cada vial durante 5 s para asegurarse de que la resuspensión esté completa, y luego gire hacia abajo en un spinner de vial en RT.
    9. Asegúrese de que cada muestra esté en la parte inferior del inserto, en lugar de salpicar en los lados.
    10. Coloque los viales en la bandeja del muestreador automático.
    11. Para cada serie, inyecte 1 μL para el análisis LC-MS/MS.
Etiqueta126127N127C128N128C129N129C130N130C....135N
Tipo de muestraPortadorReferenciaVacíoVacíoSC/ControlSC/ControlSC/ControlSC/ControlSC/Control....SC/Control

Tabla 2: Ejemplo de esquema de etiquetado SCoPE2 TMTpro-18plex. El portador y la referencia generalmente se etiquetan en las dos primeras etiquetas TMT. Luego, las siguientes dos etiquetas se omiten debido a la posible contaminación isotópica que haría que la cuantificación fuera menos precisa. Las otras etiquetas que quedan son para celdas individuales o controles.

128C129N129C130N130C131N131C132N132C133N133C134N128C129N129C130N130C131N131C132N132C133N133C134N
123456789101112131415161718192021222324
UnSCSC-SCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSC-SC+SCSCSC
BSC+SCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSC+
CSC-SC-SCSCSC+SC-SCSCSCSC+SC-SCSCSCSCSCSC-
DSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSC+SC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
ESCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSC-SCSC
FSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSC+SCSCSC+SCSCSC+SCSC
GSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSC
HSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSC
YoSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
J-SC+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSCSCSC
KSCSCSCSC-SCSCSCSC-SCSC+SC--SCSCSCSCSCSCSCSC
LSCSCSCSCSC-SCSCSCSCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SC
MSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSC
N+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
OSCSCSCSC+SCSCSCSCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
PSCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSC-SC

Tabla 3: Ejemplo de diseño de placa para etiquetado utilizando TMTpro-16plex. Usando un formato de placa de 384 pocillos (o cualquier otro formato de placa), es importante aleatorizar los pocillos en los que se clasifican las células. Se utilizará un diseño de placa diferente para TMTpro-18plex.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los resultados positivos del protocolo implican verificar que una serie de pasos críticos en el protocolo se han realizado con éxito; estos incluyen la preparación del portador, el aislamiento de una sola célula, la lisis, la digestión, el etiquetado de códigos de barras y la optimización de parámetros de MS. Las gráficas DO-MS permiten una fácil evaluación de la finalización de cada paso crítico en el protocolo. Un portador preparado con éxito, que generalmente corresponde a 25 y 200 células en cantidad (por conjunto), está bien digerido y bien etiquetado. Las gráficas de DO-MS permiten cuantificar la intensidad de la muestra (para estimar la cantidad), la eficiencia de digestión (idealmente <25% de errores de escisión) y la eficiencia de etiquetado (debe ser >99%). Lo más crítico es que las muestras portadoras que no están completamente etiquetadas pueden permitir la reacción cruzada con los códigos de barras destinados a células individuales y agregar una señal espuria a la cuantificación de péptidos unicelulares.

Los pocillos de control negativo incluyen todos los reactivos experimentales pero carecen de una célula. Esto permite evaluar no solo el ruido de fondo, sino también determinar la eficiencia del aislamiento celular al proporcionar una señal representativa de un pozo vacío. El informe DO-MS ofrece gráficos para evaluar la señal medida del pozo de control junto con los pocillos de una sola célula para determinar el éxito del aislamiento celular y el ruido de fondo. Además, la calidad de la cuantificación se puede evaluar utilizando la canalización SCoPE2 (disponible en GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) o el paquete SCP Bioconductor29.

La digestión y la eficiencia de etiquetado de las células individuales pueden no ensayarse directamente como con el portador, pero DO-MS nuevamente proporciona gráficos que permiten la estimación de la digestión y la eficiencia del etiquetado. Al incluir un control de 100-200 células junto con la preparación de las células individuales (es decir, recibir todas las mismas adiciones de reactivos), las eficiencias de digestión y etiquetado pueden evaluarse para ese control, y se supone que son compartidas por las células individuales preparadas al lado. La mala digestión estará indicada por una alta proporción de la intensidad de los péptidos diferidos a sus contrapartes completamente escindidas (Figura 1).

Otro factor a considerar en los conjuntos es la fracción de datos faltantes y la intensidad media del ion reportero en cada canal TMT (Figura 2). Cuando las células individuales se preparan con éxito, la cantidad de datos faltantes por celda y control positivo es mucho menor que en las muestras de control negativo. Del mismo modo, la intensidad media de los precursores es mucho mayor en células individuales y controles positivos que en controles negativos. La optimización de los parámetros de MS se ha discutido ampliamente en otra parte21, y los parámetros óptimos se pueden determinar utilizando herramientas como DO-MS o SCP Companion25,27.

figure-results-1
Figura 1: Control de calidad de la preparación del portador. Gráficos DO-MS que representan (A) la eficiencia de etiquetado de un portador preparado con éxito en los sitios de etiquetado con TMT: la amina primaria en la cadena lateral de lisina y el péptido N-terminal, y (B) la eficiencia de digestión en residuos de aminoácidos de escisión tríptica. Abreviatura: TMT = etiqueta de masa en tándem. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Control de calidad de la preparación de una sola célula. Gráficos DO-MS que representan (A) la fracción de datos faltantes en celdas individuales (C5-10), controles (C13,16), portadores (C1) y referencia (C2), y (B) la intensidad de celdas individuales y controles. Las etiquetas 127C, 128N, 131C, 132N, 133N y 133C, que corresponden a C3, C4, C11, C12 y C15, no se utilizan en este conjunto en particular. El control positivo consiste en material celular procesado a péptidos a granel, luego diluido a un nivel de 2-5 células / μL antes del etiquetado. El control negativo consiste en un pozo sometido a todos los pasos preparatorios utilizados para células individuales, solo que sin la adición de una sola célula. Abreviatura: TMT = etiqueta de masa en tándem. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una de las claves para una preparación y análisis exitosos de células individuales por SCoPE2 es la preparación de los canales portadores y de referencia. El tamaño de portador sugerido es de 100 a 200 celdas; Sin embargo, el número de células necesarias para un experimento particular de una sola célula puede determinarse sobre la base de los principios que se discuten en otra parte21. Para el tamaño sugerido, se necesitan al menos ~ 11,275 celdas por placa de 384 pocillos, lo que permite un portador de 200 celdas y una referencia de 5 celdas en cada conjunto. Puede ser ventajoso aislar más células si las poblaciones celulares deseadas no son un factor limitante, simplemente tener material extra en caso de errores (como se hizo en este protocolo, aislando 22,000 células en lugar de 11,275 células). La cantidad de portador y referencia necesaria para el número de placas deseadas debe prepararse en un solo lote para minimizar cualquier variación de lote a lote que pueda causar que la identificación o cuantificación de péptidos difiera entre lotes.

Antes de aislar celdas individuales en pozos de una placa de 384 pocillos, es importante considerar el diseño de la disposición de la placa. Dentro de cada placa de 384 pocillos, se recomienda implementar controles positivos y negativos. Los controles negativos son pozos en los que no se agregan células, sino que se someten a las mismas adiciones y procedimientos de reactivos que los pocillos unicelulares. Los controles positivos son pocillos en los que se agrega lisado celular diluido a 2-5 células/μL en lugar de células individuales. Esto es particularmente importante de implementar cuando los métodos de aislamiento de una sola célula no están bien validados. Cada placa de 384 pocillos idealmente debe tener una distribución aleatoria de celdas individuales y controles (por ejemplo, no tener controles negativos o positivos en una sola fila). Cada placa debe tener una distribución equitativa de todas las poblaciones celulares de interés, en lugar de aislar un tipo de célula en una placa y un segundo tipo de célula en una segunda placa. Esto evitará vincular los efectos por lotes con los tipos de células de interés. Además, si se necesita más de una placa de 384 pocillos para el análisis, es aconsejable aislar las células en una sola sesión, en lugar de extender el paso de aislamiento durante varios días, si es posible.

La lisis tanto de células individuales como de portador/referencia tiene lugar en agua a través de un ciclo de congelación-calor23. Se anticipa que la mayoría de las proteasas han sido desnaturalizadas durante este paso. La tripsina se agrega inmediatamente después del paso de desnaturalización a una concentración alta, muchos órdenes de magnitud mayor en concentración que incluso las proteasas celulares más abundantes. Por acción masiva, la mayoría de los productos de actividad proteasa se deberán a la tripsina.

La reducción/alquilación de residuos de cisteína no se realiza en este protocolo antes de la digestión de tripsina. Los péptidos que contienen cisteína representan aproximadamente el 10% de los péptidos trípticos del proteoma humano. Observamos menos péptidos que contienen cisteína utilizando un enfoque sin reducción/alquilación. Estos pasos utilizan reactivos que son incompatibles con el etiquetado por TMT (química de ésteres NHS) inmediatamente después de la digestión.

En esta estrategia de etiquetado TMT, el portador y las referencias se etiquetan con 126 y 127N, respectivamente, mientras que los pozos de celda única y control se etiquetan con 128C a 135N. Las dos etiquetas después de la referencia, 127C y 128N, no se utilizan debido a la contaminación cruzada isotópica derivada de los canales portador y de referencia, que son claramente mucho más abundantes en material peptídico que las células individuales. En total, hay 12 canales TMT por conjunto que se pueden usar para etiquetar celdas individuales o pocillos de control con TMTpro-16plex, o 14 canales TMT por conjunto con TMTpro-18plex.

Los pasos críticos en el protocolo para realizar mediciones de proteómica de una sola célula utilizando este protocolo incluyen la preparación del portador, el aislamiento de una sola célula, la lisis, la digestión, el etiquetado de códigos de barras y los parámetros adecuados de espectrometría de masas. Estos pasos se han esbozado en este documento y se han detallado ampliamente en otra parte 17,21,25. Cada paso tiene una gráfica correspondiente o conjunto de parcelas en DO-MS que permiten un fácil control de calidad. Por ejemplo, en el caso de la creación exitosa del portador, las gráficas que representan el número de péptidos identificados, la eficiencia del etiquetado y el porcentaje de tasa de escisión permiten verificar su preparación exitosa. Los informes representativos de DO-MS están incluidos en esta publicación y pueden verse en http://scope2.slavovlab.net/ para los datos originales16. Estos informes DO-MS permiten evaluar la optimización del método en direcciones aún no investigadas por los autores, como gradientes LC más largos, diferentes enzimas de digestión o códigos de barras químicos alternativos.

Actualmente, el análisis en serie de péptidos mediante algoritmos de adquisición dependientes de datos limita el número de péptidos que se pueden analizar en una ejecución de LC de una longitud razonable. Esto se debe en parte a los tiempos de llenado más largos requeridos para la adquisición exitosa de suficientes iones para una cuantificación confiable de una sola célula21. Una limitación inherente al uso del portador es la falta de evaluación directa de la digestión y la eficiencia de etiquetado de las células individuales. Actualmente, una solución a esta limitación es realizar un control de calidad en una muestra más grande procesada junto con las células individuales.

Propusimos una serie de oportunidades para mejorar la proteómica unicelular, como la construcción de espectrómetros de masas con múltiples analizadores. El método actual permite la cuantificación de miles de proteínas de células de mamíferos individuales a una velocidad de aproximadamente 100 células por día con reactivos y equipos disponibles comercialmente. SCoPE2, la segunda generación del enfoque SCoPE-MS, mejoró significativamente su predecesor con respecto al número de células analizables por unidad de tiempo, el número de proteínas analizables por unidad de tiempo, el tiempo necesario para la preparación de muestras, la accesibilidad de reactivos y equipos, y el costo total de preparación y análisis por célula individual. Las proteínas unidas a la membrana son accesibles utilizando la lisis por congelación y calor y la digestión de la proteasa, como se muestra en comparación con la lisis de urea23. El método identifica muchas proteínas del tercio superior del proteoma con respecto a la abundancia16. Si el proteoformo modificado está en el tercio superior del proteoma, y el péptido modificado es susceptible de análisis de espectrometría de masas (ioniza bien, tiene una diferencia de masa con respecto al péptido no modificado), es más probable que sea susceptible a este protocolo. Este método puede aplicarse fructíferamente en sistemas biológicos donde existe una heterogeneidad significativa entre las células, como en la diferenciación, la senescencia o las respuestas inmunológicas (es decir, fagocitosis).

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Nos gustaría reconocer el premio Fall 2021 NSF I-Corps Program (sitio de Northeastern University) que ha financiado esta publicación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de 384 pocillos, placa PCR estándarThermo Fisher ScientificAB1384deben utilizar placas de polipropileno, si es necesario sustituirlas. Si se sustituyen, se deben evaluar los niveles de posible contaminación del polímero de otras placas antes de la preparación de SCoPE2.
Acetonitrilo (para la preparación de tampones), grado Optima LC-MS/MS FISHERScientificA955-1Este acetonitrilo se utiliza para cualquier tampón, es decir, el acetonitrilo al 50% que se utiliza para pasar a través de los pocillos después de pasar por el portador y referencia cuando se combinan conjuntos SCoPE2.
Precaución: El acetonitrilo es un líquido inflamable. Puede irritar la piel, los ojos, las vías respiratorias y el sistema nervioso central. Asegúrese de usar equipo de protección personal. Mango debajo de una campana de gases químicos.
Acetonitrilo (para la preparación de TMT), anhidro, 99.8%Sigma Aldrich271004-100MLEste acetonitrilo se utiliza para resuspender las etiquetas de TMT a la concentración del fabricante.
Precaución: El acetonitrilo es un líquido inflamable. Puede irritar la piel, los ojos, las vías respiratorias y el sistema nervioso central. Asegúrese de usar equipo de protección personal. Mango debajo de una campana de gases químicos.
Láminas adhesivas de placas PCRThermo Fisher ScientificAB0626
Muestreador automático de tapones de rosca de vialesThermo Fisher ScientificC5000-51B
Muestreador automático giratorio de viales (es decir, myFuge 5)MTC BioC2595Este modelo no tiene ningún control de velocidad. Simplemente se utiliza para recoger líquido en el fondo de los viales del muestreador automático.
Benzonasa nucleasaSigma AldrichE1014-25KU
Viales de rosca de vidrio transparente, 9 mmThermo Fisher Scientific60180-509
Ácido fórmico, Pierce, grado LC-MS/MS ThermoFisher Scientific85178Precaución: El ácido fórmico es un líquido inflamable. Puede causar daños oculares graves o quemaduras en la piel. Asegúrese de usar equipo de protección personal. Manéjelo en un área bien ventilada.
Insertos de muestreador automático de vidrio, 9 mmThermo Fisher ScientificC4010-630
Hidroxilamina (HA), 50% peso/volumenSigma Aldrich467804-50MLPrecaución: La hidroxilamina puede causar irritación de la piel. Asegúrese de usar equipo de protección personal.
Chips microfluídicos Mantis, chips 3PFE de bajo volumenFormulatrixMCLVPR2Estos chips están diseñados para usarse con el manipulador de líquidos microfluídicos Mantis para dispensar soluciones orgánicas. Estos se pueden utilizar para dispensar etiquetas TMT.
Chips microfluídicos Mantis, chips de silicona de bajo volumenFormulatrixMCLVS12Estos chips están diseñados para usarse con el manipulador de líquidos microfluídicos Mantis para dispensar soluciones acuosas. Estos no se pueden utilizar para dispensar etiquetas TMT.
Manipulador de líquidos microfluídicos MantisFormulatrixse puede sustituir. Sin embargo, es importante comprobar si el sistema es compatible con acetonitrilo al 100% (como en el caso de las etiquetas TMT), y que el sistema no introduce contaminación polimérica u otro tipo de contaminación en las muestras.
Adaptador de placa PCR Mantis con clavijas cónicas anchas para la manipulación automatizada de placasFormulatrix232400
Mezcla de péptidos MassPREPWaters186002337Mezcla de nueve péptidos no trípticos
Spinner de tubo de PCR (es decir, microcentrífuga de 16 posiciones para tubos de 0,2 mL)USA Scientific2621-0016Este modelo no tiene ningún control de velocidad. Simplemente se utiliza para recoger líquido en el fondo de los tubos.
Tubos de PCR: TempAssure 0,2 mL Tiras de PCR de 8 tubosUSA Scientific1402-3900Si se sustituyen, se deben evaluar los niveles de posible contaminación del polímero de otras placas antes de la preparación de SCoPE2.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 10x, pH 7,4, libre de RNasaThermo Fisher ScientificAM9625
Spinner de placas (es decir, microcentrífuga PlateFuge)Benchmark ScientificModel C2000Este modelo no tiene ningún control de velocidad. Simplemente se utiliza para recoger líquido en el fondo de los pozos.
Termociclador (es decir, C1000 Touch con módulo de 384 pocillos)Biorad1851138
TMTpro 16plex Juego de reactivos para etiquetas, 1 x 5 mgThermo Fisher ScientificA44520
Bicarbonato de trietilamonio (TEAB), 1 M, pH 8,5Sigma AldrichT7408100ML
Espectrometría de masas de oro con tripsina GradoPromegaV5280Esta tripsina es de muy alta pureza. Otros reactivos de tripsina pueden variar en sus niveles de pureza. El nivel de pureza es importante para lograr resultados positivos en SCoPE2.

Precaución: La tripsina puede causar irritación de la piel, las vías respiratorias y los ojos. Asegúrese de usar equipo de protección personal. Mango debajo de una campana de gases químicos.
Vortex (Mezclador de vórtice analógico)VWRModelo 58816-121
Sonicador de baño de agua (es decir, limpiador ultrasónico de 2,8 L con temporizador digital)VWR97043964
Water, grado Optima LC-MS/MS FisherScientificW6-1Se recomienda que todas las soluciones que deban diluirse o fabricarse se elaboren con agua de grado de espectrometría de masas. Cualquier dilución y/o mezcla maestra debe hacerse fresca. La contaminación resultante del agua de menor calidad puede afectar negativamente la detección de péptidos y la calidad de los datos de una sola célula.
Se El manipulador de líquidos

Referencias

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