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Artículo de método

Anestesia e intubación de cachorros de ratón preadolescentes para cirugía cardiotorácica

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DOI:

10.3791/64004

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2 de junio de 2022

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1Molecular Cardiology and Biophysics Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent’s Clinical School, University of New South Wales Sydney, 3Department of Anaesthesia, The Children’s Hospital at Westmead, 4School of Child and Adolescent Health, University of Sydney

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los modelos quirúrgicos cardiotorácicos en ratones de >7 días de edad requieren intubación, pero esto es un desafío para las crías de ratón preadolescentes (8-14 días de edad) y hay poca información sobre los regímenes anestésicos para la intubación. Aquí, presentamos regímenes de dosificación de ketamina / xilazina / atropina en crías de ratón C57BL / 6J de 10 días de edad que permiten la intubación endotraqueal, al tiempo que minimizan la mortalidad animal.

Resumen

Los modelos quirúrgicos murinos juegan un papel importante en la investigación preclínica. Los conocimientos mecanicistas sobre la regeneración miocárdica después de una lesión cardíaca se pueden obtener de modelos de cirugía cardiotorácica en ratones de 0 a 14 días de edad, cuyos cardiomiocitos, a diferencia de los adultos, conservan la capacidad proliferativa. Las crías de ratón de hasta 7 días de edad son efectivamente inmovilizadas por hipotermia y no requieren intubación para cirugía cardiotorácica. Sin embargo, los cachorros de ratón preadolescentes (8-14 días de edad) requieren intubación, pero esto es un desafío y hay poca información sobre la anestesia para facilitar la intubación. Aquí, presentamos regímenes de dosificación de ketamina / xilazina / atropina en crías de ratón C57BL / 6J de 10 días de edad que permiten la intubación endotraqueal, al tiempo que minimizan la mortalidad animal. La titulación empírica de los regímenes de dosificación de ketamina/xilazina/atropina al peso corporal indicó que la respuesta a la anestesia de crías de ratón de diferentes pesos no fue lineal, por lo que dosis de 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg y 50/6/0,18 mg/kg facilitaron la intubación de crías que pesaban entre 3,15-4,49 g (n = 22), 4,50-5,49 g (n = 20) y 5,50-8,10 g (n = 20), respectivamente. Los cachorros de menor peso corporal requirieron más intentos de intubación que los cachorros más pesados (p < 0,001). La supervivencia después de la intubación se correlacionó con el peso corporal (59%, 70% y 80% para los grupos de bajo, medio y alto peso, respectivamente, R2 = 0,995). Para la cirugía de infarto de miocardio después de la intubación, se indujo un plano quirúrgico de anestesia con isoflurano al 4,5% en oxígeno al 100% y mantenido con isoflurano al 2% en oxígeno al 100%. La supervivencia después de la cirugía fue similar para los tres grupos de peso al 92%, 86% y 88% (p = 0,91). Junto con los refinamientos en las prácticas de manejo de animales para la intubación y la cirugía, y la minimización de la canibalización por la madre después de la cirugía, la supervivencia general para todo el procedimiento (intubación más cirugía) se correlacionó con el peso corporal (55%, 60% y 70% para los grupos de bajo, medio y alto peso, respectivamente, R2 = 0.978). Dada la dificultad encontrada con la intubación de cachorros de 10 días de edad y la alta mortalidad asociada, recomendamos que la cirugía cardiotorácica en cachorros de 10 días se limite a cachorros que pesen al menos 5,5 g.

Introducción

Los modelos murinos son herramientas invaluables en la investigación cardiotorácica preclínica, en particular debido a la facilidad con la que se pueden generar líneas de ratón genéticamente modificadas, y también la facilidad con la que los ratones pueden ser manipulados quirúrgicamente para proporcionar modelos patológicos de enfermedades que permitan, por ejemplo, el estudio de la regeneración miocárdica después de una lesión cardíaca1 . En este sentido, es interesante que, a diferencia de los ratones adultos en los que los cardiomiocitos se han retirado del ciclo celular, los corazones de ratón neonato de 0-2 días de edad se reparan con cicatrices mínimas después de la resección apical o la inducción del infarto de miocardio 2,3,4. En contraste, los corazones neonatales de 7 días de edad se regeneran de manera incompleta con una mayor incidencia de cicatrices 2,3. Dado que los cardiomiocitos en el ápice del ventrículo izquierdo conservan la capacidad proliferativa hasta 2 semanas después del nacimiento, los estudios mecanicistas de regeneración después de una lesión cardíaca en ratones de 0 a 14 días de edad pueden ser informativos para identificar objetivos terapéuticos para la regeneración del corazón adulto lesionado5.

El desarrollo de modelos de ratón de lesión cardíaca implica la manipulación quirúrgica bajo anestesia. Esto requiere que el tórax se abra para acceder al corazón, lo que generalmente requiere intubación y ventilación mecánica. La cepa del ratón, el peso corporal y la edad influyen en la sensibilidad a los anestésicos6. Los ratones adultos pueden ser anestesiados con una amplia gama de agentes, siendo un régimen común para la intubación la ketamina/xilazina/atropina a 100/13/0,5 mg/kg 6,7. Los ratones neonatos (0-7 días de edad) carecen de un reflejo de dolor centralizado, y pueden ser efectivamente inmovilizados en hielo y sometidos a cirugía sin intubación 6,8,9. Las crías de ratón preadolescentes (8-14 días de edad) no pueden ser anestesiadas con hipotermia 9,10; Requieren intubación para cirugía cardiotorácica. No existen estudios previos sobre cirugía cardiotorácica en ratones preadolescentes de menos de 14 días de edad. En nuestra experiencia, la intubación de ratones preadolescentes anestesiados con isoflurano menores de 14 días de edad es difícil. El régimen anestésico inyectable recomendado para ratones mayores de 7 días es de 50-150 mg/kg de ketamina y 5-10 mg/kg de xilazina10. Los ratones preadolescentes todavía se están desarrollando neurológicamente y sus respuestas a los medicamentos y al metabolismo de los medicamentos son muy diferentes de las de los animales adultos6. Esto plantea un mayor riesgo de desequilibrio de líquidos, electrolitos y ácido-base, así como hipoglucemia e hipotermia debido no solo a su alta tasa metabólica, que agota rápidamente sus limitadas reservas de energía, sino también debido a su inmadurez termorreguladora 6,11,12. Por lo tanto, hay poca información sobre los regímenes anestésicos que facilitan la intubación y maximizan la supervivencia de los ratones preadolescentes.

Aquí titulamos empíricamente los regímenes de dosificación de ketamina / xilazina / atropina en cachorros de ratón C57BL / 6J de 10 días de edad que varían en peso de 3-8 g para lograr un plano de anestesia suficiente para permitir la intubación endotraqueal para la cirugía cardiotorácica posterior, al tiempo que minimizamos la mortalidad animal. También refinamos las prácticas de manejo de animales para reducir la mortalidad por intubación, cirugía y canibalismo materno posquirúrgico.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital Garvan/St Vincent de acuerdo con el Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos y las pautas ARRIVE, y todos los experimentos fueron realizados por un cirujano experimentado en animales pequeños (JW) con la guía de un anestesista pediátrico (JJS).

1. Preparación de instrumentos

  1. El día de la cirugía, instale un equipo especializado para la intubación de cachorros de 10 días de edad (Figura 1A, B). Esto incluye una lámpara de calentamiento, una plataforma de intubación, luz de fibra óptica, pinzas pequeñas, un laringoscopio formado por una pieza de alambre de cobre de 0,02 mm de diámetro (60 mm de longitud con el extremo del cable formado en un círculo de 3 mm de diámetro en un ángulo de 175°; Figura 1B), y una cánula intravenosa de plástico (i.v.) calibre 24, que se utiliza como tubo endotraqueal.
  2. Asegúrese de que la cánula consiste en un tubo de plástico de 19 mm de largo (0,7 mm de diámetro exterior) conectado a un adaptador de bloqueo luer hembra de plástico de 21 mm (Figura 1B). Endurezca el tubo de la cánula insertando un trozo de alambre de cobre a través del adaptador de bloqueo luer. Utilice una cánula con un volumen total de 130 μL para un ratón con un volumen corriente de ~8 μL/g13,14.

2. Anestesia de ratones de 10 días de edad

  1. El día de la cirugía, retire la presa de una jaula de cachorros C57BL/6J de 10 días de edad y coloque la jaula en una almohadilla de calentamiento (37 °C).
  2. Anestesiar a las crías con 10 μL por g de peso corporal en inyección intraperitoneal utilizando una jeringa de insulina de 0,5 ml y una aguja de 29 G con ketamina/xilazina/atropina en las proporciones detalladas en la Tabla 1 para diferentes grupos de peso.
  3. Inmediatamente después de la inyección, coloque el cachorro en una cámara de plexiglás calentada (37 °C) que haya sido preoxigenada con oxígeno al 100%.

3. Intubación de ratones de 10 días de edad

  1. Después de 3-4 minutos de oxigenación, transfiera el cachorro a una plataforma para la intubación esencialmente como para ratones adultos. Realice esto con el cachorro en posición supina (Figura 1C) o suspendido en un ángulo de 45 °15. Mantenga la temperatura con una lámpara de calentamiento.
    1. Antes de la intubación, evalúe la profundidad de la anestesia por el reflejo de pellizco de la pata. Para una intubación óptima, el reflejo de pellizco de la pata debe estar presente, pero notablemente reducido del de un animal consciente.
  2. Después de asegurar el cachorro anestesiado en decúbito supino a una plataforma de intubación (Figura 1C), sostenga la lengua con pequeños fórceps y use un laringoscopio hecho de un trozo de alambre de cobre (Figura 1B) para exponer la glotis y las cuerdas vocales. Ayuda a la visualización de las cuerdas vocales mediante transiluminación con una luz flexible de fibra óptica (Figura 1D).
  3. Usando una cánula rígida, incline la cánula de modo que el extremo de bloqueo luer sea ligeramente más bajo (~ 10 °) que la punta, y tan pronto como las cuerdas vocales se separen, inserte la cánula y avance hasta que el adaptador de bloqueo luer esté justo fuera de la boca. Retire el alambre inmediatamente después de la intubación.
    NOTA: No se espera resistencia durante la intubación en ratones de esta edad a menos que la cánula esté demasiado avanzada y se sienta resistencia de la carina.
    1. Evaluar la profundidad de la anestesia después de la intubación por la capacidad del animal para respirar espontáneamente. Confirme la intubación traqueal exitosa de las crías que respiran espontáneamente bloqueando brevemente el catéter de intubación para verificar que esto impida el movimiento del pecho.
  4. Transfiera inmediatamente el cachorro intubado a una almohadilla de calentamiento (37 °C) y conecte la cánula endotraqueal a un ventilador que suministre oxígeno al 100% a un caudal de 1 L/min con 30 μL/carrera, 40 μL/carrera o 50 μL/carrera para 3,15-4,59 g, 4,50-5,49 g o 5,50-8,10 g cachorros, respectivamente, y 150 golpes/min.
  5. Realice estos procedimientos rápidamente, dentro de <15 s para minimizar la reinhalación.

4. Cirugía de infarto de miocardio en ratones de 10 días de edad

  1. Para inducir un plano quirúrgico de anestesia para la cirugía, cambie el gas que fluye hacia el ventilador de 100% de oxígeno a 4.5% de isoflurano en oxígeno (la concentración de isoflurano está determinada por un vaporizador) durante 4-5 minutos.
    1. Después de cambiar a isoflurano, confirme nuevamente la intubación traqueal verificando que la frecuencia de movimiento de la pared torácica sea igual a la del ventilador. La pérdida de la respiración espontánea seguida de la ausencia de un reflejo de pellizco de la cola o la pata indica que se ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia (después de 4-5 min).
  2. Mantener la anestesia con isoflurano al 2% en oxígeno.
  3. Realizar cirugía de infarto de miocardio bajo un microscopio quirúrgico (objetivo 10x y 16x) como se describe en16.
    1. Desinfecte la piel con movimientos circulares varias veces con rondas alternas de un exfoliante a base de yodo o clorhexidina y alcohol al 70%. Con unas tijeras finas, haga una incisión horizontal en la piel entre la tercera y cuarta costilla (cuarto espacio intercostal) en la pared lateral izquierda del tórax. Usando fórceps finos, abra el tórax mediante una disección roma del espacio intercostal y use un retractor para mantener el espacio abierto.
    2. Inducir un infarto de miocardio mediante ligadura de la arteria coronaria izquierda justo distal al apéndice auricular izquierdo con sutura de monofilamento de polipropileno 9-0. Después de la cirugía de infarto de ~ 10 minutos, cierre la piel con prolene 7-0 y desinfecte la incisión con betadine. Limpie el cachorro de sangre con 70% de etanol o solución salina.
      NOTA: La ligadura de la arteria coronaria izquierda en cachorros preadolescentes es esencialmente sin sangre, como lo es con las ligaduras de adultos.
    3. Administrar uno tras otro con una jeringa de insulina de 0,5 ml y una aguja de 29 G: atipamezol (1-5 mg/kg, 10 μL, intraperitoneal) para una rápida recuperación de la sedación, analgesia (buprenorfina, 0,075 mg/kg, 10 μL, subcutánea) y solución salina (50 μL, intraperitoneal).
  4. Permita que los animales se recuperen suspendiendo el isoflurano. Asegúrese de que la respiración espontánea se reanude dentro de unos minutos después.
    1. Devuelva al cachorro a la cámara preoxigenada calentada y monitoree continuamente durante la recuperación hasta que se recupere el reflejo de enderezamiento, momento en el que extube al cachorro.
    2. Frote suavemente al cachorro con ropa de cama de jaula casera, mantenga al cachorro caliente, verifique que la respiración sea regular y que el cachorro sea capaz de moverse espontáneamente. Esto reducirá el canibalismo postoperatorio por parte de la presa.
  5. Devuelva la presa a la jaula cuando todos los cachorros se hayan recuperado completamente de la anestesia.
    NOTA: El tiempo total necesario para la preparación, anestesia, intubación, cirugía y recuperación de un cachorro puede variar de 40 a 60 minutos.
  6. La presa doméstica y los cachorros durante la noche en una jaula colocada mitad encendida / mitad fuera de una almohadilla de calentamiento a 37 ° C.

5. Evaluación postoperatoria del tamaño del infarto

  1. En el3er día después de la cirugía, anestesiar a los cachorros colocándolos en una cámara de plexiglás preequilibrada con isoflurano al 4,5% en oxígeno a una tasa de flujo de 1 ml / min.
  2. Una vez que se haya alcanzado un plano quirúrgico de anestesia (después de 4-5 min), evaluado por el reflejo de pellizco de la pata, retire al cachorro de la cámara y asegúrelo en posición supina en una almohadilla de calentamiento con cinta adhesiva en la cola.
  3. Coloque un hilo sobre los incisivos y cinta adhesiva en su posición para mantener la cabeza extendida y coloque la cabeza en un cono nasal conectado a un ventilador que suministre isoflurano al 4,5% en oxígeno a 200 μL / carrera, 150 golpes / min. Mantener un plano quirúrgico de anestesia con isoflurano al 2% en oxígeno.
  4. Desinfectar la piel con etanol al 70%. Con tijeras finas, haga una incisión de 1 cm en la piel sobre la arteria carótida común derecha a lo largo de la tráquea y cannule el vaso expuesto con un tubo de polietileno de un solo lumen (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) para administrar 0.2 ml de solución salina heparinizada (200 U) durante 1 minuto para prevenir la coagulación de la sangre.
  5. Aumentar el isoflurano al 4,5% en oxígeno durante 1 minuto antes de administrar rápidamente 0,2 ml de 3,3 M KCl en 2 s para detener el corazón en la diástole.
  6. Diseccionar la vena yugular derecha a través de la misma incisión y transectarla. Perfundir el corazón con 0,2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), y luego perfundir con 0,1 ml de azul alciano al 0,2% para teñir el miocardio remoto no infartado. Verifique la perfusión exitosa, evidenciada por el lavado de sangre, PBS y luego Alcian Blue a través de la vena yugular.
  7. Abra el tórax y extirpe el corazón diseccionando el tejido conectivo circundante y los vasos para liberar el corazón. Enjuague el corazón en PBS, retire las aurículas si lo desea y fotografíe el corazón con una cámara montada en un microscopio quirúrgico utilizando un objetivo 10x.

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Resultados

Anestesia de ratones de 10 días de edad. Los cachorros de 10 días pueden ser anestesiados con isoflurano al 4,5% en 4-5 min; sin embargo, se recuperan de la anestesia en el proceso de preparación para la intubación. Debido a su pequeño tamaño, la intubación bajo anestesia con isoflurano administrada por un cono nasal estándar no es factible. Anteriormente hemos utilizado un régimen anestésico ketamina/xilazina/atropina de 100/13/0,5 mg/kg, respectivamente, para cirugía cardiotorácica en cachorros de 15 y...

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Discusión

Actualmente, no existen métodos bien documentados para la anestesia y la intubación de ratones de 10 días de edad para cirugía cardiotorácica. Con este fin, hemos titulado los regímenes de dosificación de ketamina / xilazina / atropina al peso corporal, por lo que las dosis de 20/4/0.12 mg / kg, 30/4/0.12 mg / kg y 50/6/0.18 mg / kg facilitaron la intubación de cachorros con bajo (3.15-4.49 g), medio (4.50-5.49 g) y alto (5.50-8.10 g) peso corporal, respectivamente. La supervivencia después de la intubación se correlacio...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por NHMRC Program Grant [ID 1074386], una subvención de Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research [RMG] y una subvención de RT Hall Trust [RMG & SEI].

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Atipamezol (Antisedan)Provet (NSW) Pty LtdATIP I
Atropina 600 mcg/mLClifford Hallam Healthcare Pty Ptd1957699 PFIZER-0143386
BetadineLivingstone InternationalBU0520
Buprenorfina (Temgesic)Provet (NSW) Pty LtdTEMG I
Luz de fibra ópticaLeica 3011350CLS 150X
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersión 9.1.2
Plataforma de intubación --Cualquier caja resistente (por ejemplo, caja de punta de plástico) con dimensiones aproximadas 12 (L) x 8,5 x (W) x 7,5 cm (H)
IsofluranoProvet (NSW) Pty LtdISOF 07
Ketamina 100 mg/mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1
Cánula intravenosa de plástico calibre 24 Polywin Safety BD Insyte CE0086Tubo de plástico de 19 mm de longitud (diámetro exterior de 0,7 mm) unido a un adaptador de bloqueo Luer hembra de plástico de 21 mm; volumen total de anillo 130 μ L
Tubo de polietileno de un solo lumenCritchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSWDiámetro exterior 0,61 mm, diámetro interior 0,28 mm
Pinzas pequeñasF.S.T.NO 11051-10
Microscopio quirúrgico (cámara opcional)Leica M651 (cámara Leica IC80 HD)Objetivo 10x y 16x
Sutura 7-0 proleneEthicon8708H
Sutura 9-0 monofilamento de polipropilenoEthicon2813
V-1 Tablero de mesa con Active Scavenging sistema de anestesia isofluranoVetEquip901820
Cámara de inducción de plexiglás ventilada de 2 litrosVetQuip Pty Ltd942102 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H)
Lámpara de calentamientoBrilant Lighting99223
XylazineProvet (NSW) Pty LtdXYLA Z 2

Referencias

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