Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos del agua y la caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos (ARG). El uso de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos (análisis metagenómico) proporciona información completa sobre la diversidad bacteriana total y el conjunto total de diferentes ARG presentes en aguas dulces de Mumbai, India.

Resumen

El desarrollo y la propagación de la resistencia a los antibióticos (RA) a través de la microbiota asociada con cuerpos de agua dulce es un importante problema de salud mundial. En el presente estudio, se recolectaron muestras de agua dulce y se analizaron con respecto a la diversidad bacteriana total y los genes AR (ARG) utilizando técnicas convencionales basadas en cultivos y un enfoque metagenómico independiente del cultivo de alto rendimiento. Este artículo presenta un protocolo sistemático para la enumeración de las bacterias cultivables totales y resistentes a antibióticos a partir de muestras de agua dulce y la determinación de la resistencia fenotípica y genotípica en los aislados cultivables. Además, informamos el uso de un análisis metagenómico completo del ADN metagenómico total extraído de la muestra de agua dulce para la identificación de la diversidad bacteriana general, incluidas las bacterias no cultivables, y la identificación del grupo total de diferentes ARG (resistoma) en el cuerpo de agua. Siguiendo estos protocolos detallados, observamos una alta carga de bacterias resistentes a los antibióticos en el rango de 9.6 × 10 5-1.2 × 10⁹ UFC/mL. La mayoría de los aislamientos fueron resistentes a los múltiples antibióticos probados, incluyendo cefotaxima, ampicilina, levofloxacina, cloranfenicol, ceftriaxona, gentamicina, neomicina, trimetoprima y ciprofloxacina, con índices de resistencia a antibióticos múltiples (MAR) de ≥0,2, lo que indica altos niveles de resistencia en los aislados. La secuenciación del ARNr 16S identificó patógenos humanos potenciales, como Klebsiella pneumoniae, y bacterias oportunistas, como Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. y Aeromonas spp. La caracterización molecular de los aislados mostró la presencia de varios ARGs, como blaTEM, blaCTX-M (β-lactámicos), aadA, aac (6')-Ib (aminoglucósidos) y dfr1 (trimetoprimas), lo que también fue confirmado por todo el análisis metagenómico de ADN. También se detectó una alta prevalencia de otros ARG que codifican para bombas de eflujo de antibióticos-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamasas-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa catB10 y el gen de resistencia a la rifampicina rphB-. Con la ayuda de los protocolos discutidos en este estudio, confirmamos la presencia de bacterias SAM transmitidas por el agua con diversos rasgos fenotípicos y genotípicos de AR. Por lo tanto, el análisis de ADN metagenómico completo se puede utilizar como una técnica complementaria a las técnicas convencionales basadas en cultivos para determinar el estado general de AR de un cuerpo de agua.

Introducción

La resistencia a los antimicrobianos (RAM) se ha identificado como uno de los problemas mundiales más acuciantes. La rápida evolución de la RAM y su propagación mundial son una de las mayores amenazas para la salud humana y la economía mundial en términos de los costos de salud asociados con ella¹. El uso excesivo y el mal uso de antibióticos han llevado a un aumento en AR. Esto ha sido destacado por la pandemia de COVID-19, durante la cual el tratamiento de infecciones secundarias asociadas, en muchos casos, se vio enormemente comprometido debido a la RAM en los pacientes afectados². Además del uso directo / mal uso de ....

Protocolo

1. Recogida y procesamiento de muestras

1. Recogida de muestras
   1. Recoja el volumen apropiado de la muestra de agua en recipientes de muestras estériles, asegurándose de que no se llenen más de 3/4 del recipiente.
   2. Transportar las muestras al laboratorio en condiciones asépticas tan pronto como sea posible después de la recolección y procesarlas inmediatamente.
2. Procesamiento de muestras
   1. Filtrar asépticamente la muestra de agua a través de un paño de muselina estéril para eliminar cualquier partícula.
   2. Llevar a cabo diluciones seriadas apropiadas del agua filtrada para su posterior análisis.<....

Resultados

Carga bacteriana total y recuento de bacterias resistentes a los antibióticos (AR)
La enumeración de la carga bacteriana total se llevó a cabo mediante la difusión de diluciones de 10⁻⁴ a 10⁻⁶ veces de las muestras de agua en agar R2A, medio modificado. Para la enumeración del recuento de bacterias AR, se distribuyeron diluciones de 10-3 a ^10-6 veces en placas de medios que contenían antibióticos (Figura 3). Los recuentos totale.......

Discusión

La recolección y el procesamiento de la muestra juegan un papel importante y pueden afectar los resultados y la interpretación del estudio. Por lo tanto, para descartar la variabilidad en las muestras, es importante llevar a cabo el muestreo en múltiples ubicaciones de la masa de agua dulce que se está estudiando. Mantener condiciones ambientales asépticas adecuadas al manipular dichas muestras puede prevenir la contaminación. Además, para evitar cambios en la composición bacteriana que puedan influir en la calidad y can.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Escalera de ADN de 100 pb	Himedia	MBT049-50LN	Para la estimación del tamaño de los amplicones
2x PCR Taq mastermix	HiMedia	MBT061-50R	Para hacer la mezcla de reacción PCR
37 ° C Incubadora	GS-192, Gayatri Scientific	NA	Para la incubación de bacterias
6x Tampón de carga de gel	HiMedia	ML015-1ML	Colorante de carga y seguimiento que ayuda a pesar la muestra de ADN y a seguir el progreso de la electroforesis
Polvo de agarosa	Himedia	MB229-50G	Para la resolución de amplicones durante la electroforesis en gel de agarosa (AGE)
Disco antibiótico de ampicilina	HiMedia	SD002	Para la realización
AST Autoclave	Equitron	NA	Necesario para la esterilización de medios, placas de vidrio, tubos de ensayo, etc
Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies	NA	Para comprobar la calidad y cantidad de la biblioteca amplificada
Bisafety B2 Armario	IMSET IMSET	BSC-Clase II Tipo B2	Se utiliza para trabajos microbiológicos como el cultivo de bacterias, AST, etc.
Disco antibiótico de cefotaxima	HiMedia	SD295E-5VL	Para realizar AST
Polvo de antibiótico de cefotaxima	HiMedia	TC352-5G	Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos Disco de
antibiótico de ceftriaxona	HiMedia	SD065	Para realizar
centrífuga AST Minispin	Eppendorf	Minispin Plus-5453	Se utiliza para granular los restos durante la preparación del ADN crudo
Disco antibiótico de cloranfenicol	HiMedia	SD006-5x50DS	Para realizar AST
Disco antibiótico de ciprofloxacina	HiMedia	SD060-5x50DS	Para realizar AST
Ciprofloxacina antibiótico en polvo	HiMedia	TC447-5G	Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de antibióticos resistentes bacterias
Colorímetro	Quest	NA	Para comprobar el diámetro exterior de las suspensiones de cultivo
Base de datos			anotación funcional de ARG; https://card.mcmaster.ca/
Incubadora agitadora de enfriamiento	BTL41 Allied Scientific	NA	Para la incubación de placas de medios para el cultivo de bacterias
Congelador (-40 ° C)	Haier	DW40L, Haier Biomedicals	Para el almacenamiento de existencias de glicerol Kit de preparación de bibliotecas de
ADN	NEB Next Ultra Kit de preparación de bibliotecas de ADN para Illumina	NA	Preparación de bibliotecas de secuenciación de extremos emparejados
EDTA	HiMedia	GRM1195-100G	Para la preparación de tampones de funcionamiento de gel para electroforesis en gel de agarosa (AGE)Aparato de
electroforesis	TechResource	Bandeja	de fundición en gel de 15 cmPara hacer el gel de agarosa   y la realización de electroforesis
Electroforesis Batería de energía con electrodos	Genei	NA	Para el funcionamiento del AGE
Disco antibiótico de eritromicina	HiMedia	SD222-5VL	Para realizar AST
Antibiótico de eritromicina en polvo	HiMedia	CMS528-1G	Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos
Antibiotico de eritromicina en polvo	HiMedia	TC024-5G	Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de antibióticos resistentes bacterias
Escherichia coli ATCC 25922	HiMedia	0335X-1	Se utiliza como control mientras se realiza AST
Bromuro de etidio	HiMedia	MB071-1G	Agente de intercalación y visualización de ADN después de la electroforesis bajo Gel Sistema de documentación
Fluorómetro	Qubit 2.0	NA	Para determinar la concentración de ADN metagenómico extraído
Sistema de documentación en gel	BioRad		Se utiliza para visualizar amplicones de PCR después de la electroforesis
Disco antibiótico de gentamicina	HiMedia	SD170-5x50DS	Para realizar AST
Ácido Acético Glacial	HiMedia	AS119-500ML	Para la preparación de Tampón de funcionamiento de gel para Electroforesis de gel de agarosa (AGE)
Glicerol	HiMedia	GRM1027-500ML	Para hacer caldos de glicerol
Disco	de antibiótico ImipenemHiMedia	SD073	Para realizar
AST Kaiju Database	NA	NA Para	clasificación taxonómica de lecturas; https://kaiju.binf.ku.dk/
Disco de antibiótico de kanamicina	HiMedia	SD017-5x50DS	Para realizar AST
Antibiótico de kanamicina en polvo	HiMedia	MB105-5G	Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos
Disco antibiótico de levofloxacino	HiMedia	SD216-5VL	Para realizar
el caldo AST Luria Bertani	Himedia	M1245-500G	Para el enriquecimiento de cultivos
Normas McFarland	Himedia	R092-1No	Para comparar la densidad de la suspensión de cultivo
Biología molecular agua	HiMedia	TCL018-500ML	Para hacer mezcla
de reacción PCRAgar Mueller-Hinton (MHA)	HiMedia	M173-500G	Para realizar pruebas de susceptibilidad a los antibiotc (AST)
Disco antibiótico de neomicina	HiMedia	SD731-5x50DS	Para realizar AST
PCR Gradient Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz	Se utiliza para realizar PCR para la amplificación de la región de ARNr 16S y varios genes de resistencia a antibióticos
Imprimaciones	Xcelris	NA	para amplificación de PCR
Agar R2A, Modificado	HiMedia	M1743	Para la preparación de placas de medios para el aislamiento de la carga bacteriana total y resistente a los antibióticos (AR)
Generación de andamios	CLC Genomics Workbench 6.0	NA	Para la generación de andamios
Secuenciador	Plataforma Illumina (2 x 150 bp química)	NA	Secuenciación de biblioteca amplificada
Cloruro de sodio	HiMedia	TC046-500G	Para la preparación de solución salina al 0,85% para diluir en serie la muestra de agua
Kit de aislamiento de ADN en el suelo	Xcelgen	NA	Para la extracción de ADN metagenómico completo de la muestra de agua filtrada
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213	HiMedia	0365P	Se utiliza como control mientras se realiza
clasificación taxonómica	Herramienta ioinformática Kaiju	NA	Para la clasificación de lecturas en diferentes grupos taxonómicos desde el nivel de filo hasta el nivel de género
La Base de Datos Integral de Resistencia a los Antibióticos (CARD)	NA	NA	Para la anotación funcional de ARGs Disco de
antibiótico Tigeciclina	HiMedia	SD278	Para realizar AST
Disco antibiótico Trimethoprim	HiMedia	SD039-5x50DS	Para realizar AST
Tris base	HiMedia	TC072-500G	Para la preparación de Gel tampón de ejecución para Agarose Gel Electroforesis (AGE)
Vancomicina antibiótico en polvo	HiMedia	CMS217	Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos
Balanza de pesaje	Mettler Toledo	ME204 Mettler Toledo Se	utiliza para el pesaje de medios en polvo, reactivos en polvo, etc.
NA - No aplicable

de . la completa de resistencia a antibióticos (CARD) la la AST