Summary
Autoimmun encefalitt er en ny kategori av antistoffmedierte sykdommer i sentralnervesystemet. Hippocampale nevroner kan brukes til å oppdage og karakterisere disse antistoffene. Denne artikkelen gir en protokoll for primær cellekultur og immunostaining for å bestemme autoantistoffer i serum og cerebrospinalvæske hos pasienter.
Abstract
I løpet av de siste 15 årene har en ny kategori antistoffmedierte sykdommer i sentralnervesystemet (CNS) blitt karakterisert og er nå definert som "autoimmun encefalitt" (AE). Det er for tiden 17 kjente AE-syndromer, og alle er assosiert med antistoffer mot nevroncelleoverflaten eller synaptiske proteiner. De kliniske syndromene er komplekse og varierer i henhold til typen assosiert antistoff. Den mest kjente av disse sykdommene er anti-N-metyl D-aspartatreseptor (NMDAR) encefalitt, som er en fremtredende nevropsykiatrisk lidelse forbundet med alvorlig hukommelse og atferdssvikt. De tilknyttede antistoffene reagerer med GluN1-underenheten til NMDAR på N-terminaldomenet. Tilnærmingen som oftest brukes til oppdagelse og karakterisering av AE-antistoffer inkluderer kulturen av dissosierte, føtale, gnager hippocampale nevroner. Under prosessen med antistoffkarakterisering blir levende nevroner i kultur utsatt for pasientens serum eller CSF, og deteksjon av reaktivitet indikerer at serum- eller CSF-prøver av pasienten inneholder antistoffer mot nevronale overflateantigener. Hippocampale kulturer kan også brukes til å avgjøre om antistoffene hos pasienter er potensielt patogene ved å undersøke om de forårsaker strukturelle eller funksjonelle endringer i nevronene. Nivået på suksess for disse studiene avhenger av kvaliteten på kulturene og på protokollene som brukes til å oppnå og oppdage reaktiviteten til pasientprøver. Denne artikkelen gir en optimalisert protokoll for primær cellekultur av føtal rotte hippocampal nevroner kombinert med immunostaining for å bestemme tilstedeværelsen av antistoffer i serum eller CSF hos pasienter. Et eksempel på hvordan man undersøker potensielle patogene effekter av NMDAR-antistoffer ved bruk av dyrkede nevroner og kalsiumavbildning presenteres også.
Introduction
Autoimmun encefalitt (AE) er en nylig oppdaget kategori av sykdommer i sentralnervesystemet (CNS) mediert av antistoffer som retter seg mot nevronoverflate eller synaptiske proteiner 1,2. De kliniske egenskapene varierer i henhold til antistoffet, men inkluderer vanligvis nedsatt hukommelse og kognisjon, endret oppførsel og psykiatriske symptomer, unormale bevegelser, søvndysfunksjon, nedsatt bevissthetsnivå og anfall. Disse forstyrrelsene kan påvirke personer i alle aldre, med noen typer AE som hovedsakelig påvirker barn og unge voksne2.
De siste 15 årene er det beskrevet 17 AE-syndromer med antistoffer mot spesifikke nevronale overflate-/synaptiske proteiner (tab 1). Noen få eksempler på nevronmålene inkluderer de synaptiske eksitatoriske reseptorene NMDAR3,4 og AMPAR5, den synaptiske hemmende reseptoren GABAbR6, det nevronutskilte proteinet LGI17 og celleadhesjonsmolekylet IgLON58. For de fleste av disse bivirkningene har studier vist at antistoffene forstyrrer strukturen eller funksjonen til målantigenet, og støtter sterkt en patogen rolle. For eksempel, i anti-NMDAR-encefalitt, reagerer antistoffene med det N-terminale domenet til GluN1-underenheten til NMDAR, og produserer en selektiv og reversibel internalisering av disse reseptorene som resulterer i fremtredende nevropsykiatriske endringer 4,9,10,11. Dermed kan identifiseringen av noen av de 17 kjente antistoffene i serum eller CSF hos en pasient også brukes som en diagnostisk test som fastslår diagnosen av en bestemt AE.
En av teknikkene som oftest brukes til identifisering og karakterisering av disse antistoffene, inkluderer bruk av kulturer av dissosierte, føtale, gnager hippocampale nevroner. Disse kulturene er nyttige av flere grunner: embryonal hjerne er lett å dissosiere og inneholder et lavt nivå av gliaceller, den viktigste forurensningskilden i nevronkulturer12; cellepopulasjonen i hippocampus er relativt homogen sammenlignet med de fleste andre regioner i CNS, med pyramideceller som representerer det store flertallet13,14; kulturer fremstilles fra embryoer i sen fase når genereringen av pyramidale nevroner er fullført, men granulatceller ennå ikke har utviklet seg, noe som ytterligere legger til homogeniteten av kulturen; når dyrkede, pyramidale nevroner uttrykker de fleste av deres viktigste fenotypiske egenskaper, er i stand til å danne velutviklede dendritter og etablere synaptisk tilkoblede nettverk som kan brukes til strukturelle og elektrofysiologiske undersøkelser12,13; da antistoffer ikke kan trenge inn i levende nevroner, tillater bruk av levende kulturer identifisering av antigene mål som ligger på celleoverflaten; og immunoprecipitation av antistoff-antigenkomplekset fra nevronkulturer tillater identifisering av målantigenet5.
Suksessen til studier som bruker nevronkulturer er svært avhengig av kvaliteten på kulturene og protokollene som brukes til å vurdere immunreaktiviteten til pasientens serum eller cerebrospinalvæske (CSF). Variabler som kan påvirke kulturene inkluderer prosedyrene for isolering av hippocampus før kulturutvikling, dissosiasjon av vevet, pletteringstettheten, vekstoverflaten som brukes og sammensetningen av media13,15,16. Denne artikkelen gir en optimalisert protokoll for primærcellekultur av føtale rotte hippocampale nevroner kombinert med fluorescerende immunostaining som kan brukes til å bestemme tilstedeværelsen av antistoffer mot kjente AE-antigener og potensielt nye overflatemål. Det gir også et eksempel på hvordan man undersøker de patogene effektene av NMDAR-antistoffer ved levende celleavbildningsteknikker ved bruk av dyrkede hippocampale nevroner som uttrykker en genetisk kodet kalsiumindikator (GECI) fra GCaMP-familien, GCaMP5G.
| Mål protein | Protein funksjon | Celle rom | Hovedsyndrom |
| NMDAR | Ion Chanel | Synaptisk protein | Anti-NMDAR encefalitt |
| AMPAR | Ion Chanel | Synaptisk protein | Limbisk encefalitt |
| GluK2 | Ion Chanel | Synaptisk protein | Hjernebetennelse |
| GABAaR | Ion Chanel | Synaptisk protein | Hjernebetennelse |
| GABAbR | Metabotrope reseptor | Synaptisk protein | Limbisk encefalitt |
| mGluR1 | Metabotrope reseptor | Synaptisk protein | Hjernebetennelse |
| mGluR2 | Metabotrope reseptor | Synaptisk protein | Hjernebetennelse |
| mGluR5 | Metabotrope reseptor | Synaptisk protein | Hjernebetennelse |
| D2R | Metabotrope reseptor | Synaptisk protein | Basal ganglia encefalitt |
| LGI1 | Adhesjonsmolekyl | Protein på celleoverflaten | Limbisk encefalitt |
| CASPR2 | Adhesjonsmolekyl | Protein på celleoverflaten | Limbisk encefalitt |
| IgLON5 | Adhesjonsmolekyl | Protein på celleoverflaten | Anti-IgLON5 sykdom |
| Nevreksin-3α | Adhesjonsmolekyl | Protein på celleoverflaten | Hjernebetennelse |
| DNER (Tr) | Transmembran protein | Protein på celleoverflaten | Hjernebetennelse |
| SEZ6L | Transmembran protein | Protein på celleoverflaten | Hjernebetennelse |
| Amfifysin | Strukturelt molekyl | Protein på celleoverflaten | Limbisk encefalitt |
| DPPX | Peptidase | Protein på celleoverflaten | Hjernebetennelse |
Tabell 1: Antistoffer mot nevroncelleoverflaten og synaptiske proteiner.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av den lokale etiske komiteen ved Universitetet i Barcelona etter europeiske (2010/63 / UE) forskrifter om bruk og stell av forsøksdyr. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasienter, og studien ble godkjent av den lokale institusjonelle vurderingsnemnda for bruk av humane prøver (Hospital Clínic, HCB/2018/0192).
MERK: Det er tre deler i den gjeldende protokollen. Den første er for å etablere nevronkulturer, den andre er for påvisning av overflateantistoffer ved bruk av levende kulturer av nevroner, og den tredje er å bestemme patogeniteten til disse antistoffene.
DEL 1: Etablering av dissosierte, føtale hippocampale nevronkulturer
1. Forberedende trinn
- Poly-L-lysin belegg av plating overflater (3 dager før disseksjon)
- Forbered boratbufferen ved å tilsette 2,38 g borsyre og 1,27 g boraks til 500 ml destillert vann og omrøring i 15 minutter til det er oppløst. Under en hette, steriliser bufferløsningen ved å filtrere (0,2 μm porestørrelse), etikett og oppbevar ved romtemperatur (RT).
MERK: Denne løsningen er stabil og kan brukes i 6 måneder.
FORSIKTIG: Når du forbereder boratbuffer, bruk anbefalt personlig verneutstyr. - Forbered stamløsningen for poly-L-lysin (PLL) (100 mg / ml) ved å tilsette 1 g PLL til 10 ml destillert vann og omrøre til det er oppløst. Forbered 500 μL aliquots av PLL lagerløsning. For å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 mg / ml, tilsett 500 μL PLL aliquot til 50 ml boratbuffer og virvle til den er oppløst, og steriliser løsningen ved filtrering (0,2 μm porestørrelse).
MERK: Denne løsningen er stabil og kan brukes i 6 måneder. - Forbered overflatene for belegg. Bruk 12 mm diameter deksler for immunostaining prosedyrer og glassbunn retter for studier som vil omfatte avbildning av levende nevroner. Hvis du bruker coverslips, autoklav og deretter plassere fem coverslips i hver tallerken (3,5 cm diameter).
MERK: Tykkelsen på dekselet påvirker kvaliteten og intensiteten til signalet til bildene som er anskaffet. De fleste mikroskopmål er designet for # 1.5 coverslips. Velg de riktige dekslene i henhold til bildeoppsettet og teknikkene. - Under en hette, tilsett 1,5 ml PLL-løsning til hver tallerken (glassbunnskål eller 3,5 cm tallerken med fem deksler). Forsikre deg om at alle dekslene er nedsenket og lagret på RT i 24 timer.
- 2 dager før disseksjon, aspirer PLL-løsningen og vask med sterilt endotoksinfritt vann, og sørg for at dekslene er nedsenket. Hold vann i oppvasken og oppbevar på RT i 24 timer.
- 1 dag før disseksjon, aspirer vannet og erstatt det med NB + B27 kulturmedier (se nedenfor), og legg oppvasken i en inkubator ved 37 ° C i 24 timer.
- Forbered boratbufferen ved å tilsette 2,38 g borsyre og 1,27 g boraks til 500 ml destillert vann og omrøring i 15 minutter til det er oppløst. Under en hette, steriliser bufferløsningen ved å filtrere (0,2 μm porestørrelse), etikett og oppbevar ved romtemperatur (RT).
- Fremstilling av kulturmedier og lagerløsning (1 dag før disseksjon)
- Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): Til 500 ml DMEM høy glukose (4,5 g / L) uten L-glutamin og fenol rød, tilsett 50 ml hesteserum, 50 ml føtalt bovint serum (FBS), 10 ml L-glutamin (200 mM), 10 ml natriumpyruvat (100 mM), 10 ml penicillin-streptomycin (10 000 U / ml). Filter (0,2 μm porestørrelse) og oppbevar i 5 ml aliquots ved 4 oC med tett lukket hette.
MERK: Denne løsningen er stabil og kan brukes i 1 måned. - Neurobasal (NB) medium supplert med B27 (NB + B27): Til 50 ml NB medium uten fenolrød, tilsett 1 ml B27 supplement.
- Dvalemodus-E medium supplert med B27 (Dvalemodus + B27): Til 50 ml dvalemodus-E medium, tilsett 1 ml B27 supplement.
- Ekstracellulær fysiologisk løsning (EPS): Til 1 liter sterilt vann, tilsett følgende ved de angitte sluttkonsentrasjonene: NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), HEPES (10 mM), glukose (20 mM) og CaCl 2 (2 mM). Rør til oppløst og juster pH til 7,4 ved å legge til NaOH (0,5 M) eller HCl (0,5 M). Under hetten, steriliser ved filtrering (0,2 μm porestørrelse) og oppbevar ved 4 oC.
- Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): Til 500 ml DMEM høy glukose (4,5 g / L) uten L-glutamin og fenol rød, tilsett 50 ml hesteserum, 50 ml føtalt bovint serum (FBS), 10 ml L-glutamin (200 mM), 10 ml natriumpyruvat (100 mM), 10 ml penicillin-streptomycin (10 000 U / ml). Filter (0,2 μm porestørrelse) og oppbevar i 5 ml aliquots ved 4 oC med tett lukket hette.
- Utstyr og annet laboratoriemateriell (disseksjonsdagen)
- Sett et vannbad til 37 °C. Varm opp følgende aliquoter: 50 ml HBSS og 5 ml DMEM.
- Steriliser følgende verktøy ved å senke deg ned i et beger som inneholder absolutt etanol (figur 1B): tang, buede tang, saks, finbuede tang, fin-rett tang, kirurgisk saks, finvinklet tang og presisjonsfjærsaks.
MERK: For å beskytte verktøyene, plasser et mykt materiale (f.eks. vitenskapspresisjonsservietter) nederst på begeret. - Fyll to brett med is og legg følgende elementer.
- Isbrett 1 (figur 1C): Plasser kirurgiske verktøy i begeret med absolutt etanol, et beger med HBSS for skylling av kirurgiske verktøy, en 10 cm tallerken med HBSS for å plassere embryoene, en 6 cm tallerken med HBSS for å plassere embryoenes hoder og en 6 cm tallerken med dvalemodus + B27 for å plassere hjernen til embryoene.
- Isbrett 2: Legg en 1 ml aliquot trypsin 2,5% og en 3,5 cm tallerken med dvalemodus + B27 for den dissekerte hippocampus.
MERK: Tiden som trengs for denne prosedyren avhenger av etterforskerens erfaring og antall embryoer som skal dissekeres. Derfor må isen forbli frossen i den nødvendige tiden. Polystyrenbrett anbefales til dette formålet.
2. Disseksjon og såing (figur 1)
- Hippocampal isolasjon
MERK: Drektige rotter med embryoer ved E18 avlives umiddelbart før protokollen starter i samsvar med den lokale etiske komiteen ved Universitetet i Barcelona, i henhold til europeiske (2010/63/UE) forskrifter om bruk og stell av forsøksdyr. I denne protokollen ble innånding av karbondioksid (CO2) brukt som metode for eutanasi.- Disseker rotten på nivået av bukhinnen ved hjelp av tang og saks. Trekk ut livmoren med E18-embryoene og legg den i en 10 cm tallerken som er kjølt på is.
MERK: Det er viktig å unngå som fester seg til embryoene. Det anbefales å bruke store mengder 70% etanol for å sterilisere magen. Fra dette trinnet og fremover, arbeid inne i hetten på isbrett 1. - Åpne embryonale sekker og overfør embryoene til 10 cm parabolen med HBSS, og sørg for at embryoene er helt nedsenket.
- Fjern embryohodet med saks og legg det i 6 cm parabolen med HBSS. Gjenta denne prosessen med alle embryoene.
MERK: For å unngå kontaminering skal alt vev unntatt embryohodene kastes i en beholder med en skrukork. - Hold embryohodet med finbuede tang og pierce banene med et par fine rette tang, inn i en 45 ° vinkel, og slipp deretter de finbuede tangene.
MERK: Tangen må ikke gå gjennom hjernen, så det er viktig å opprettholde vinkelen når du går inn. - Disseker huden og skallen med operasjonssaksen, fra oksipitalbenet til frontbenet. Fjern hjernen med et par finbuede tang og legg den i 6 cm fatet med Dvalemodus + B27. Gjenta denne prosessen til alle hjernene er gjenopprettet.
- Skytten skiller telencefalonene med de fine rette tangene.
MERK: Fra dette trinnet og fremover utføres disseksjonen av hippocampus under et stereomikroskop. Det anbefales å bruke leddlamper slik at lyset lyser opp disseksjonsoverflaten fra sidene. Det anbefales også å bruke en svart bakgrunn, da dette gir mer kontrast, slik at du bedre kan skille hippocampus. - Forbered en 10 cm tallerken ved å plassere dråper dvalemodus + B27 på 1 cm avstander (f.eks. i en sirkel). Plasser en telencephalon per dråpe dvalemodus + B27 og visualiser gjennom dissekeringsomfanget (1,25x objektiv forstørrelse anbefales).
- Skrell meningene forsiktig og fjern thalamus for bedre å visualisere hippocampus.
- Disseker hippocampus med presisjonsfjærsaksen og legg den i 3,5 cm fatet med Dvalemodus + B27 i isbrett 2. Gjenta for hver telencephalon til alle hippocampi er samlet.
- Samle forsiktig alle hippocampiene med en Pasteur-pipette og overfør dem til et 50 ml rør.
MERK: Ta minimumsvolumet av dvalemodus + B27 når du samler hippocampi for ikke å fortynne trypsinet.
- Disseker rotten på nivået av bukhinnen ved hjelp av tang og saks. Trekk ut livmoren med E18-embryoene og legg den i en 10 cm tallerken som er kjølt på is.
- Cell dissosiasjon
- Enzymatisk dissosiasjon av hippocampus
- I 50 ml røret som inneholder hippocampi, tilsett 1 ml 2,5% trypsin og bring det til et 5 ml volum med HBSS. Inkuber i 15 minutter i vannbadet ved 37 °C.
- For å fortynne trypsinet, tilsett 10 ml forvarmet HBSS og inkuber i 5 minutter i vannbadet ved 37 °C.
- Overfør hippocampien som nå vises som en slimmasse til et 50 ml rør med en 1000 μL mikropipette, tilsett 6 ml forvarmet HBSS, og inkuber i 5 minutter i vannbadet ved 37 ° C.
- Mekanisk dissosiasjon av hippocampus
- Overfør massen til et 2 ml rør med konisk bunn, og ta minimalt volum. Tilsett 1 ml forvarmede DMEM-medier. Homogeniser pelleten med en mikropipette på 1000 μL ved å aspirere forsiktig opp og ned.
MERK: Det er viktig å unngå å generere bobler når du aspirerer, da bobler kan lyse cellene. - Gjenta opp og ned aspirasjonen med en forhåndstrukket glasspipette (10x-20x), med spissen i kontakt med den koniske bunnen av røret. Unngå å generere bobler. På slutten av dette trinnet må blandingen være gjennomsiktig.
- Når blandingen er homogent blandet slik at blandingen er gjennomsiktig, overfør blandingen til et rør som inneholder 4 ml DMEM-medier ved 37 ° C og homogeniser med en glasspipette ved pipettering opp og ned.
- Overfør massen til et 2 ml rør med konisk bunn, og ta minimalt volum. Tilsett 1 ml forvarmede DMEM-medier. Homogeniser pelleten med en mikropipette på 1000 μL ved å aspirere forsiktig opp og ned.
- Enzymatisk dissosiasjon av hippocampus
- Cell såing
- Tell cellene. Antall nevroner i løsningen kan telles i henhold til standard laboratorieprosedyrer.
MERK: I avbildningseksperimenter for antistoffdeteksjon og kalsiumaktivitet er en konsentrasjon på 50 000 celler per 3,5 cm tallerken optimal. - Hold cellene suspendert, trekk ut det beregnede volumet og tallerken i 3,5 cm retter som inneholder PLL-belagte deksler eller i PLL-belagte glassbunnretter.
- Fordel cellene jevnt på oppvasken ved å riste mykt i kryssede bevegelser (frem og tilbake, deretter side til side, gjenta etter behov) og plasser oppvasken i CO2 (5%) inkubatoren.
MERK: Det er viktig å bruke kryssede bevegelser for å unngå at cellene setter seg i periferien av parabolen. - Hver uke legger du til ca 1 ml NB + B27, slik at kulturen ikke tørker.
MERK: Etter 2 uker (14 dager in vitro [div]) er nevronene modne og uttrykker alle faktorer som skal brukes til eksperimentering. Det totale gjennomsnittlige antall nevroner oppnådd ved bruk av denne protokollen er ca. 2,5 x 106 nevroner som kommer fra et gjennomsnitt på 12 E18-embryoer per gravid rotte.
- Tell cellene. Antall nevroner i løsningen kan telles i henhold til standard laboratorieprosedyrer.
DEL 2: Bruk av hippocampale nevronkulturer for antistoffdeteksjon i nevronale celleoverflateproteiner
MERK: Denne delen av protokollen viser hvordan hippocampuskulturer brukes til å identifisere anti-NMDAR antistoffer i serum og / eller CSF hos pasienter med anti-NMDAR encefalitt. Fluorescerende immunostaining brukes til å visualisere reaktiviteten i de levende nevronene, men andre visualiseringsmetoder kan også brukes. En passende kontroll for dette eksperimentet vil være serum eller CSF fra et sunt individ. Ved bruk av menneskelige prøver, husk at godkjenning fra institusjonens etiske komité kan være nødvendig.
3. Levende fluorescerende immunostaining
- Bruk 14 div-celler som er dyrket på deksler (50 000 celler per 3,5 cm tallerken som inneholder fem deksler).
- Skyll dekslene på innsiden av panseret med NB forvarmet til 37 °C.
- Legg til prøven som i dette tilfellet inneholder anti-NMDAR-antistoffer (brukt som primært antistoff) fortynnet i NB-medier ved 1:200 for serum eller 1:2 for CSF og inkuberer 1 time ved 37 °C (inne i CO2 (5%) inkubatoren).
- Skyll forsiktig med PBS 3x ved RT.
- Tilsett fikseringsløsning (4% formaldehyd i PBS) og inkuber ved RT i 5 minutter.
FORSIKTIG: Ved håndtering av 4% formaldehyd, arbeid inne i hetten og bruk anbefalt personlig verneutstyr. - Vask 3x med PBS i 5 minutter hver.
- Tilsett sekundært antistoff Geit anti-Human AF488 ved 1:1000 fortynning og inkuber ved RT i 1 time.
MERK: Under inkubasjonen, beskytt mot lyseksponering ved å dekke med aluminiumsfolie. - Vask 3x med PBS i 5 minutter hver. Skyll med destillert vann
- Monter dekslene med et flytende monteringsmedium (f.eks. antifading monteringsmedier med DAPI; ca. 7 μL), aspirer eventuell gjenværende væske og skyll med destillert vann. Nevronene er nå klare for fluorescensavbildning.
FORSIKTIG: Ved håndtering av monteringsmedium, bruk anbefalt personlig verneutstyr.
DEL 3: Demonstrasjon av antistoffpatogene effekter ved bruk av kalsiumavbildning
MERK: Denne delen av protokollen demonstrerer hvordan man bestemmer om antistoffene hos pasienter har en funksjonell effekt på kulturene, noe som tyder på patogenitet. For å øke betydningen av effektene ble det benyttet en pool av spinalvæske fra åtte pasienter. Kalsiumaktiviteten i levende kulturer ble registrert ved kjemisk stimulering (NMDA + glycin) ved bruk av GECI-fluorescenskalsiumindikatoren (GCaMP5G). Disse studiene krever et omvendt fluorescensmikroskop med et cellekammer som kan opprettholde de nødvendige fysiologiske forholdene til nevronene.
4. Kalsiumavbildning
- Bruk 14-18 div celler som har blitt dyrket på coverslips (50 000 celler per 3,5 cm tallerken med fem coverslips)
- 1 uke før avbildning, tilsett virusvektoren pAAV2-CAG-GCaMP5G ved 2,5 x 1010 GC / ml til cellene og inkuber i 5-7 dager.
MERK: Denne kommersielt tilgjengelige, ferdigpakkede AAV serotype 2-vektoren overuttrykker genetisk kodet kalsiumindikator GCaMP5G under en CAG-promotor. - 1 dag før avbildning, legg til pasientprøven (i dette eksemplet et basseng med CSF fortynnet 1:25 i NB + B27) og inkuber i 24 timer. Filtrer alltid menneskelige prøver (0,2 μm porestørrelse) før bruk for å unngå kontaminering.
MERK: For disse studiene må kontroll-CSF fra friske personer kjøres parallelt. - På dagen for avbildning, klargjør bildeoppsettet og sett mikroskopcellekammeret til 37 ° C, fyll banen med destillert vann og fyll med 5% CO2 for å opprettholde cellefysiologiske forhold.
- I hetten vasker du cellene fra trinn 3 med 3 ml EPS forvarmet til 37 °C
- Dekk cellene med 2,45 ml EPS og overfør dem til mikroskopcellekammeret. Legg til NBQX (10 μM) for å blokkere AMPA- og KA-reseptorene for å visualisere utelukkende NMDA-reseptorresponsen.
- I det inverterte fluorescensmikroskopet utstyrt med en kvikksølvlampe og en FITC-filterkube, skaff deg en 2 min film med rammer registrert hver 100 ms (spontan aktivitet).
MERK: Et 20x NA 0,75 luftmål ble brukt, og bilder (512 x 512 piksler, 16-biters gråtoner) ble tatt hver 100 ms med et sCMOS-kamera. - Skaff deg den andre filmen på 4 min med bilder tatt opp hver 100 ms. Kort tid etter at oppkjøpet er startet, tilsett stimuleringsløsning (NMDA [100 μM] + Glycin [1 μM]) til parabolen.
MERK: Tilsetning av medier i parabolen vil generere turbulens som kan forstyrre bildeforholdene (fokus, fluorescensintensitet og / eller uspesifikt bakgrunnssignal). Ikke tilsett mer enn 50 μL oppløsning i den fylte 2,5 ml parabolen for å redusere sannsynligheten for slike endringer. - Ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (ImageJ ble brukt her), trekk ut fluorescenssignalet over tid, oppnådd ved stimulering, fra kulturene inkubert med pasienten og kontroller CSF-prøver.
MERK: GCaMP-probene, når de binder seg til frie kalsiumioner, gjennomgår en konformasjonsendring som får dem til å bli lysere. Derfor korrelerer økningen i fluorescensintensitet med kalsiumtilstrømning på grunn av neuronal depolarisering. - Bestem interesseområdene (ROI) som skal analyseres. Segmenter somas av nevroner manuelt og legg til avkastningen i ROI-lederen (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). Lagre avkastningen fra ROI Manager-menyen (Mer > Lagre).
- Angi målene (Analyser > Angi mål) og velg Middelgråverdi. Trekk ut den gjennomsnittlige fluorescensintensitetsprofilen fra celle somas ved å klikke Mer > Multi Measure, og lagre deretter tabellen generert som et .xls regneark.
- Utfør statistiske analyser for å sammenligne fluorescensen mellom grupper (pasientenes CSF vs. kontrollens CSF).
Representative Results
Etablering av dissosierte, føtale, gnagere hippocampale nevronkulturer
Protokollen som presenteres her er basert på de innflytelsesrike studiene om nervecelledyrking utført av Banker og Goslin15. Protokollen har blitt raffinert for å oppnå nevronkulturer med optimal morfologi, tetthet og renhet for å utføre neuronale overflateantistoffdeteksjonsstudier. Protokollen for disseksjon og såing er delt inn i tre deler (figur 1A). Den første delen, hippocampusisolasjonen, består av kirurgisk ekstraksjon av levende vev (figur 1A, venstre panel). Som figuren indikerer, er gravide Wistar-rotter med E18-embryoer det viktigste utgangsmaterialet for en vellykket kultur. Når hjernen er hentet fra E18-embryoene, utføres mikrokirurgi under et stereomikroskop. Med passende verktøy (figur 1B) og presis håndtering er det mulig å skille hippocampus fra resten av nervevevet. Disponeringen av vev i de spesifikke mediene er avbildet i figur 1C. Den andre delen av protokollen består av hippocampuscelledissosiasjonen. Det er delt inn i to trinn (figur 1A, midtpanel): enzymatisk dissosiasjon og mekanisk dissosiasjon av hippocampus, noe som resulterer i intakte, dissosierte, enkeltceller. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å oppnå cellekulturer uten celleaggregater, som representert i figur 2A-D. Den tredje delen av protokollen består av cellesåing (figur 1A, høyre panel). Denne delen av protokollen er avgjørende for å justere tettheten og homogeniteten til nevronkulturen i platen. Telling av cellene og såing av 50 000 nevroner i et område på en 3,5 cm tallerken gir en optimal tetthet for å utføre ikke bare eksperimenter for å bestemme tilstedeværelsen av antistoffer mot nevronale celleoverflateproteiner (figur 3), men også for å analysere patogeniteten til disse antistoffene med kalsiumavbildning (figur 4).
Figur 1: Visuell protokoll for primærkulturer av hippocampale nevroner. (A) Flytskjema som viser de tre delene av protokollen for fremstilling av dissosierte cellekulturer av hippocampale nevroner fra embryonale rotter ved E18. Protokollen er delt inn i 1. Hippocampal isolasjon, 2. Celledissosiasjon, og 3. Cell såing. (B) Valg av anbefalte verktøy for hippocampusisolasjon gruppert i tre kategorier: (1- Tang, 2- Buet tang, 3- Saks) for embryosamling, (4- Finbuet tang, 5- Fin-rett tang, 6- Kirurgi saks) for hjerneutvinning, og (7- Finvinklet tang, 8- Presisjon fjærsaks) for hippocampusisolasjon. (C) Skjematisk fremstilling av isbrett 1 med plater og medier som trengs for hippocampus-isolasjonen. Embryoer og hoder er plassert i HBSS, mens hjerner er plassert i dvalemodus medium + B27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Kulturer av hippocampale nevroner ved 18 div er modne, sammenkoblede og uttrykker strukturelle og funksjonelle proteiner.
I veksten og modningen av nevronkulturer kan to differensierte faser verdsettes: polarisasjonsfasen av nevronet (figur 2A, B) og fasen av dendritisk utvikling og konstruksjon av det synaptiske nettverket (figur 2C, D). Celler på 1 div er jevnt fordelt og har festet seg til platen, og utvikler en lamell rundt cellekroppen med mindre nevritter som begynner å strekke seg (figur 2A). Etter noen dager i kultur strekker nevrittene seg en kort avstand. Cellene viser en signifikant polarisasjon, men det er liten netto vekst (figur 2B). Etter dette stadiet er synaptogenese fremtredende, og nevronene begynner å koble sammen. Det nevrale nettverket fortsetter å vokse og blir mer komplekst (figur 2C). Ved 18 div er nevroner modne og sammenkoblede; det nevrale nettverket er bygget (figur 2D). Når de synaptiske spines er dannet og forbundet, er nevroner fullt polarisert og uttrykker alle funksjonelle og strukturelle proteiner. Av de mange proteinene uttrykt av modne dyrkede nevroner, er nevronreseptoren NMDA (figur 2E) og det synaptiske proteinet PSD95 (figur 2F) valgt her som representative markører. Videre er det mulig å selektivt visualisere aksoner ved å merke nevrofilament (NF) (figur 2G) og visualisere dendritter ved å målrette MAP2-proteinet (figur 2H).
Figur 2: Tidsforløp for modning av dissosierte cellekulturer av hippocampale nevroner. (AD) Fasekontrastbilder av hippocampale nevroner i løpet av de første 18 dagene av kulturen. (A) Nevroner ved 1 div ved festing til det PLL-belagte substratet. (B) Fremveksten av små neuritter i nevroner ved 5 div. (C) Nevroner ved 11 div har utviklet lange nevritter som forlenger og får aksonale egenskaper. (D) Nevroner ved 18 div er modne og har dannet et nevralt nettverk. Skalalinje (A-D) = 40 μm. (E-H) Representative fluorescerende bilder tatt ved konfokal laserskanningsmikroskopi ved hjelp av selektive markører for å vise modne nevroner ved 18 div. Nevronkulturer ble fikset og immunisert med antistoffer som selektivt farget for (E) nevronreseptor (NMDAR), (F) synaptisk markør (PSD95), (G) aksonal markør (nevrofilament, NF) og (H) dendritisk markør (MAP2). Skala bar (E-H) = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Antistoffer i pasientprøver reagerer med nevronale celleoverflateantigener
Prøvene (serum og CSF) oppnådd fra pasienter som har anti-NMDAR encefalitt inneholder autoantistoffer som gjenkjenner NMDAR tilstede på overflaten av nevroner. Inkubasjon av kulturene med pasientprøvene gir et intenst fluorescenssignal på celleoverflaten og dendritter (figur 3A,C). I motsetning til dette gir kontrollprøver ikke noe fluorescenssignal når de administreres til nevronkulturene (figur 3B, D). Disse funnene viser hvordan kulturene kan brukes til å skjerme pasientprøver for antistoffer og kan føre til identifisering av nye antistoffer som retter seg mot nevroncelleoverflaten.
CSF-prøve fra pasienten reduserer den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen i NMDA-induserte kulturer av hippocampale nevroner
For å evaluere effekten av pasientenes antistoffer på nevral aktivitet (etter 24 timers behandling), ble intracellulære kalsiumtransienter optisk overvåket fra de dyrkede nevronene i sanntid ved NMDA-mediert stimulering. Anvendelsen av NMDA genererer en økning i fluorescensintensiteten, som indikert av en endring i den intracellulære grønne fluorescensen (figur 4A og supplerende video 1). Nevroner behandlet med kontroll-CSF-prøven viste en høyere forskjell i fluorescensintensitet (56%) når stimulatoren ble brukt i forhold til cellene behandlet med pasientens CSF-prøve. Forskjellene i fluorescensintensitet ble målt, og NMDA-medierte stimuleringskurver fra dataene hentet fra cellenes soma ble sammenlignet (figur 4B, C). Stimuleringskurvene viser at det var intracellulær tilstrømning av kalsium i begge scenariene, men kulturene behandlet med pasientenes CSF (grå linje) viste lavere respons enn de kontrollbehandlede kulturene (svart linje). Disse resultatene viser at antistoffene som er tilstede i pasientens CSF reduserer den cellulære aktiviteten på grunn av samspillet mellom antistoffene og NMDAR, og dermed forårsaker en patogen effekt.
Figur 3: Pasientens antistoffer reagerer med overflaten av nevronkulturer . (A,E) Serum og CSF fra pasienter med anti-NMDAR encefalitt reagerer med celleoverflaten til levende rotte hippocampale nevroner, (B,F), mens serum og CSF fra kontrollpersoner ikke viser reaktivitet. Skala bar (A, B, E, F) = 20 μm. Høyere forstørrelsesbilde av en dendritt (63x) som viser det typiske overflatemønsteret for reaktivitet for (C,G) pasientens serum og CSF og (D,H) negativ for kontroller. Bilder ble tatt ved konfokal laserskanning mikroskopi. Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Pasientantistoffer reduserer kalsiumtilstrømningen i rottenevroner som uttrykker GCaMP5G. (A) Administrering av stimuleringsløsning (NMDA [100 μM] + Glycin [1 μM]) i kulturer av nevroner utløste kalsiumtilstrømning, som indikert ved økende intracellulær grønn fluorescens (stimuleringstopp), sammenlignet med bildet tatt før stimuleringen (pre-stimulering). Etter 120 s reduseres og stabiliseres fluorescensintensiteten (etter stimulering). Kulturer behandlet med pasientenes CSF viste en signifikant reduksjon (56 %) i NMDA-mediert kalsiumøkning sammenlignet med kontrollens CSF. Bilder ble tatt med fluorescensmikroskopi. Skala bar = 20 μm. (B) Et plott av et av de tre uavhengige eksperimentene som representerer fluorescensintensiteten over tid (180 s) for kulturene behandlet med kontrollens CSF (svart linje) og pasientens CSF (grå linje) ved NMDA-stimulering (blå pil). n(Controls' CSF) = 20 celler; n(Pasientenes CSF) = 28 celler. Data er representert som gjennomsnittlig ± SEM. (C) Boksplott viser median, 25. og 75. persentil. Whiskers angir minimums- og maksimumsverdiene. Signifikansvurdering ble utført ved toveis variansanalyse (ANOVA; p < 0,0001) og Mann-Whitney U-tester (p < 0,0001). En verdi på p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Video 1: Video som viser to hippocampale nevroner som uttrykker GCaMP5G side om side: nevron behandlet med kontrollens CSF (venstre) vs. nevron behandlet med pasientens CSF (høyre). Anvendelsen av NMDAR (stimulering) genererer en økning i intracellulær fluorescensintensitet i begge tilfeller, men med et betydelig høyere nivå i nevronet behandlet med kontrollens CSF over den som behandles med pasientens CSF. Bilder ble tatt med fluorescensmikroskopi og redigert med ImageJ som bruker oppslagstabellen (LUT) Fire. 1700 bilder (170 s); akselerert 5 ganger. Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Det voksende feltet av antistoffmediert autoimmunitet har åpnet et mulighetsvindu for identifisering av neuronale autoantistoffer som kan brukes til å forbedre diagnosen og behandlingen av pasienter. Kulturer av hippocampale nevroner er et viktig verktøy for antistoffidentifikasjon; Derfor er det viktig å utføre en standardisert protokoll for å oppnå pålitelige og reproduserbare resultater. De viktigste trinnene å vurdere, begrensninger og feilsøking, diskuteres her.
De kritiske trinnene i denne protokollen kan grupperes i tre kategorier avhengig av om de påvirker renheten, homogeniteten eller levedyktigheten til hippocampale nevroner.
Renhet - For å oppnå optimale primære cellekulturer, må etterforskeren være trygg, trent og i stand til å jobbe raskt, spesielt for å minimere disseksjonens tid. Selv om pyramidale nevroner er den viktigste celletypen, inneholder hippocampus en rekke interneuroner14. For å generere kulturer med minimale gliaceller, må hippocampus ekstraheres med minimalt omkringliggende vev. Bruken av en svart bakgrunn under disseksjonen bidrar til å identifisere grensene for hippocampus under stereomikroskopet. I tillegg bør det tas hensyn til at lavere celletettheter resulterer i mindre parakrin støtte og gjør det vanskeligere å opprettholde kulturen13. Så det er viktig å holde denne balansen i bakhodet. Dette er viktig i bildestudier som bruker et lavt antall celler (50 000 nevroner per 3,5 cm tallerken). For å kunne ha ekstra tid til hippocampusekstraksjonen, bør dvalemodus som bevarer vevet brukes17. Arbeid med tilstrekkelige kirurgiske verktøy er også viktig. Verktøy med høy presisjon er delikate, så reproduserbarheten av teknikken bør sikres ved å beskytte dem nøye.
Homogenitet - For å utvikle en kultur uten celleaggregater, har den mekaniske celledissosiasjonen blitt oppgradert ved å kombinere bruken av en forhåndstrukket glasspipetter med en standard pipette på 1000 μL.
levedyktighet - I denne protokollen ble det ikke tilsatt antibiotika fordi de påvirker nevronal spenning og endrer de elektrofysiologiske egenskapene til de dyrkede nevronene18. Derfor er forurensning svært sannsynlig hvis de høyeste standardene for sterilitet ikke opprettholdes. Temperatur er også en nøkkelfaktor. Å holde vevet kaldt under hippocampusisolasjonen reduserer stoffskiftet og reduserer celleforringelse. Vevet ble derfor holdt på is til celledissosiasjonsprosessen. Videre er det avgjørende å finne den riktige balansen under enzymatisk celledissosiasjon som disaggregerer cellene uten merket cellelyse. I denne protokollen er tidspunktet for inkubasjon med trypsin og de påfølgende vasketrinnene optimalisert for å oppnå individuelle celler med nok plass til å tillate opprettelsen av et passende nevronnettverk.
Kritiske trinn finnes også i fluorescerende levende immunostaining og kalsiumaktivitetsopptak fra nevronkulturene. For å utføre vellykket levende immunostaining for å bestemme tilstedeværelsen av antistoffer mot celleoverflateproteiner i pasientprøver, må man unngå permeabilisering av cellene som vil gi antistoffene tilgang til intracellulære proteiner. I tillegg, basert på titeren av antistoffene, må inkubasjonstiden og prøvefortynningen justeres tilsvarende (f.eks. kan svært høye titerantistoffer gi bakgrunnsfarging som gjør det vanskelig å tolke resultatene). Når man utfører patogenitetsvurderingen av autoantistoffene med kalsiumavbildning, må man bruke et medium som er optimalt for cellulære aktivitetsmålinger (f.eks. Mg2+ -undertrykkelse i kulturmediet er viktig for god ytelse). Videre, for fluorescensavbildning, bør medier med pH-indikatorer som fenolrødt unngås, da det introduserer et ikke-spesifikt bakgrunnssignal.
Det er to hovedbegrensninger ved bruk av hippocampale nevronkulturer. For det første, sammenlignet med stabile cellelinjer, må primærkulturer kontinuerlig genereres, og dette innebærer regelmessig bruk av forsøksdyr. Induserte pluripotente stamcellelinjer (iPSC) kan erstatte behovet for å bruke dyremodeller, men differensieringsprotokollene for iPSC er fortsatt ikke optimale. For det andre uttrykker nevroner avledet fra iPSC ikke hele spektra av overflateproteiner, og derfor, hvis det brukes, betyr ikke fraværet av reaktivitet nødvendigvis negativiteten til prøven19.
Det er tre metoder for å skjerme for tilstedeværelse av autoantistoffer i serum eller CSF hos pasienter mistenkt for å ha AE: vevsbasert analyse (TBA) ved bruk av rottehjernevev, cellebasert analyse (CBA) ved bruk av HEK-celler transfisert for å uttrykke nevronproteiner, og applikasjonen rapportert her ved bruk av levende kulturer av hippocampale nevroner19. Betydningen av den dyrkede hippocampale nevronmetoden ligger i dens evne til å differensiere reaktivitet med overflate- og intracellulære antigener som ikke lett kan skilles ved TBA. Dessuten er primære nevronkulturer, i motsetning til CBA i HEK-transfiserte celler, ikke begrenset av repertoaret av transfiserte proteiner. I tillegg kan dyrkede hippocampale nevroner brukes til å identifisere nye antistoffer og deres målantigener når de kombineres med immunoprecipitation og massespektrometri og derfor utvide spekteret av identifiserbare antistoffer. Til slutt tillater det vurdering av de patogene effektene av autoantistoffene ved hjelp av levende bildebehandlingsmetoder som kan overvåke endringer i cellulær aktivitet. Avslutningsvis gjør identifiseringen av nye autoantistoffer det mulig å starte spesifikke immunterapier for å forbedre pasientresultatene.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Merche Rivas, Maria Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alina Hirschmann og Angel Sandoval (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) og Mercedes Alba, Marija Radosevic, David Soto, Xavier Gasull, Mar Guasp og Lidia Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, University of Barcelona) for deres tekniske støtte og for å gi reagenser, og Josep Dalmau og Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Hospital Clínic, Universitetet i Barcelona) for deres kritiske gjennomgang av manuskriptet og mentorskapet. Denne studien ble finansiert av Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) og delfinansiert av EU, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa program for sentre for fremragende forskning i FoU (CEX2019-000910-S, P.L-A.); CERCA-programmet og Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); og Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, MC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
| 12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Beaker 100 mL | Pirex | - | |
| Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Curved forceps | FST | 11009-13 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
| Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | - | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
| Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
| Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
| FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
| Forceps | FST | 11000-12 | |
| Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
| Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
| Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | - | |
| Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | - | |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
| L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
| Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
| Microscope cell chamber | Custom-build | - | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
| NBQX | Tocris | 373 | |
| Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
| NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | - | |
| Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
| Polystyrene ice tray | - | - | re-used cap of a polysterene box |
| Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
| ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
| Scissors | FST | 14068-12 | |
| Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
| Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
| Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
- Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system. Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).
- Dalmau, J., Graus, F.
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti- N -methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Annals of Neurology. 61 (1), 25-36 (2007).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurology. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Annals of Neurology. 65, 424-434 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABAB receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurology. 9 (1), 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurology. 9 (8), 776-785 (2010).
- Sabater, L., et al. A novel NREM and REM parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies against IgLON5: a case series, pathological features, and characterization of the antigen. Lancet Neurology. 13 (6), 575-586 (2014).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. The Journal of Neuroscience. 30 (17), 5866-5875 (2010).
- Moscato, E. H., et al. Acute mechanisms underlying antibody effects in anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis. Annals of Neurology. 76 (1), 108-119 (2014).
- Planagumà, J., et al. Human N-methyl D-aspartate receptor antibodies alter memory and behaviour in mice. Brain. 138 (1), 94-109 (2015).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Benson, D. L., Watkins, F. H., Steward, O., Banker, G. Characterization of GABAergic neurons in hippocampal cell cultures. Journal of Neurocytology. 23 (5), 279-295 (1994).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. Journal of Visualized Experiments. (19), e895 (2008).
- Brewer, G. J., Price, P. J. Viable cultured neurons in ambient carbon dioxide and hibernation storage for a month. Neuroreport. 7 (9), 1509-1512 (1996).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iranian Biomedical Journal. 17 (2), 101-106 (2013).
- Ricken, G., et al. Detection methods for autoantibodies in suspected autoimmune encephalitis. Frontiers in Neurology. 9, 841 (2018).
