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Neuroscience

चूहों में मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा-प्रेरित स्ट्रोक के बाद एन्सेफलोमायोसिनेंगोसिस उपचार के लिए एक मॉडल

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63951
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, UConn School of Medicine, 2Division of Neurosurgery, UConn School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल का उद्देश्य गैर-मोयामोया तीव्र इस्केमिक स्ट्रोक के उपचार के लिए इस्केमिक मस्तिष्क ऊतक की पाईल सतह पर संवहनी अस्थायी मांसपेशी फ्लैप के एन्सेफलोमायोसिनेंगियोसिस-ग्राफ्टिंग के तरीके प्रदान करना है। एंजियोजेनेसिस बढ़ाने में दृष्टिकोण की प्रभावकारिता का मूल्यांकन चूहों में क्षणिक मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा मॉडल का उपयोग करके किया जाता है।

Abstract

इस्केमिक स्ट्रोक से पीड़ित अधिकांश रोगियों के लिए कोई प्रभावी उपचार उपलब्ध नहीं है, जिससे नए चिकित्सीय का विकास अनिवार्य हो जाता है। इस्केमिक स्ट्रोक के बाद मस्तिष्क की आत्म-चिकित्सा की क्षमता प्रभावित क्षेत्र में अपर्याप्त रक्त की आपूर्ति से सीमित है। एन्सेफलोमायोसिन्जियोसिस (ईएमएस) एक न्यूरोसर्जिकल प्रक्रिया है जो मोयामोया रोग वाले रोगियों में एंजियोजेनेसिस प्राप्त करती है। इसमें इस्केमिक मस्तिष्क की सतह पर संवहनी अस्थायी मांसपेशी ग्राफ्ट के प्लेसमेंट के साथ क्रैनियोटॉमी शामिल है। चूहों में तीव्र इस्केमिक स्ट्रोक की सेटिंग में ईएमएस का कभी अध्ययन नहीं किया गया है। इस अध्ययन को चलाने वाली परिकल्पना यह है कि ईएमएस मांसपेशियों के ग्राफ्ट के आसपास की कॉर्टिकल सतह पर सेरेब्रल एंजियोजेनेसिस को बढ़ाता है। यहां दिखाया गया प्रोटोकॉल प्रक्रिया का वर्णन करता है और ईएमएस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता और प्रभावकारिता का समर्थन करने वाले प्रारंभिक डेटा प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में, क्षणिक मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (एमसीएओ) के 60 मिनट के बाद, चूहों को या तो एमसीएओ या एमसीएओ + ईएमएस उपचार के लिए यादृच्छिक किया गया था। ईएमएस रोड़ा के 3-4 घंटे बाद किया गया था। चूहों को MCAO या MCAO + EMS उपचार के 7 या 21 दिनों के बाद बलिदान किया गया था। टेम्पोरिस ग्राफ्ट व्यवहार्यता को निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड रिड्यूस्ड-टेट्राज़ोलियम रिडक्टेस परख का उपयोग करके मापा गया था। एक माउस एंजियोजेनेसिस सरणी एंजियोजेनेसिस और न्यूरोमॉड्यूलेटिंग प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करती है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग मस्तिष्क प्रांतस्था के साथ ग्राफ्ट बॉन्डिंग और पोत घनत्व में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए किया गया था। यहां प्रारंभिक आंकड़ों से पता चलता है कि ग्राफ्टेड मांसपेशी ईएमएस के 21 दिनों बाद व्यवहार्य रही। इम्यूनोस्टेनिंग ने सफल ग्राफ्ट प्रत्यारोपण और मांसपेशी ग्राफ्ट के पास पोत घनत्व में वृद्धि दिखाई, जो एंजियोजेनेसिस में वृद्धि का संकेत देती है। डेटा से पता चलता है कि ईएमएस फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ) को बढ़ाता है और स्ट्रोक के बाद ओस्टियोपोंटिन के स्तर को कम करता है। इसके अतिरिक्त, स्ट्रोक के बाद ईएमएस ने मृत्यु दर में वृद्धि नहीं की, यह सुझाव देते हुए कि प्रोटोकॉल सुरक्षित और विश्वसनीय है। यह नई प्रक्रिया प्रभावी और अच्छी तरह से सहन की जाती है और तीव्र इस्केमिक स्ट्रोक के बाद बढ़ी हुई एंजियोजेनेसिस के लिए नए हस्तक्षेप की जानकारी प्रदान करने की क्षमता रखती है।

Introduction

इस्केमिक स्ट्रोक विनाशकारी क्रोनिक सीक्वेल के साथ एक तीव्र न्यूरोवास्कुलर चोट है। अमेरिका में स्ट्रोक से बचे अधिकांश, प्रति वर्ष 650,000, स्थायीकार्यात्मक विकलांगता से पीड़ित हैं। उपलब्ध उपचारों में से कोई भी इस्केमिक स्ट्रोक के तीव्र चरण के बाद न्यूरोप्रोटेक्शन और कार्यात्मक वसूली प्रदान नहीं करता है। एक तीव्र इस्केमिक स्ट्रोक के बाद, प्रत्यक्ष और संपार्श्विक रक्त की आपूर्ति दोनों कम हो जाती है जो मस्तिष्क कोशिकाओं और नेटवर्क की शिथिलता की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप अचानक न्यूरोलॉजिकल घाटे 2,3 होते हैं। इस्केमिक क्षेत्र में रक्त की आपूर्ति की बहाली स्ट्रोक थेरेपी का सबसे महत्वपूर्ण लक्ष्य है। इस प्रकार, इस्केमिक क्षेत्र में रक्त की आपूर्ति को बढ़ावा देने के लिए एंजियोजेनेसिस को बढ़ाना एक आशाजनक चिकित्सीय दृष्टिकोण है; हालांकि, एरिथ्रोपोइटिन, स्टेटिन और विकास कारकों सहित पोस्ट-स्ट्रोक एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देने के लिए पहले अध्ययन किए गए तरीके विषाक्तता या ट्रांसलैटेबिलिटीके अस्वीकार्य स्तरों से सीमित हैं।

एन्सेफलोमायोसिन्जियोसिस (ईएमएस) एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया है जो मोयामोया रोग के साथ मनुष्यों में सेरेब्रल एंजियोजेनेसिस को बढ़ाती है, संकुचित कपाल धमनियों की स्थिति जो अक्सर स्ट्रोक की ओर ले जाती है। ईएमएस में खोपड़ी से रोगी की अस्थायी मांसपेशी के संवहनी खंड की आंशिक अलगाव शामिल है, इसके बाद प्रभावित कॉर्टेक्स पर मांसपेशियों की क्रैनियोटॉमी और ग्राफ्टिंग होती है। यह प्रक्रिया अच्छी तरह से सहन की जाती है और सेरेब्रल एंजियोजेनेसिस को प्रेरित करती है, जिससे मोयामोया रोग 5,6 के रोगियों में इस्केमिक स्ट्रोक का खतरा कम हो जाता है। इस प्रकार, प्रक्रिया इन रोगियों में काफी हद तक निवारक भूमिका निभाती है। इस प्रक्रिया द्वारा लाए गए एंजियोजेनेसिस की इस्केमिक स्ट्रोक की स्थापना में न्यूरोवास्कुलर संरक्षण और वसूली को बढ़ावा देने में भी भूमिका हो सकती है। यह रिपोर्ट इस परिकल्पना का समर्थन करती है कि ईएमएस द्वारा लाए गए एंजियोजेनेसिस में सेरेब्रल इस्किमिया के लिए समझ और चिकित्सीय विकल्पों का विस्तार करने की क्षमता है।

ईएमएस के अलावा, एंजियोजेनेसिस में सुधार के लिए कई औषधीय और शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण हैं, लेकिन उनकी कई सीमाएं हैं। संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) प्रशासन जैसे औषधीय दृष्टिकोण कई सीमाओं के कारण अपर्याप्त या हानिकारक पाए गए हैं, जिसमें अराजक, अव्यवस्थित, लीक और आदिम संवहनी प्लेक्सस का गठन शामिल है, जो ट्यूमर ऊतकों 7,8 में पाए जाने वाले लोगों से मिलते जुलते हैं औरनैदानिक परीक्षणों में कोई लाभकारी प्रभाव नहीं है।

सर्जिकल दृष्टिकोण में प्रत्यक्ष एनास्टोमोसिस जैसे सतही अस्थायी धमनी-मध्य सेरेब्रल धमनी एनास्टोमोसिस, अप्रत्यक्ष एनास्टोमोसिस जैसे एन्सेफलो-ड्यूरो धमनी-सिनेंगोसिस (ईडीएएस), एन्सेफलोमायोसिनेंगोसिस (ईएमएस), और प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष एनास्टोमोसिस10 के संयोजन शामिल हैं। ईएमएस को छोड़कर, ये सभी प्रक्रियाएं छोटे जानवरों में बहुत तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और मांग वाली हैं। जबकि अन्य प्रक्रियाओं को जटिल संवहनी एनास्टोमोसिस की आवश्यकता होती है, ईएमएस को अपेक्षाकृत सरल मांसपेशी ग्राफ्ट की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, कॉर्टेक्स के लिए अस्थायी मांसपेशियों की निकटता इसे ग्राफ्टिंग के लिए एक प्राकृतिक विकल्प बनाती है, क्योंकि इसे इसकी रक्त आपूर्ति से पूरी तरह से उत्पादित या डिस्कनेक्ट करने की आवश्यकता नहीं होती है, जैसा कि आवश्यक होगा यदि ग्राफ्टिंग के लिए अधिक दूर की मांसपेशियों का उपयोग किया जाता है।

ईएमएस का अध्ययन चूहों 7,11 में क्रोनिक सेरेब्रल हाइपोपरफ्यूजन मॉडल में किया गया है। हालांकि, एक अस्थायी मांसपेशी ग्राफ्ट का उपयोग करके ईएमएस का अध्ययन कृन्तकों में तीव्र इस्केमिक स्ट्रोक में कभी नहीं किया गया है। यहां, हम मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा मॉडल (एमसीएओ) के माध्यम से इस्केमिक स्ट्रोक के बाद चूहों में ईएमएस के एक नए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह पांडुलिपि एमसीएओ के बाद चूहों में ईएमएस के इस नए दृष्टिकोण के लिए तरीकों और प्रारंभिक डेटा के विवरण के रूप में कार्य करती है।

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Protocol

सभी प्रयोगों को यूकॉन हेल्थ की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और अमेरिकी दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था। निम्नलिखित प्रोटोकॉल कृंतक की किसी भी प्रजाति या तनाव में काम करना चाहिए। यहां, 8- से 12 सप्ताह के, उम्र और वजन से मेल खाने वाले सी 57बीएल / 6 जंगली प्रकार के नर चूहों का उपयोग किया गया था। चूहों को मानक चाउ आहार और पानी एड लिबिटम खिलाया गया था। मानक आवास की स्थिति 72.3 डिग्री फ़ारेनहाइट और 30% -70% सापेक्ष आर्द्रता पर 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ बनाए रखी गई थी।

1. पूर्व-सर्जरी तैयारी

  1. सर्जरी से पहले ऑटोक्लेविंग द्वारा सभी उपकरणों को निष्फल करें। ऑपरेटिंग सतह को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें और इलेक्ट्रिक हीटिंग पैड के साथ ऑपरेटिंग सतह को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. प्रेरण के लिए 4% -5% आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करने के लिए एक प्रेरण कक्ष का उपयोग करें। सर्जरी के अंत तक रखरखाव के लिए नाक शंकु के माध्यम से 1.5% -2.0% आइसोफ्लुरेन वितरित करें। सर्जरी से पहले सुनिश्चित करें कि माउस को एक दृढ़ हिंद पैर चुटकी की प्रतिक्रिया की कमी और पोस्टुरल प्रतिक्रिया और राइटिंग रिफ्लेक्स के नुकसान का आकलन करके ठीक से एनेस्थेटाइज्ड किया गया है।
  3. ऑपरेटिंग सतह पर माउस को बाईं ओर रखें और दोनों आंखों की रक्षा के लिए आंखों का मलहम लगाएं।
  4. सर्जिकल क्षेत्र (यानी, आंख और कान के बीच दाएं पार्श्व क्रैनियम) पर इलेक्ट्रिक क्लिपर के साथ बालों को शेव करें। सर्जिकल साइट के बीच से बाहर की ओर संकेंद्रित हलकों में सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें, 70% इथेनॉल के बाद पोविडोन समाधान के साथ, और इन चरणों को 2x दोहराएं।
    नोट: सर्जरी साइट आंख के करीब होने के कारण, सर्जिकल साइट के आसपास के क्षेत्र का 150% निकालना आंख में जलन या आकस्मिक चोट से बचने के लिए संभव नहीं हो सकता है।
  5. सर्जरी की जगह पर प्री-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया के रूप में चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा 0.25% बुपिवैकेन (8 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन तक) की एकल खुराक दें।
  6. 4x आवर्धन पर एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप स्थापित करें। माइक्रोस्कोप का उपयोग सभी सर्जिकल चरणों के लिए किया जाता है।

2. सर्जरी प्रक्रिया

नोट: सर्जरी चरण चित्रा 1 में प्रस्तुत किए गए हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, तीन चूहों को शाम समूह के लिए आवंटित किया गया था, अकेले ईएमएस के लिए तीन चूहे, एमसीएओ के लिए 12 चूहे और एमसीएओ + ईएमएस समूह के लिए 23 चूहे।

  1. MCAO सर्जरी
    नोट: एमसीएओ कृन्तकों में इस्केमिक स्ट्रोक का एक अच्छी तरह से विशेषता वाला मॉडल है, जैसा कि हमारे और अन्य 12,13,14 द्वारा वर्णित है। सर्जरी के चरणों को यहां संक्षेप में वर्णित किया गया है। फोकल क्षणिक सेरेब्रल इस्किमिया को आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के तहत 60 मिनट के दाहिने एमसीएओ द्वारा प्रेरित किया गया था, जिसके बाद 7 या 21 दिनों के लिए रीपरफ्यूजन किया गया था।
    1. बाहरी कैरोटिड धमनी स्टंप के माध्यम से आंतरिक कैरोटिड धमनी विभाजन से 10-11 मिमी लंबे 6.0 सिलिकॉन रबर-लेपित मोनोफिलामेंट को आगे बढ़ाकर एकतरफा दाएं एमसीएओ के बाद एक मध्य रेखा उदर गर्दन चीरा लगाएं। शाम चूहों में, आंतरिक कैरोटिड धमनी में सीवन की प्रगति को छोड़कर समान सर्जरी करें।
    2. तापमान नियंत्रण प्रणाली का उपयोग करके मलाशय के तापमान को मापें, स्वचालित हीटिंग पैड के साथ सर्जरी के दौरान ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखें।
    3. पार्श्व खोपड़ी (एमसीए क्षेत्र के अनुरूप) के खिलाफ डॉपलर जांच रखकर और मान8 रिकॉर्ड करके सीवन सम्मिलन से पहले सेरेब्रल रक्त प्रवाह को मापने के लिए लेजर डॉपलर फ्लोमेट्री का उपयोग करें। बेसलाइन सेरेब्रल रक्त प्रवाह के 15% तक रोड़ा में कमी की पुष्टि करने के लिए, सीवन उन्नत होने के बाद उसी प्रक्रिया का उपयोग करें। रीपरफ्यूजन की पुष्टि करने के लिए, सीवन को हटाने के बाद उसी प्रक्रिया का उपयोग करें।
    4. क्रोनिक एंडपॉइंट के लिए पर्याप्त पोषण सुनिश्चित करने के लिए सभी जानवरों को बलिदान और / या सर्जरी के 1 सप्ताह बाद गीले मैश के साथ खिलाएं, क्योंकि स्ट्रोक के बाद जानवरों में पालन की कमी होती है।
  2. ईएमएस सर्जरी
    1. MCAO के 60 मिनट के बाद, चूहों को MCAO-केवल या MCAO + EMS समूहों में यादृच्छिक करें। एमसीएओ (एमसीएओ + ईएमएस समूह) या चुनिंदा प्रयोगों (ईएमएस-केवल समूह) के लिए शाम सर्जरी के 4 घंटे बाद ईएमएस करें। सर्जरी से पहले बाँझ सर्जिकल दस्ताने की एक नई जोड़ी में बदलें।
      नोट: चूहों को एमसीएओ के 60 मिनट के बाद संज्ञाहरण से ठीक किया गया और ईएमएस सर्जरी से पहले फिर से एनेस्थेटाइज किया गया।
    2. ईएमएस (एमसीएओ + ईएमएस या ईएमएस-केवल समूह) प्राप्त करने वाले समूहों के लिए, कैंची के साथ 10-15 मिमी त्वचा चीरा लगाएं, जो 1-2 मिमी रोस्ट्रल से दाहिने कान तक 1-2 मिमी पुच्छल से दाईं आंख तक फैली हुई है।
      नोट: नीचे अस्थायी मांसपेशियों को आकस्मिक क्षति को रोकने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग किया गया था।
    3. क्लैंप का उपयोग करके त्वचा फ्लैप को वापस लें और अस्थायी मांसपेशियों और खोपड़ी की नेत्रहीन पहचान करें।
    4. एक फैलाने वाली तकनीक के साथ कैंची का उपयोग करके खोपड़ी से अस्थायी मांसपेशियों को स्पष्ट रूप से विच्छेदित करें। उदर प्रतिबिंब की सुविधा के लिए मांसपेशियों की पुच्छल सीमा के साथ उदर रूप से निर्देशित 2-3 मिमी मायोटॉमी करें।
    5. माइक्रो ड्रिल का उपयोग करके प्रतिबिंबित अस्थायी मांसपेशियों के नीचे खोपड़ी पर एक क्रैनियोटॉमी ~ 5 मिमी व्यास का प्रदर्शन करें।
    6. मस्तिष्क की पाईल सतह को उजागर करने के लिए चिमटी के साथ ड्यूरा मेटर को हटा दें। मस्तिष्क को आकस्मिक चोट से बचने के लिए अत्यधिक सावधानी बरतें।
    7. पृष्ठीय त्वचा के चमड़े के नीचे के ऊतक में अस्थायी मांसपेशियों की पृष्ठीय सीमा को 6-0 मोनोक्रिल फिलामेंट्स के साथ फ्लैप करें, जिससे यह उजागर सेरेब्रल कॉर्टेक्स में फ्लश हो जाता है।
    8. 6-0 मोनोफिलामेंट सीवन के साथ त्वचा के चीरे को बंद करें। माउस को अपने पिंजरे में वापस रखें और संज्ञाहरण से वसूली तक निगरानी करें। माउस को उसकी आवास सुविधा में वापस करें।

3. पोस्ट-ऑपरेटिव विचार

  1. बीमारी के लिए चूहों और संक्रमण के लिए सर्जिकल साइट की दैनिक निगरानी करें। हाइड्रेशन का समर्थन करने के लिए प्रतिदिन चमड़े के नीचे सामान्य खारा (शरीर के वजन से 1% मात्रा) दें।
  2. सर्जरी के 7 दिनों बाद तक गंभीर निर्जलीकरण (शरीर के वजन में कमी >20%) के लिए निगरानी करें। यदि >20% वजन घटाने पर शरीर के वजन से चमड़े के नीचे सामान्य खारा 1% मात्रा का एक अतिरिक्त बोलस प्रशासित करें।
  3. विशेष विचारों के बिना इंजेक्शन, फिजियोलॉजिकल निगरानी और अन्य परीक्षण के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: इस प्रक्रिया में, सर्जरी के बाद के इलाज के लिए ओपिओइड या गैर-स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं (एनएसएआईडी) के उपयोग से बचा गया था क्योंकि इन-हाउस संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति 15,16,17,18 के परामर्श से स्ट्रोक के परिणाम या इन्फ्रैक्ट आकार पर इन एजेंटों के ज्ञात प्रभाव थे। हालांकि, अन्य मॉडलों के साथ ईएमएस सर्जरी के लिए पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया के उपयोग को अत्यधिक प्रोत्साहित किया जाता है। कृपया इसके लिए संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) से परामर्श करें।

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Representative Results

इस अध्ययन के लिए कुल 41 चूहों का इस्तेमाल किया गया था। तीन मौतों के बाद, एक एमसीएओ में और दो एमसीएओ + ईएमएस में, दिखाए गए परिणामों को प्राप्त करने के लिए कुल 38 चूहों का उपयोग किया गया था।

सांख्यिकी
प्रत्येक प्रयोग के डेटा को मानक विचलन (एसडी) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। महत्व दो समूहों की तुलना करने के लिए या तो अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था या दो से अधिक समूहों के लिए एक-तरफ़ा एनोवा, कई तुलनाओं को सही करने के लिए न्यूमैन-केल्स पोस्ट-हॉक टेस्ट के साथ।

निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (कम)-टेट्राज़ोलियम रिडक्टेस (एनएडीएच-टीआर) धुंधला होना
यह धुंधलापन ग्राफ्टेड मांसपेशियों की दीर्घकालिक व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया गया था जैसा कि तुरोज़ी एट अल.19 में किया गया था। संक्षेप में, बलिदान के समय, ग्राफ्टेड मांसपेशी फ्लैप को सावधानीपूर्वक उत्पादित किया गया था, 30 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था, और -80 डिग्री सेल्सियस पर इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) माध्यम में क्रायोप्रिजर्व किया गया था। एनएडीएच-टीआर एंजाइम-हिस्टोकेमिकल प्रतिक्रिया के लिए अस्थायी मांसपेशियों के ऊतकों के कई 12 μm मोटी क्रायोसेक्शन दाग दिए गए थे। स्लाइड्स को नाइट्रोब्लू टेट्राज़ोलियम (1.8 मिलीग्राम / डीएल) और एनएडीएच (15 मिलीग्राम / डीएल) के घोल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.05 एम ट्रिस बफर (पीएच 7.6) में इनक्यूबेट किया गया था। अप्रयुक्त टेट्राज़ोलियम अभिकर्मक को एसीटोन की घटती सांद्रता के बाद बढ़ते हुए उपयोग का उपयोग करके हटा दिया गया था। एनएडीएच-टेट्राज़ोलियम-दाग वाली मांसपेशियों का मात्रात्मक मूल्यांकन 40x आवर्धन पर ली गई मांसपेशियों की छवियों पर किया गया था।

इम्यूनोस्टेनिंग अध्ययन
इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग मांसपेशियों और कॉर्टेक्स20,21 के जंक्शन पर कॉर्टेक्स और रक्त वाहिका घनत्व के साथ मांसपेशी ग्राफ्ट बॉन्डिंग की कल्पना करने के लिए किया गया था। मस्तिष्क के ऊतकों के साथ मांसपेशियों के बंधन के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, ईएमएस सर्जरी से गुजरने वाले चूहों का उपयोग यहां किया गया था। प्रत्येक संबंधित समय बिंदु के अंत में, चूहों को एक एवर्टिन इंजेक्शन (50 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के साथ एनेस्थेटाइज किया गया था, इसके बाद 1 एक्स पीबीएस के साथ छिड़काव किया गया था जिसमें 5 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ निर्धारण था। मस्तिष्क प्रांतस्था से अस्थायी मांसपेशी (टीएम) ग्राफ्ट के आकस्मिक अलगाव को रोकने के लिए खोपड़ी को सावधानीपूर्वक काटा गया था। मस्तिष्क प्रांतस्था के ऊपर टीएम ग्राफ्ट को तब शेष अस्थायी मांसपेशियों से अलग किया गया था। मस्तिष्क को सावधानीपूर्वक हटा दिया गया और रात भर में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में पोस्ट-फिक्स किया गया। निश्चित मस्तिष्क को तब 1x PBS में 30% सुक्रोज के साथ निर्जलित किया गया था जब तक कि मस्तिष्क शीशी के तल (लगभग 1-3 दिन) तक डूब न जाए। 30 μm आकार के ऊतक वर्गों को फ्रीजिंग माइक्रोटोम के साथ काटा गया और स्लाइड पर रखा गया।

मस्तिष्क प्रांतस्था में रक्त वाहिकाओं के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, एमसीएओ और एमसीएओ + ईएमएस चूहों को ऊपर के रूप में बलिदान, संक्रमित, तय और संसाधित किया गया था। 30 μm आकार के मस्तिष्क स्लाइस को एक फ्रीजिंग माइक्रोटोम पर विभाजित किया गया था और एक ग्लास साइड पर रखा गया था। एंटीजन पुनर्प्राप्ति साइट्रेट बफर (पीएच 6.0) का उपयोग करके की गई थी और खंडों को ब्लॉकिंग बफर के साथ इनक्यूबेट किया गया था, जिसके बाद प्राथमिक एंटीबॉडी, एंटी-अल्फा कंकाल मांसपेशी एक्टिन 1: 200 और लेक्टिन-डीवाई 59421,22 के साथ रात भर इनक्यूबेशन किया गया था। प्रति माउस तीन कोरोनल मस्तिष्क खंड (एन = 5 चूहे / समूह; कुल = 15 खंड) को ब्रेग्मा से 0.45 मिमी और 0.98 मिमी के बीच लिया गया था, दाग, और इस्केमिक कोर और पेनम्ब्रा क्षेत्रों के जंक्शन पर 20 एक्स आवर्धन पर परिमाणीकरण के लिए कल्पना की गई थी। एक अंधे पर्यवेक्षक ने इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मस्तिष्क पैरेन्काइमा में लेक्टिन सकारात्मक वाहिका घनत्व की मात्रा निर्धारित की।

ईएमएस के बाद 21 दिनों में मांसपेशियों में ग्राफ्ट व्यवहार्य रहता है
इस सर्जरी की सफलता के लिए एक शर्त ग्राफ्टेड टेम्पोरिस मांसपेशी की दीर्घकालिक व्यवहार्यता है। टीएम ग्राफ्ट ने ग्राफ्टेड मांसपेशी बनाम नियंत्रण मांसपेशी (71.32% मांसपेशी कोशिका अस्तित्व ± 16.64% बनाम 97.19% ± 3.81%) में सर्जरी के बाद 7 दिनों में मांसपेशियों की कोशिकाओं की क्षणिक क्षति दिखाई। हालांकि, ग्राफ्टेड और नियंत्रण मांसपेशी के बीच यह अंतर गायब हो गया, और सर्जरी के 21 दिनों बाद मांसपेशियां पूरी तरह से ठीक हो गईं (98.22% ± 3.965 बनाम 96.87% ± 2.27%); चित्र 2 ए)।

मांसपेशी ग्राफ्ट मस्तिष्क के ऊतकों के साथ ढीले बंधन बनाते हैं
मस्तिष्क प्रांतस्था की सतह पर अस्थायी मांसपेशियों की सफल ग्राफ्टिंग इस मॉडल की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण आवश्यकता है। ईएमएस + एमसीएओ और ईएमएस-ओनली मॉडल दोनों में, टेम्पोरेलिस मांसपेशी ग्राफ्ट ईएमएस के 21 दिनों बाद कॉर्टिकल सतह का पालन करते हैं, जो सफल सर्जरी, ग्राफ्ट आरोपण और बॉन्डिंग का सुझाव देते हैं (चित्रा 1 बी और चित्रा 2 बी)।

ईएमएस के बाद पेरिलेशनल कॉर्टेक्स में रक्त वाहिका घनत्व बढ़ जाता है
तीव्र स्ट्रोक से सेरेब्रल रक्त प्रवाह में तीव्र कमी होती है, संपार्श्विक वाहिकाओं की भर्ती में बाधा, असामान्य संवहनी अंकुरण और निष्क्रिय एंजियोजेनेसिस होता है, जो खराब स्ट्रोक परिणामों में योगदानदेता है। ईएमएस स्ट्रोक के बाद पेरिलेशनल कॉर्टेक्स में रक्त वाहिका की सतह क्षेत्र और एकीकृत घनत्व को काफी बढ़ाता है (पी < 0.05 बनाम एमसीएओ-केवल; चित्र 3)।

एंजियोजेनिक और न्यूरोमॉड्यूलेटिंग प्रोटीन का विश्लेषण
निर्माता के निर्देशों24 के अनुसार एमसीएओ-केवल बनाम एमसीएओ + ईएमएस चूहों में एमसीएओ में 7 दिन और 21 दिन बाद एंजियोजेनिक और न्यूरोमॉड्यूलेटिंग प्रोटीन की अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए एक माउस एंजियोजेनेसिस सरणी का उपयोग किया गया था। इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग प्रोटीन डॉट ब्लोट के प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए पिक्सेल घनत्व को निर्धारित करने के लिए किया गया था। डेटा को प्रत्येक विश्लेषण किए गए प्रोटीन के घनत्व के अनुपात के रूप में दर्ज किया गया था और प्रत्येक धब्बा के लिए मानकों के औसत घनत्व के रूप में।

फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (एफजीएफ) -अम्लीय को विनियमित किया जाता है और ईएमएस के बाद ओस्टियोपोंटिन को डाउनरेगुलेट किया जाता है
प्रोटीन सरणी के परिणामों ने एफजीएफ-अम्लीय (0.677 ± 0.007 बनाम 0.585 ± 0.014, पी = 0.045), एक शक्तिशाली एंजियोजेनिक कारक, और ओस्टियोपोंटिन के स्तर में कमी, भड़काऊ स्थितियों में व्यक्त एक बहुक्रियाशील अणु (0.692 ± 0.007 बनाम 0.758 ± बनाम 0.014, पी = 0.048) के प्रोटीन स्तर में उल्लेखनीय वृद्धि देखी।

स्ट्रोक के बाद ईएमएस के लिए मृत्यु दर के परिणाम
एमसीएओ और ईएमएस दोनों आक्रामक शल्य चिकित्सा तकनीकें हैं जो चूहों में कुछ मृत्यु दर का कारण बन सकती हैं। इस प्रयोग में, एमसीएओ सर्जरी के 21 दिनों के बाद चूहों में 10% -11% मृत्यु दर थी, जो कि एमसीएओ14 के 60 मिनट के अधीन चूहों के लिए एक स्वीकृत मृत्यु दर है। एमसीएओ के बाद चूहों पर ईएमएस करने से मृत्यु दर में वृद्धि नहीं हुई (चित्रा 4 बी) एमसीएओ के बाद भी ईएमएस सर्जरी की सहिष्णुता का सुझाव देता है।

Figure 1
चित्र 1. मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (एमसीएओ) के बाद चरणवार ईएमएस प्रक्रिया: (ए) चरण 1। एक त्वचा चीरा दाहिने मध्य सेरेब्रल धमनी क्षेत्र पर बनाया जाता है। त्वचा और चमड़े के नीचे के ऊतक परिलक्षित होते हैं, खोपड़ी और लौकिक मांसपेशियों को उजागर करते हैं। चरण 2. अस्थायी मांसपेशी को खोपड़ी से दूर विच्छेदित किया जाता है और उदर रूप से परिलक्षित किया जाता है। चरण 3. एक क्रैनियोटॉमी (4-5 मिमी) किया जाता है और ड्यूरा को धीरे से हटा दिया जाता है। चरण 4. उजागर कॉर्टेक्स को कवर करने के लिए अस्थायी मांसपेशियों को सीधे मस्तिष्क की सतह पर रखा जाता है। चरण 5. अस्थायी मांसपेशियों के पृष्ठीय किनारे को पृष्ठीय त्वचा फ्लैप के चमड़े के नीचे के ऊतक से जोड़ा जाता है, जो मस्तिष्क की सतह के साथ फ्लश होता है। चरण 6. चीरा बंद कर दिया जाता है, और माउस को संज्ञाहरण से हटा दिया जाता है और उसके पिंजरे में वापस कर दिया जाता है। आंकड़े के इस हिस्से को25 से संशोधित किया गया है। (बी) एमसीएओ-प्रेरित स्ट्रोक के एन्सेफलोमायोसिन्जियोसिस (ईएमएस) उपचार के लिए वैचारिक योजनाबद्ध। संक्षिप्तीकरण: एफजीएफ = फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. इम्यूनोस्टेनिंग अध्ययन। (ए) टेम्पोरेलिस मांसपेशी ग्राफ्ट व्यवहार्यता बनाए रखते हैं। इस्केमिक कॉर्टेक्स ऊतक पर टेम्पोरिस मांसपेशी ग्राफ्ट (ईएमएस) उच्च व्यवहार्यता बनाए रखता है। (बाएं) निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (कम)-टेट्राज़ोलियम रिडक्टेस-सना हुआ मांसपेशी ऊतक कोशिकाओं की नियंत्रण से प्रतिनिधि छवि (विपरीत पक्ष से भोली मांसपेशी) और मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (एमसीएओ) + एन्सेफलोमायोसिन्जियोसिस (ईएमएस) सर्जरी के 7 दिनों बाद ग्राफ्टेड मांसपेशी। काला तीर () क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को दर्शाता है। (दाएं) मृत मांसपेशी कोशिकाओं का परिमाणीकरण। ईएमएस के 7 दिनों के बाद मांसपेशियों की कोशिकाएं कुछ हल्की क्षति (पी < 0.1; टी-टेस्ट) दिखाती हैं जो 21 दिनों में पूरी तरह से ठीक हो जाती हैं। (एन = 5 चूहे / समय बिंदु = इस समूह में कुल 10 चूहे) डेटा का मतलब है ± एसडी स्केल बार = 20 μm. (B) ईएमएस सर्जरी के 21 दिन बाद मस्तिष्क प्रांतस्था के साथ ग्राफ्टेड टेम्पोरेलिस मांसपेशी का बंधन। ईएमएस ऊतक एंटी-अल्फा कंकाल मांसपेशी एक्टिन (हरे) और लेक्टिन-डीवाई 594 (लाल; रक्त वाहिका मार्कर) एंटीबॉडी (एन = 3 चूहों) से सना हुआ है। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एन्सेफलोमायोसिन्जिओसिस (ईएमएस) सर्जरी स्ट्रोक के 21 दिन बाद इस्केमिक घावों में रक्त वाहिका घनत्व को बढ़ाती है। (A) चूहों से कोरोनल मस्तिष्क वर्गों की प्रतिनिधि छवियां (बाएं) मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (MCAO) या (दाएं) MCAO + EMS के अधीन हैं और एल. एस्क्युलेंटम (टमाटर) लेक्टिन-Dy594 से सना हुआ है, जो एंडोथेलियल कोशिकाओं के बेसल झिल्ली में ग्लाइकोप्रोटीन को बांधता है। ग्राफ़ परिमाणित क्षेत्र हैं। एमसीएओ + ईएमएस चूहों ने संवहनी अंश क्षेत्र (बी) और एकीकृत घनत्व (सी) जैसे मापदंडों का उपयोग करके उच्च एंडोथेलियम नेटवर्क दिखाया। ** पी < 0.01 (अप्रकाशित टी-टेस्ट), जबकि एमसीएओ-केवल चूहों ने इस्केमिक घाव (डैश्ड लाइन) के करीब नुकसान दिखाया। एन = 5 चूहे / समूह = 10 चूहे कुल। डेटा का मतलब एसडी ± स्केल बार = 100 μm है। संक्षेप: कॉन्ट्रा = विपरीत पक्ष; इप्सी = दूसरा पक्ष। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एन्सेफलोमायोसिनेजियोसिस स्ट्रोक के बाद एंजियोजेनिक प्रोटीन को नियंत्रित करता है। (A) एक माउस एंजियोजेनेसिस सरणी (एआरवाई015) का उपयोग पेरिलेशनल कॉर्टेक्स से मस्तिष्क ऊतक लाइसेट में मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (एमसीएओ) और एमसीएओ + ईएमएस (एमसीएओ के बाद दिन 21) के बाद 53 माउस एंजियोजेनेसिस से संबंधित प्रोटीन के सापेक्ष स्तर का एक साथ आकलन करने के लिए किया गया था। मात्रात्मक विश्लेषण से पता चलता है कि ईएमएस सर्जरी ने ओस्टियोपोंटिन को काफी कम कर दिया और स्ट्रोक के बाद फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ) -अम्लीय प्रोटीन में वृद्धि हुई (* पी < 0.05 या ** पी < 0.01) बनाम एमसीएओ। डेटा एसडी ± मतलब है; n = 3 चूहे/समूह/समय बिंदु = कुल 15 चूहे। (बी) ईएमएस ने स्ट्रोक (एमसीएओ) के बाद मृत्यु दर में वृद्धि नहीं की। कपलान मीयर उत्तरजीविता वक्र से पता चलता है कि ईएमएस + एमसीएओ ने अकेले एमसीएओ (पी = 0.54) बनाम पोस्ट-स्ट्रोक मृत्यु दर में बदलाव नहीं किया। ईएमएस एन = 3 के लिए; MCAO n = 11 के लिए; और MCAO + EMS n = 21 के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल MCAO-प्रेरित स्ट्रोक के माउस मॉडल में एक सफल EMS प्रक्रिया का वर्णन करता है। डेटा से पता चलता है कि ग्राफ्टेड ऊतक व्यवहार्य रहता है और ईएमएस सर्जरी के लंबे समय बाद मस्तिष्क प्रांतस्था के साथ बंधन बना सकता है। ये निष्कर्ष स्ट्रोक की साइट पर धीरे-धीरे एक समृद्ध संवहनी ट्रॉफिक वातावरण विकसित करने के लिए सेरेब्रल मांसपेशी ग्राफ्ट का उपयोग करने के तर्क का समर्थन करते हैं। ईएमएस एक ही वातावरण में संभावित रूप से रोधगलित सेरेब्रल ऊतक की मरम्मत के लिए एक आशाजनक चिकित्सा है।

प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में चरण 2.2.4 शामिल हैं: यह कदम टीएम को अपरिहार्य आघात का कारण बनता है, जो कॉर्टेक्स के साथ बंधन करने और ट्रॉफिक कारकों को छोड़ने की इसकी क्षमता को कम कर सकता है। टीएम आघात को यथासंभव सीमित करने का ध्यान रखें। ऊतक आघात को कम करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति यह है कि टीएम को खोपड़ी से केवल उसकी पृष्ठीय सीमा पर विच्छेदित किया जाए और मायोटॉमी को छोड़ दिया जाए। इस मामले में, टीएम को खोपड़ी से दूर उठा दिया जाएगा (पूरी तरह से प्रतिबिंबित होने के बजाय), और क्रैनियोटॉमी मांसपेशियों के नीचे क्रैनियोटॉमी ड्रिल के साथ किया जाएगा। यह इस चरण को करने के लिए उपलब्ध स्थान की मात्रा को कम करता है लेकिन फिर से टीएम आघात को कम कर सकता है। इसके अलावा, क्रैनियोटॉमी और ड्यूरा के हेरफेर के दौरान अंतर्निहित मस्तिष्क प्रांतस्था को चोट को रोकने के लिए चरण 2.2.5 और 2.2.6 में अत्यधिक देखभाल और अभ्यास आवश्यक है।

यह ईएमएस मॉडल अच्छी तरह से स्थापित एमसीएओ मॉडल के लिए एक प्राकृतिक सहायक है। क्योंकि एमसीएओ मॉडल इस्किमिया और संवहनी नेटवर्क क्षति के पैथोफिज़ियोलॉजी का बारीकी से अनुकरण करता है, जो मानव रोगियों में आम है, एमसीएओ + ईएमएस मॉडल में मनुष्यों के लिए उच्च स्तर की ट्रांसलेबिलिटी होने की संभावना है। यहां प्रस्तुत ईएमएस मॉडल पहला चिकित्सीय हस्तक्षेप है जिसका अध्ययन प्रीक्लिनिकल सेटिंग में इस्केमिक स्ट्रोक के लिए किया गया है जो केवल ऑटोलॉगस ऊतक पर निर्भर करता है। इसके अलावा, क्योंकि टीएम ग्राफ्ट कार्बनिक और ऑटोलॉगस है, यह आसन्न घायल मस्तिष्क के साथ पैराक्रिन सिग्नलिंग इंटरैक्शन का प्रदर्शन कर सकता है जो विभिन्न समय बिंदुओं पर इष्टतम स्तरों पर ट्रॉफिक कारकों की रिहाई को विनियमित करने के लिए काम करता है।

जबकि स्ट्रोक एक प्रोजियोजेनिक वातावरण बनाता है और एंजियोजेनेसिस को उत्तेजित करता है26, आंतरिक पोस्ट-स्ट्रोक प्रतिक्रिया एंजियोजेनिक कारकों के उप-स्तर के कारण क्षतिग्रस्त क्षेत्र में संवहनी आपूर्ति में सुधार के लिए पर्याप्त नहीं है। यहां, ईएमएस ने स्ट्रोक-केवल जानवरों की तुलना में एफजीएफ-अम्लीय प्रोटीन अभिव्यक्ति को और बढ़ाया। यह प्रोटीन अप्रत्यक्ष रूप से अन्य विकास कारकों के साथ मिलकर नियोवैस्कुलराइजेशन को नियंत्रित करता है। एफजीएफ-अम्लीय एक न्यूरोट्रॉफिक कारक के रूप में भी काम करता है, जो न्यूरोप्रोटेक्शन और न्यूरोजेनेसिस27,28 को बढ़ावा देता है। एफजीएफ-अम्लीय के कुछ न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभावएकेटी और एमएपीके / ईपीकेमार्गों के सक्रियण द्वारा मध्यस्थ होते हैं। एफजीएफ के अलावा, प्रोटीन ओस्टियोपोंटिन की अभिव्यक्ति भी कम हो गई थी। ओस्टियोपोंटिन एक प्रो-भड़काऊ, प्लियोट्रोपिक साइटोकिन है जिसे अन्य कार्यों के बीच कई न्यूरोपैथोलॉजी और ऊतक रीमॉडेलिंग प्रक्रियाओं में इसकी भूमिका के लिए तेजी से पहचाना जा रहा है। स्ट्रोक में ओस्टियोपोंटिन की भूमिका अभी भी अनिश्चित है। हालांकि, मनुष्यों में हाल के अध्ययन स्ट्रोक के बाद ओस्टियोपोंटिन को एक खराब रोगसूचक कारक के रूप में इंगित करते हैं। स्ट्रोक के बाद सीरम ओस्टियोपोंटिन के स्तर में कमी को स्ट्रोक31 वाले मानव रोगियों में अनुकूल परिणामों (संशोधित रैंकिन स्केल स्कोर < 90 दिनों में 2) की भविष्यवाणी करने के लिए एक अध्ययन में दिखाया गया था। एक अन्य अध्ययन ने प्लाज्मा ओस्टियोपोंटिन के उच्च स्तर और स्ट्रोक32 के बाद मानव रोगियों में मृत्यु और विकलांगता के परिणामों के बीच खुराक-निर्भर संबंध दिखाया। इन नैदानिक अध्ययनों के अनुरूप, यहां डेटा से पता चलता है कि ईएमएस के बाद ओस्टियोपोंटिन कम होने से नव-पोत गठन को बढ़ाने के लिए विरोधी भड़काऊ वातावरण को बढ़ावा मिल सकता है। कुल मिलाकर, एफजीएफ-अम्लीय और ओस्टियोपोंटिन की अंतर अभिव्यक्ति इस माउस मॉडल में ईएमएस के बाद एंजियोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाले तंत्र की ओर इशारा करती है और इस संभावना को बढ़ाती है कि प्रक्रिया जो एंजियोजेनेसिस के अलावा न्यूरोप्रोटेक्शन और न्यूरो-पुनर्जनन भी ला सकती है।

इस प्रक्रिया की कुछ संभावित सीमाएं हैं। रक्त वाहिका घनत्व में वृद्धि के कारण सेरेब्रल प्रवाह को मापना इस प्रक्रिया में चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि लेजर डॉपलर या लेजर स्पॉट फ्लोमीटर की आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली प्रक्रियाएं कॉर्टेक्स के शीर्ष पर अस्थायी मांसपेशियों की उपस्थिति से प्रभावित होती हैं जो कॉर्टिकल सतह पर सही रक्त माप को रोकती हैं। इस प्रकार, इस प्रक्रिया को अधिक परिष्कृत, लेकिन शायद ही कभी उपलब्ध, छोटे कृंतक एमआरआई स्कैन की आवश्यकता हो सकती है यदि वास्तविक समय प्रवाह माप की आवश्यकता होती है। हालांकि, रक्त वाहिका घनत्व माप का उपयोग अप्रत्यक्ष रूप से हमारे डेटा द्वारा सुझाए गए एंजियोजेनेसिस में सुधार करने में ईएमएस प्रक्रिया की सफलता का समर्थन करता है। एक और सीमा एमसीएओ के शीर्ष पर ईएमएस हस्तक्षेप की आक्रामक प्रकृति है, जो स्वयं एक आक्रामक प्रक्रिया है। हालांकि केवल एमसीएओ की तुलना में इस अध्ययन में ईएमएस के साथ मृत्यु दर में कोई वृद्धि नहीं हुई थी, हेमिक्रेनेक्टोमी की आवश्यकता सभी प्रकार के स्ट्रोक के लिए इसकी भविष्य की ट्रांसलैटेबिलिटी को सीमित कर सकती है। हालांकि, नैदानिक अभ्यास में, बड़े इस्केमिक स्ट्रोक वाले >10% रोगियों को बढ़े हुए इंट्राक्रैनील दबाव23 का प्रबंधन करने के लिए हेमिक्रेनेक्टोमी की आवश्यकता होती है, और इस ईएमएस मॉडल में विशेष रूप से स्ट्रोक रोगियों के इस उपसमूह के लिए ट्रांसलेशनल मूल्य हो सकता है। अंत में, ईएमएस के प्रदर्शन के लिए 4 घंटे के पोस्ट-एमसीएओ के समय बिंदु को अधिकांश मानव रोगियों के लिए आरटी-पीए की मानक उपचार खिड़की के भीतर आने के लिए चुना गया था, हालांकि भविष्य के अध्ययन ईएमएस के लिए चिकित्सीय खिड़की का मूल्यांकन करने के लिए बाद के समय बिंदुओं का उपयोग करेंगे।

कुल मिलाकर, ईएमएस मॉडल इस्केमिक स्ट्रोक के बाद एंजियोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए एक अच्छी तरह से सहन किया जाने वाला विकल्प प्रदान करता है, और इसके संभावित नैदानिक अनुवाद के अलावा, स्ट्रोक और एंजियोजेनेसिस के पैथोफिज़ियोलॉजी की जांच करने वाले भविष्य के अध्ययनों में उपयोग किया जा सकता है।

यहां वर्णित ईएमएस मॉडल प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए सेरेब्रल एंजियोजेनेसिस को प्राप्त करने का एक सुरक्षित तरीका प्रदान करता है, फार्माकोलॉजिकल हस्तक्षेप की आवश्यकता को कम करता है, जो अक्सर अवांछित दुष्प्रभाव या अनियंत्रित एंजियोजेनेसिस का कारण बनता है। बड़े इस्केमिक स्ट्रोक वाले कई रोगियों को बढ़ते इंट्राक्रैनील दबाव का प्रबंधन करने के लिए अपने नैदानिक पाठ्यक्रम के दौरान हेमिक्रॉनेक्टोमी की आवश्यकता होती है। यह ईएमएस प्रक्रिया, जिसमें मांसपेशियों की ग्राफ्टिंग के लिए चूहों में हेमिक्रेनेक्टोमी भी शामिल है, इस्केमिक स्ट्रोक में ईएमएस के ट्रांसलेशनल अनुप्रयोग के लिए अवधारणा का प्रीक्लिनिकल प्रमाण प्रदान कर सकती है। इसलिए, इस मॉडल में इस्केमिक स्ट्रोक के बाद न्यूरोवास्कुलर रिकवरी के ज्ञान का विस्तार करने और नवाचार के विकास को सुविधाजनक बनाने की क्षमता है, जो स्ट्रोक से बचे लोगों के लिए चिकित्सीय में समय की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को रिसर्च एक्सीलेंस प्रोग्राम-यूकॉन हेल्थ (केतन आर बुलसारा और राजकुमार वर्मा को) और यूकॉन हेल्थ स्टार्ट-अप (राजकुमार वर्मा को) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 monocryl suture Ethilon 697G
70% ethanol to sanitize operating surface Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution Midwest Vet
Clamps for tissue retraction Roboz
Doccal suture with silicone coating Doccal Corporation 602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2 Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat R& D biotech ARY015
Needle driver Ethilon
Ointment for eye protection Walgreens
Operating microscope Olympus
Operating surface Olympus
Povidone iodine solution Walgreens
Rectal thermometer world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation Walgreens
Small electric razor to shave operative site Generic
Surgical scissors Roboz

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References

  1. Stroke, Last updated 10/22/20. , Accessed 11/12/20. https://www.cdc.gov/stroke/index.htm (2020).
  2. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
  3. Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
  4. Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
  5. Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
  6. Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
  7. Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
  8. Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
  9. Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
  10. Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
  11. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
  12. Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
  13. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  14. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
  15. Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
  16. Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
  17. Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
  18. Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
  19. Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
  20. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
  21. Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
  22. Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
  23. Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P. Managing malignant cerebral infarction. Current Treatment Options in Neurology. 13 (2), 217-229 (2011).
  24. Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
  25. Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
  26. Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
  27. Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
  28. Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
  29. Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
  30. Meller, R., et al. Neuroprotection by osteopontin in stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (2), 217-225 (2005).
  31. Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
  32. Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 184
चूहों में मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा-प्रेरित स्ट्रोक के बाद एन्सेफलोमायोसिनेंगोसिस उपचार के लिए एक मॉडल
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Paro, M. R., Gamiotea Turro, D., Mcgonnigle, M., Bulsara, K. R., Verma, R. A Model for Encephalomyosynangiosis Treatment after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (184), e63951, doi:10.3791/63951 (2022).

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