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Artículo de método

Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos

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DOI:

10.3791/63934

⸱

3 de marzo de 2023

 , 
1Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos del agua y la caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos (ARG). El uso de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos (análisis metagenómico) proporciona información completa sobre la diversidad bacteriana total y el conjunto total de diferentes ARG presentes en aguas dulces de Mumbai, India.

Resumen

El desarrollo y la propagación de la resistencia a los antibióticos (RA) a través de la microbiota asociada con cuerpos de agua dulce es un importante problema de salud mundial. En el presente estudio, se recolectaron muestras de agua dulce y se analizaron con respecto a la diversidad bacteriana total y los genes AR (ARG) utilizando técnicas convencionales basadas en cultivos y un enfoque metagenómico independiente del cultivo de alto rendimiento. Este artículo presenta un protocolo sistemático para la enumeración de las bacterias cultivables totales y resistentes a antibióticos a partir de muestras de agua dulce y la determinación de la resistencia fenotípica y genotípica en los aislados cultivables. Además, informamos el uso de un análisis metagenómico completo del ADN metagenómico total extraído de la muestra de agua dulce para la identificación de la diversidad bacteriana general, incluidas las bacterias no cultivables, y la identificación del grupo total de diferentes ARG (resistoma) en el cuerpo de agua. Siguiendo estos protocolos detallados, observamos una alta carga de bacterias resistentes a los antibióticos en el rango de 9.6 × 10 5-1.2 × 109 UFC/mL. La mayoría de los aislamientos fueron resistentes a los múltiples antibióticos probados, incluyendo cefotaxima, ampicilina, levofloxacina, cloranfenicol, ceftriaxona, gentamicina, neomicina, trimetoprima y ciprofloxacina, con índices de resistencia a antibióticos múltiples (MAR) de ≥0,2, lo que indica altos niveles de resistencia en los aislados. La secuenciación del ARNr 16S identificó patógenos humanos potenciales, como Klebsiella pneumoniae, y bacterias oportunistas, como Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. y Aeromonas spp. La caracterización molecular de los aislados mostró la presencia de varios ARGs, como blaTEM, blaCTX-M (β-lactámicos), aadA, aac (6')-Ib (aminoglucósidos) y dfr1 (trimetoprimas), lo que también fue confirmado por todo el análisis metagenómico de ADN. También se detectó una alta prevalencia de otros ARG que codifican para bombas de eflujo de antibióticos-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamasas-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa catB10 y el gen de resistencia a la rifampicina rphB-. Con la ayuda de los protocolos discutidos en este estudio, confirmamos la presencia de bacterias SAM transmitidas por el agua con diversos rasgos fenotípicos y genotípicos de AR. Por lo tanto, el análisis de ADN metagenómico completo se puede utilizar como una técnica complementaria a las técnicas convencionales basadas en cultivos para determinar el estado general de AR de un cuerpo de agua.

Introducción

La resistencia a los antimicrobianos (RAM) se ha identificado como uno de los problemas mundiales más acuciantes. La rápida evolución de la RAM y su propagación mundial son una de las mayores amenazas para la salud humana y la economía mundial en términos de los costos de salud asociados con ella1. El uso excesivo y el mal uso de antibióticos han llevado a un aumento en AR. Esto ha sido destacado por la pandemia de COVID-19, durante la cual el tratamiento de infecciones secundarias asociadas, en muchos casos, se vio enormemente comprometido debido a la RAM en los pacientes afectados2. Además del uso directo / mal uso de antibióticos por parte de los seres humanos, el uso excesivo y el mal uso de antibióticos en la agricultura y la ganadería y su descarga inadecuada en el medio ambiente, incluidas las masas de agua, son una preocupación importante3. El aumento de nuevos rasgos de resistencia y resistencia a múltiples fármacos en bacterias resalta urgentemente la necesidad de una mejor comprensión de los factores que conducen al desarrollo de AR y su diseminación. Múltiples bacterias resistentes a los antibióticos, que a menudo portan múltiples genes AR (ARG) en elementos genéticos móviles como los plásmidos, pueden transferir estos genes de resistencia a microorganismos no resistentes, incluidos los patógenos humanos potenciales, lo que lleva a la aparición de superbacterias que son intratables incluso con antibióticos de último recurso4. Estas múltiples bacterias resistentes a los antibióticos, si están presentes en los ecosistemas acuáticos, pueden ingresar directamente al intestino humano a través del consumo de alimentos contaminados a base de agua como peces, cangrejos y moluscos. Estudios previos han demostrado que la propagación de bacterias AR en sistemas de agua naturales también puede llegar a otros suministros de agua, incluida el agua potable, y, por lo tanto, puede ingresar a la cadena alimentaria humana 5,6,7.

El objetivo del presente estudio es proporcionar un protocolo integral utilizando una combinación de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos (análisis metagenómico completo) para obtener información completa sobre la diversidad bacteriana total y el conjunto total de diferentes ARG presentes en un cuerpo de agua en Mumbai, India. Convencionalmente, se han utilizado técnicas basadas en el cultivo para estudiar la diversidad bacteriana en cuerpos de agua. Como los microorganismos cultivables constituyen solo un pequeño porcentaje de la microbiota total en cualquier nicho, para tener una mejor comprensión del estado general de la diversidad bacteriana y los diversos rasgos resistentes que prevalecen en cualquier muestra, se deben utilizar varias técnicas basadas en el cultivo e independientes del cultivo en conjunto. Una de esas técnicas robustas y confiables independientes del cultivo es el análisis de ADN metagenómico completo. Este método de alto rendimiento ha sido utilizado con éxito en diversos estudios sobre diversidad bacteriana o anotaciones funcionales de varios ARG 8,9. Esta técnica utiliza el metagenoma (el material genético total en una muestra) como material de partida para varios análisis y, por lo tanto, es independiente del cultivo. Los protocolos del presente estudio se pueden utilizar para el análisis de ADN metagenómico completo para obtener información sobre la diversidad bacteriana total y varios ARG (resistoma) en muestras de agua.

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Protocolo

1. Recogida y procesamiento de muestras

  1. Recogida de muestras
    1. Recoja el volumen apropiado de la muestra de agua en recipientes de muestras estériles, asegurándose de que no se llenen más de 3/4 del recipiente.
    2. Transportar las muestras al laboratorio en condiciones asépticas tan pronto como sea posible después de la recolección y procesarlas inmediatamente.
  2. Procesamiento de muestras
    1. Filtrar asépticamente la muestra de agua a través de un paño de muselina estéril para eliminar cualquier partícula.
    2. Llevar a cabo diluciones seriadas apropiadas del agua filtrada para su posterior análisis.

2. Estimación de la carga bacteriana total y del recuento de bacterias resistentes a los antibióticos

  1. Determinación de la carga bacteriana total
    1. Suspender 18,12 g de agar R2A, polvo modificado en 1.000 ml de agua doble destilada, y disolver la mezcla por calentamiento. Autoclave la mezcla disuelta a 121 °C, 15 psi durante 20 min. Prepare agar R2A, placas modificadas vertiendo la cantidad apropiada de la mezcla esterilizada en autoclave en placas de Petri estériles (por ejemplo, agregue aproximadamente 20 ml de medio estéril esterilizado en autoclave a una placa de Petri estéril de 90 mm).
    2. Distribuir uniformemente 100 μL de las diluciones apropiadas de la muestra de agua filtrada en el agar R2A, placa modificada una vez que el medio se solidifique. Realice el experimento por duplicado.
    3. Incubar todas las placas anteriores a 35-37 °C durante 48 h (variar la temperatura y el tiempo de incubación dependiendo del medio utilizado para el aislamiento).
    4. Expresar la carga bacteriana total en términos de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) utilizando la ecuación (1):
      figure-protocol-1(1)
  2. Determinación del recuento bacteriano de AR
    1. Siga los pasos 2.1.1-2.1.4. Sin embargo, en lugar de agar R2A, las placas modificadas, use agar R2A, placas modificadas complementadas individualmente con cinco antibióticos diferentes, a saber, cefotaxima (3 μg / ml), ciprofloxacina (0.5 μg / ml), eritromicina (20 μg / ml), kanamicina (15 μg / ml) y vancomicina (3 μg / ml).
    2. Añadir los antibióticos por separado en tubos que contengan 20 ml de agar R2A fundido estéril, modificado (con la temperatura del agar R2A fundido, modificado a ≤40 °C) para alcanzar la concentración final de antibiótico como se menciona en el paso 2.2.1.
    3. Agite para mezclar uniformemente y vierta en placas de Petri estériles antes de que el agar se solidifique. Realice el experimento por duplicado.
    4. Incubar todas las placas anteriores a 35-37 °C durante 48 h (si se utiliza un medio diferente, la temperatura y el tiempo de incubación pueden variar).
    5. Para el control de calidad y la comprobación de la eficacia de los antibióticos, esparcir 100 μL de suspensiones bacterianas de las cepas de Agar R2A de Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 29213 en sus respectivas placas modificadas de Agar R2A que contienen antibióticos (asegúrese de que la densidad del cultivo fresco utilizado para la inoculación sea OD = 0,5 a 600 nm).
    6. Determinar el recuento bacteriano resistente a los antibióticos en términos de UFC/ml como se describe en el paso 2.1.4.
  3. Existencias de glicerol de las cepas aisladas
    1. Seleccionar colonias de AR morfológicamente distintas.
    2. Suspender una sola colonia aislada en 2 ml de caldo estéril de Luria-Bertani que contenga el antibiótico respectivo (por ejemplo, si se seleccionó una colonia de una placa que contiene cefotaxima, inocular la colonia del paso 2.3.1 en caldo estéril de Luria-Bertani que contenga cefotaxima en su concentración respectiva).
    3. Incubar los tubos inoculados a 37 °C a 80 rpm hasta que el OD600 alcance 0,5.
    4. Preparar las existencias de glicerol de los aislados mezclando 750 μL de la suspensión de cultivo del paso 2.3.3 en 250 μL de glicerol estéril al 100% en condiciones asépticas.
    5. Almacenar las existencias de glicerol a -80 °C hasta un análisis adicional.
      NOTA: Para la reactivación de los cultivos de las reservas de glicerol, descongelar las reservas de glicerol a 4 °C. Inocular un bucle de este caldo en 2 ml de caldo estéril Luria-Bertani que contiene el antibiótico respectivo y dejar crecer.

3. Identificación de bacterias cultivables mediante secuenciación del gen 16S rRNA

  1. Preparación de la plantilla de ADN a partir de los aislados para PCR
    NOTA: El protocolo descrito para la preparación de la plantilla de ADN para PCR para el aislamiento de ADN crudo de la bacteria es dado por Carlson et al.10.
    1. Usando un palillo de dientes estéril, tome una colonia única, aislada y pura del aislado que crece en una placa de Petri. Suspender la colonia bacteriana en 100 μL de agua estéril doble destilada en un tubo de microcentrífuga estéril y hervir durante 10 min.
    2. Centrifugar la suspensión a 10.000 × g durante 2 minutos para granular los residuos y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril nuevo para su uso como plantilla de ADN crudo.
  2. Amplificación por PCR dirigida de la región V3 del gen 16S rRNA y secuenciación
    1. Preparar 40 μL de la mezcla de reacción en un tubo de PCR para la amplificación por PCR, como se menciona en la Tabla 1.
      NOTA: La preparación de ADN debe llevarse a cabo en un bloque de hielo minimizando la posibilidad de contaminación (use guantes mientras manipula los reactivos y limpie la superficie de trabajo a fondo con etanol al 70%).
    2. Coloque el tubo en el bloque térmico y ejecute el programa apropiado en el termociclador de PCR. Consulte la Tabla 2 para las condiciones estandarizadas de ciclo de PCR y la información del manual para la amplificación de las regiones V3 de los genes 16S rRNA.
    3. Para resolver los amplicones y la visualización, realice electroforesis en gel de agarosa (AGE). Mezclar 10 μL del producto de PCR amplificado y 2 μL de tampón de carga de gel 6x (Tabla 3), y cargar esta mezcla en pocillos en gel de agarosa al 1,5% (disolver 1,5 g de polvo de agarosa en 100 ml de 1x tampón TAE [Tabla 3]) que contiene 5 μL de bromuro de etidio (EtBr) a una concentración final de 0,5 μg/ml de EtBr en 100 ml del gel de agarosa.
      PRECAUCIÓN: EtBr es un potente carcinógeno. Se deben usar guantes en todo momento mientras se manipula EtBr y geles que contengan EtBr.
    4. Agregue una escalera de ADN para la estimación del tamaño de los amplicones.
    5. Realice la electroforesis del gel en un tampón de tanque TAE a 80-100 V.
    6. Una vez que el tinte de seguimiento ejecute 3/4 del gel, detenga la electroforesis y visualice las bandas de amplicón bajo un transiluminador UV.
    7. Utilice el producto de PCR (amplicón) para la secuenciación del gen 16S rRNA para identificar el aislado.
    8. Cuantificar el amplicón sometiéndolo a análisis espectrofotométrico usando la ecuación (2).
      figure-protocol-2(2)
    9. Para verificar la pureza del ADN, calcule la proporción de A260 / A280.
      NOTA: Idealmente, este número debe estar por encima de 1.5 y, preferiblemente, entre 1.8 y 2.0.
    10. Para identificar los aislamientos, compare las secuencias que se obtienen con las bases de datos de secuencias utilizando una herramienta de búsqueda de alineación adecuada.

4. Detección de resistencia a antibióticos en los aislados mediante pruebas de sensibilidad a antibióticos

NOTA: Este protocolo describe el método para la prueba de susceptibilidad a los antibióticos (AST) por difusión de disco. Se utilizaron los siguientes discos antibióticos: cefotaxima (5 μg), ampicilina (10 μg), levofloxacino (5 μg), cloranfenicol (30 μg), tigeciclina (15 μg), ceftriaxona (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicina (10 μg), neomicina (10 μg), trimetoprima (5 μg) y ciprofloxacino (5 μg).

  1. Preparación del inóculo para el AST
    1. Inocular asépticamente una colonia de RA única, aislada y purificada utilizando un asa estéril en 2 ml de un medio estéril no selectivo, como el caldo Luria-Bertani (sin ningún antibiótico), e incubar a 37 °C a 80 rpm durante la noche.
    2. Resuspender tomando 100-150 μL del cultivo cultivado durante la noche (aproximadamente, OD 600 = 1.8-2.0) en 2 ml de medio de caldo fresco no selectivo Luria-Bertani e incubar durante 2-4 h (hasta que el OD600 alcance 0.4-0.5).
    3. Diluir esta suspensión de cultivo recién cultivada utilizando solución salina estéril al 0,85% de tal manera que la densidad del cultivo sea igual a 0,5 McFarland estándar (aproximadamente, OD600 = 0,1), que corresponde aproximadamente a 1-2 × 108 células/ml.
    4. Mezcle suavemente la suspensión bacteriana para una distribución celular uniforme.
    5. Use la suspensión anterior dentro de los 15 minutos posteriores a la dilución.
  2. Inoculación de las placas de agar
    1. Prepare placas de agar Mueller-Hinton (MHA) para realizar el AST mezclando 38 g de MHA en 1,000 ml de agua doble destilada y disuelva la mezcla calentando. Autoclave la mezcla disuelta a 121 °C, 15 psi durante 15 min.
    2. Asegúrese de que la profundidad de MHA en las placas sea de 4 mm (25 ml de medio por placa).
    3. Simultáneamente, retire los discos antibióticos del congelador y caliéntelos a temperatura ambiente.
      NOTA: Los discos antibióticos deben descongelarse gradualmente descongelándolos inicialmente a 4 °C y posteriormente a temperatura ambiente para reducir cualquier peligro potencial de condensación en los discos, que posteriormente puede afectar a la zona de inhibición (ZOI).
    4. En condiciones asépticas, sumergir un hisopo de algodón estéril en el inóculo preparado en el paso 4.1 y eliminar el exceso de suspensión para evitar la sobreinoculación de las placas.
    5. Extienda el cultivo uniformemente en las placas, comenzando desde la parte superior de la placa MHA y yendo y viniendo de borde a borde. Gire la placa 60° mientras frota.
  3. Aplicación de los discos antibióticos
    1. Con la ayuda de fórceps esterilizados por llama, transfiera asépticamente los discos antibióticos a las placas MHA inoculadas y presione los discos suavemente para asegurar un contacto nivelado completo con el agar.
      NOTA: Este procedimiento debe realizarse dentro de los 15 minutos posteriores a la inoculación del cultivo en las placas.
    2. Coloque el número adecuado de discos antibióticos en la placa de agar teniendo en cuenta el organismo, el antibiótico utilizado y el tamaño de la placa para evitar la superposición de las zonas de inhibición.
      NOTA: Se pueden acomodar de cuatro a cinco discos en una placa circular de 90 mm.
  4. Incubación de las placas
    1. Dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación de los discos antibióticos, invertir las placas e incubar a 37 °C durante la noche.
  5. Interpretación de los resultados
    1. Mida el diámetro ZOI en milímetros (mm) e infórmelo de acuerdo con los valores de punto de ruptura dados por EUCAST11. Véanse los dos ejemplos que figuran a continuación.
      1. El punto de ruptura del diámetro de la zona (mm) para un disco antibiótico ciprofloxacino (5 μg) para Enterobacterales es S ≥ 25 y R < 22, lo que significa que se considera sensible (S) si ZOI ≥ 25 mm, mientras que es resistente (R) si ZOI < 22 mm. Si el diámetro de ZOI cae entre 22 y 25, el aislado se considera intermedio (I).
      2. El punto de ruptura del diámetro de la zona (mm) para un disco antibiótico cloranfenicol (30 μg) para Staphylococcus spp. es S ≥ 18 y R < 18, lo que significa que se considera sensible si ZOI ≥ 18 mm, mientras que es resistente si ZOI < 18 mm.
    2. Determine el índice de resistencia a antibióticos múltiples (SAM) encontrando la relación entre el número de antibióticos a los que el aislado es resistente y el número total de antibióticos a los que está expuesto el aislado.
      NOTA: Para el control de calidad, E. coli ATCC 25922 y S. áureo ATCC 29213 se utilizan como cepas de referencia siguiendo el protocolo como en el paso 4.

5. Detección basada en PCR de genes de resistencia a antibióticos en los aislados

  1. Utilice un protocolo de PCR estándar para la identificación de ARG en los aislados. Prepare la plantilla de ADN utilizando el protocolo indicado en el paso 3.1.
    NOTA: Las condiciones de ciclo de PCR utilizadas en este estudio fueron 94 °C durante 10 min, seguidas de 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, recocido durante 30 s a la temperatura apropiada (estandarizado para cada juego de cebadores), extensión a 72 °C durante 40 s y una extensión final a 72 °C durante 5 min. La mezcla de reacción se describe en la Tabla 4. La lista de ARG, cebadores y temperaturas de recocido se da en la Tabla 5.
  2. Para resolver, visualizar y comprobar la pureza de los amplicones, siga los pasos 3.2.3-3.2.10.

6. Análisis de ADN metagenómico completo para la identificación de la diversidad bacteriana total y la detección de ARG en el metagenoma

  1. Extracción del ADN total (metagenoma) de la muestra de agua
    1. Extraer el ADN metagenómico de las muestras de agua filtrada.
      NOTA: En el presente estudio, el ADN metagenómico (ADN total) se extrajo de las muestras de agua filtrada utilizando el kit de aislamiento de ADN referenciado siguiendo el protocolo del fabricante (ver la Tabla de materiales).
    2. Verifique la calidad del ADN cargando 3 μL del ADN metagenómico extraído en un gel de agarosa al 0,8% y ejecute el gel a 80-110 V durante aproximadamente 30 minutos.
    3. Compruebe la presencia de una sola banda intacta.
    4. Verifique la concentración de ADN con un fluorómetro.
  2. Determinación de la diversidad bacteriana y detección de ARG mediante secuenciación de ADN metagenómico completo
    1. Preparación de bibliotecas y amplificación por PCR:
      1. Prepare una biblioteca de secuenciación de extremo emparejado utilizando el kit de preparación de la biblioteca de ADN al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales).
      2. Prepare el ADN para la ligadura del adaptador tomando 200 ng de ADN y cortándolo mecánicamente en fragmentos más pequeños, seguido de un paso continuo de reparación final en el que se agrega una "A" a los extremos 3'.
      3. Dependiendo de la plataforma utilizada para la secuenciación, ligar adaptadores específicos a ambos extremos de los fragmentos de ADN.
        NOTA: Las secuencias cruciales para enlazar bibliotecas con doble código de barras a una celda de flujo para la secuenciación están presentes en estos adaptadores. Esto permite la amplificación por PCR de los fragmentos ligados por adaptador y la unión de los cebadores de secuenciación estándar.
      4. Para verificar la calidad y la cantidad, analice la biblioteca amplificada utilizando un chip de ADN de alta sensibilidad según las instrucciones del fabricante.
    2. Generación y secuenciación de clústeres:
      1. Cargue la biblioteca amplificada en la plataforma de secuenciación adecuada para la generación de clústeres y la secuenciación posterior.
        NOTA: Las moléculas de biblioteca se unen a los oligos adaptadores complementarios en la celda de flujo de extremo pareado. Durante la secuenciación, las hebras hacia adelante se escinden selectivamente después de la resíntesis de la cadena inversa. Esta hebra inversa copiada se secuencia desde el extremo opuesto del fragmento.
    3. Análisis bioinformático:
      1. Genere andamios a partir de los datos de alta calidad utilizando la plataforma adecuada.
      2. Someter estos andamios a análisis bioinformáticos para la clasificación taxonómica e identificación de los ARGs.
        NOTA: El flujo de trabajo para todo el análisis de ADN metagenómico para la identificación de la diversidad bacteriana total y la detección de ARG en el metagenoma se da en la Figura 1. Un diagrama de flujo de la metodología completa descrita en el manuscrito se da en la Figura 2.

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Resultados

Carga bacteriana total y recuento de bacterias resistentes a los antibióticos (AR)
La enumeración de la carga bacteriana total se llevó a cabo mediante la difusión de diluciones de 10−4 a 10−6 veces de las muestras de agua en agar R2A, medio modificado. Para la enumeración del recuento de bacterias AR, se distribuyeron diluciones de 10-3 a 10-6 veces en placas de medios que contenían antibióticos (Figura 3). Los recuentos totale...

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Discusión

La recolección y el procesamiento de la muestra juegan un papel importante y pueden afectar los resultados y la interpretación del estudio. Por lo tanto, para descartar la variabilidad en las muestras, es importante llevar a cabo el muestreo en múltiples ubicaciones de la masa de agua dulce que se está estudiando. Mantener condiciones ambientales asépticas adecuadas al manipular dichas muestras puede prevenir la contaminación. Además, para evitar cambios en la composición bacteriana que puedan influir en la calidad y can...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses contradictorios que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue parcialmente apoyado por subvenciones financieras del Departamento de Ciencia y Tecnología-Promoción de la Investigación Universitaria y el Esquema de Excelencia Científica (DST-PURSE) de la Universidad de Mumbai. Devika Ghadigaonkar trabajó como becaria de proyecto bajo el esquema. Se reconoce la ayuda técnica proporcionada por Harshali Shinde, investigador principal del Proyecto n.º de investigación del Departamento de Ciencia y Tecnología-Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería (DST-SERB): CRG / 2018 / 003624.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Escalera de ADN de 100 pbHimediaMBT049-50LNPara la estimación del tamaño de los amplicones
2x PCR Taq mastermixHiMediaMBT061-50RPara hacer la mezcla de reacción PCR
37 ° C IncubadoraGS-192, Gayatri ScientificNAPara la incubación de bacterias
6x Tampón de carga de gelHiMediaML015-1MLColorante de carga y seguimiento que ayuda a pesar la muestra de ADN y a seguir el progreso de la electroforesis
Polvo de agarosaHimediaMB229-50GPara la resolución de amplicones durante la electroforesis en gel de agarosa (AGE)
Disco antibiótico de ampicilinaHiMediaSD002Para la realización
AST AutoclaveEquitronNANecesario para la esterilización de medios, placas de vidrio, tubos de ensayo, etc
Bioanalyzer 2100Agilent TechnologiesNAPara comprobar la calidad y cantidad de la biblioteca amplificada
Bisafety B2 ArmarioIMSET IMSETBSC-Clase II Tipo B2Se utiliza para trabajos microbiológicos como el cultivo de bacterias, AST, etc.
Disco antibiótico de cefotaximaHiMediaSD295E-5VLPara realizar AST
Polvo de antibiótico de cefotaximaHiMediaTC352-5GPara la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos Disco de
antibiótico de ceftriaxonaHiMediaSD065Para realizar
centrífuga AST MinispinEppendorfMinispin Plus-5453Se utiliza para granular los restos durante la preparación del ADN crudo
Disco antibiótico de cloranfenicolHiMediaSD006-5x50DSPara realizar AST
Disco antibiótico de ciprofloxacinaHiMediaSD060-5x50DSPara realizar AST
Ciprofloxacina antibiótico en polvoHiMediaTC447-5GPara la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de antibióticos resistentes bacterias
ColorímetroQuestNAPara comprobar el diámetro exterior de las suspensiones de cultivo
Base de datosanotación funcional de ARG; https://card.mcmaster.ca/
Incubadora agitadora de enfriamientoBTL41 Allied ScientificNAPara la incubación de placas de medios para el cultivo de bacterias
Congelador (-40 ° C) HaierDW40L, Haier BiomedicalsPara el almacenamiento de existencias de glicerol Kit de preparación de bibliotecas de
ADNNEB Next Ultra Kit de preparación de bibliotecas de ADN para IlluminaNAPreparación de bibliotecas de secuenciación de extremos emparejados
EDTAHiMediaGRM1195-100GPara la preparación de tampones de funcionamiento de gel para electroforesis en gel de agarosa (AGE)Aparato de
electroforesisTechResourceBandejade fundición en gel de 15 cmPara hacer el gel de agarosa   y la realización de electroforesis 
Electroforesis Batería de energía con electrodosGeneiNAPara el funcionamiento del AGE 
Disco antibiótico de eritromicinaHiMediaSD222-5VLPara realizar AST
Antibiótico de eritromicina en polvoHiMediaCMS528-1GPara la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos
Antibiotico de eritromicina en polvoHiMediaTC024-5GPara la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de antibióticos resistentes bacterias
Escherichia coli ATCC 25922       HiMedia0335X-1Se utiliza como control mientras se realiza AST
Bromuro de etidioHiMediaMB071-1GAgente de intercalación y visualización de ADN después de la electroforesis bajo Gel Sistema de documentación
FluorómetroQubit 2.0NAPara determinar la concentración de ADN metagenómico extraído
Sistema de documentación en gelBioRadSe utiliza para visualizar amplicones de PCR después de la electroforesis
Disco antibiótico de gentamicinaHiMediaSD170-5x50DSPara realizar AST
Ácido Acético GlacialHiMediaAS119-500MLPara la preparación de Tampón de funcionamiento de gel para Electroforesis de gel de agarosa (AGE)
GlicerolHiMediaGRM1027-500MLPara hacer caldos de glicerol
Discode antibiótico ImipenemHiMediaSD073Para realizar
AST Kaiju DatabaseNANA Paraclasificación taxonómica de lecturas; https://kaiju.binf.ku.dk/
Disco de antibiótico de kanamicinaHiMediaSD017-5x50DSPara realizar AST
Antibiótico de kanamicina en polvoHiMediaMB105-5GPara la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos
Disco antibiótico de levofloxacinoHiMediaSD216-5VLPara realizar
el caldo AST Luria BertaniHimediaM1245-500GPara el enriquecimiento de cultivos
Normas McFarlandHimediaR092-1NoPara comparar la densidad de la suspensión de cultivo
Biología molecular aguaHiMediaTCL018-500MLPara hacer mezcla
de reacción PCRAgar Mueller-Hinton (MHA) HiMediaM173-500GPara realizar pruebas de susceptibilidad a los antibiotc (AST)
Disco antibiótico de neomicinaHiMediaSD731-5x50DSPara realizar AST
PCR Gradient Thermal CyclerEppendorfMastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz Se utiliza para realizar PCR para la amplificación de la región de ARNr 16S y varios genes de resistencia a antibióticos
Imprimaciones XcelrisNApara amplificación de PCR 
Agar R2A, ModificadoHiMediaM1743Para la preparación de placas de medios para el aislamiento de la carga bacteriana total y resistente a los antibióticos (AR)
Generación de andamiosCLC Genomics Workbench 6.0NAPara la generación de andamios
SecuenciadorPlataforma Illumina (2 x 150 bp química)NASecuenciación de biblioteca amplificada
Cloruro de sodio HiMediaTC046-500GPara la preparación de solución salina al 0,85% para diluir en serie la muestra de agua
Kit de aislamiento de ADN en el sueloXcelgenNAPara la extracción de ADN metagenómico completo de la muestra de agua filtrada 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213HiMedia0365PSe utiliza como control mientras se realiza
clasificación taxonómicaHerramienta ioinformática KaijuNAPara la clasificación de lecturas en diferentes grupos taxonómicos desde el nivel de filo hasta el nivel de género 
La Base de Datos Integral de Resistencia a los Antibióticos (CARD)NANAPara la anotación funcional de ARGs Disco de
antibiótico TigeciclinaHiMediaSD278Para realizar AST
Disco antibiótico TrimethoprimHiMediaSD039-5x50DSPara realizar AST
Tris baseHiMediaTC072-500GPara la preparación de Gel tampón de ejecución para Agarose Gel Electroforesis (AGE)
Vancomicina antibiótico en polvoHiMediaCMS217Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos
Balanza de pesajeMettler ToledoME204 Mettler Toledo Seutiliza para el pesaje de medios en polvo, reactivos en polvo, etc.
NA - No aplicable
de . la completa de resistencia a antibióticos (CARD) la la AST

Referencias

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