Pruebas de detección del SARS-CoV-2 a gran escala que utilizan muestras de saliva y transposición

Joseph R. Patterson; Allyson Cole-Strauss; Nathan Kuhn; Carlene Mercier; Joseph Kochmanski; John A. Gerlach; Rhiannon M. LeVeque; Kerri A. Neugebauer; Kayla N. Conner; Jasper Gomez; Mark G. Hennes; Kaje’ne E. Thompson; Destinee L. Rytlewski; Chloe C. Bigwood; Amy Scharmen; Gabriel Simjanovski; Cassidy Riley; Jessica Donaldson; Dilann Yasin; Najwa Kouja; Zaria Contejean; Michaela Burnett; Shakhlo Aminova; Nat Ato Yawson; Simran B. Singh; Osama M. Alian; Carson D. Broeker; Erin K. Zaluzec; Morgan ONeill; Birgit Puschner; Aron Sousa; Laura Bix; Brian Jespersen; Claudia Holzman; Jade Mitchell; Ryan Julien; Yesim Askin; Danielle Barnes; Purna Durshanpalli; Doug Krum; Rett Weber; Morgan Patterson; Becky Anderson; Ryan Hunt; Benjamin O’Brien; Andrew Umstead; John S. Beck; Irving E. Vega; Caryl E. Sortwell; Jack W. Lipton

doi:10.3791/64008

Method Article

Pruebas de detección del SARS-CoV-2 a gran escala que utilizan muestras de saliva y transposición

DOI:

10.3791/64008

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June 23rd, 2022

Joseph R. Patterson¹^,²^,³ , Allyson Cole-Strauss¹^,²^,³ , Nathan Kuhn¹^,² , Carlene Mercier³^,⁴ , Joseph Kochmanski¹^,² , John A. Gerlach⁵ , Rhiannon M. LeVeque³^,⁴ , Kerri A. Neugebauer³^,⁴^,⁶ , Kayla N. Conner³^,⁴ , Jasper Gomez³^,⁴ , Mark G. Hennes³^,⁴ , Kaje’ne E. Thompson³^,⁴ , Destinee L. Rytlewski³^,⁴ , Chloe C. Bigwood³^,⁴ , Amy Scharmen³^,⁴ , Gabriel Simjanovski³^,⁴ , Cassidy Riley³^,⁴ , Jessica Donaldson³^,⁴ , Dilann Yasin³^,⁴ , Najwa Kouja³^,⁵ , Zaria Contejean³^,⁴ , Michaela Burnett³^,⁴ , Shakhlo Aminova³^,⁴ , Nat Ato Yawson³^,⁴^,⁷ , Simran B. Singh³^,⁴ , Osama M. Alian³^,⁴ , Carson D. Broeker³^,⁴^,⁸ , Erin K. Zaluzec³^,⁴^,⁷ , Morgan ONeill³^,⁴^,⁹ , Birgit Puschner¹⁰ , Aron Sousa² , Laura Bix¹¹ , Brian Jespersen² , Claudia Holzman¹² , Jade Mitchell¹³ , Ryan Julien¹³ , Yesim Askin¹⁴ , Danielle Barnes¹⁴ , Purna Durshanpalli¹⁴ , Doug Krum¹⁴ , Rett Weber¹⁴ , Morgan Patterson¹⁴ , Becky Anderson¹⁴ , Ryan Hunt¹⁴ , Benjamin O’Brien¹⁴ , Andrew Umstead¹^,² , John S. Beck¹^,² , Irving E. Vega¹^,² , Caryl E. Sortwell¹^,² , Jack W. Lipton¹^,²

Summary

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El protocolo pretende servir de modelo para las universidades y otras organizaciones que estén considerando realizar pruebas a gran escala para el SARS-CoV-2 o desarrollar planes de preparación para futuros brotes virales.

Abstract

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La identificación y el aislamiento de las personas contagiosas, junto con la cuarentena de los contactos cercanos, son fundamentales para frenar la propagación del COVID-19. Las pruebas a gran escala en calidad de vigilancia o cribado de portadores asintomáticos de COVID-19 proporcionan tanto datos sobre la propagación viral como la capacidad de seguimiento para realizar pruebas rápidamente a las personas durante los brotes sospechosos. El programa de detección temprana de COVID-19 de la Universidad Estatal de Michigan ha estado utilizando pruebas a gran escala en calidad de vigilancia o detección desde el otoño de 2020. Los métodos adaptados aquí aprovechan la fiabilidad, el gran volumen de muestra y los beneficios de la autorecolección de la saliva, junto con un esquema de agrupación bidimensional rentable y conservador de reactivos. El proceso fue diseñado para ser adaptable a la escasez de suministros, con muchos componentes de los kits y el ensayo fácilmente sustituibles. Los procesos descritos para recolectar y procesar muestras de SARS-CoV-2 se pueden adaptar para analizar futuros patógenos virales expresados de manera confiable en la saliva. Al proporcionar este plan para las universidades u otras organizaciones, se pueden desarrollar planes de preparación para futuros brotes virales.

Introduction

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La pandemia de COVID-19, causada por el virus SARS-CoV-2, ha causado la muerte de más de 6,2 millones de personas hasta la fecha, y las cifras aumentan cada día¹. El estándar de oro de las pruebas para el SARS-CoV-2 es la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-q), con cebadores diseñados para dirigirse al genoma viral, como los genes de nucleocápside, envoltura, espícula y ARN polimerasa^dependiente de ARN 2. Al comienzo de la pandemia, la capacidad suficiente para realizar pruebas de detección del SARS-CoV-2 era muy escasa. Surgió de la falta de ensayos validados, componentes de prueba, per....

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Protocol

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Los estudios realizados para optimizar los métodos del Programa de Detección Temprana fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Estatal de Michigan. Todas las figuras fueron reproducidas con muestras artificiales y son representativas de los resultados humanos observados. Ningún dato, información o resultado que se muestra en el manuscrito proviene de ningún participante del Programa de Detección Temprana de la Universidad Estatal de Michigan.

1. Producción de kits

NOTA: Durante el armado del kit, use mascarillas, guantes, protección....

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Results

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La gran mayoría de las muestras recibidas por el laboratorio hasta la fecha han sido aceptadas y han pasado el paso inicial de control de calidad visual. La necesidad de rechazar una muestra se limita a razones que pueden influir negativamente en el procesamiento de la muestra y/o en los resultados generales de la misma. Específicamente, el volumen incorrecto en el tubo, la consistencia o el color no natural de la saliva, la ausencia de perlas de cerámica utilizadas para ayudar en la homogeneización de la muestra y la fa.......

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Discussion

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Durante el procesamiento de muestras, hay pasos que requieren una atención cuidadosa. El paso inicial de control de calidad, que analiza el volumen de la muestra, la consistencia, el color y la presencia de perlas agregadas, es fundamental para el éxito general del proceso. Los tubos con muestras que no contienen la cantidad correcta de saliva podrían producir un falso negativo, ya que muy poca saliva daría como resultado que no haya suficiente material genético; por el contrario, demasi.......

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Disclosures

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Los autores no tienen información financiera sobre los métodos, suministros, equipos o reactivos.

Acknowledgements

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Los autores desean agradecer a los participantes en los estudios aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Estatal de Michigan utilizados para optimizar los métodos (STUDY00004265, STUDY00004383, STUDY00005109), así como a aquellos que salieron a recolectar muestras utilizadas para probar los métodos (Dra. Katie Miller, Anna Stoll, Brian Daley, Dra. Claudia Finkelstein). Este esfuerzo contó con el apoyo de la Universidad Estatal de Michigan.

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
1 paso MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
1,2 mlPlacas de pozo profundo	Fisher	AB0564
Depósitos de reactivos de 100 mL	Corning	4872
2,8 mm Perlas de cerámica	OMNI	19-646
25 ml cónico con tapón de rosca	VWR	76338-496
50 ml Depósitos de fondo en V Costar		4870
5430-Centrífuga de alta velocidad	Eppendorf	22620601
5 ml Eppendorf Tubo	Fisher	14282300
8 tubos de tiras para tecnologías de vida QuantStudio		4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher
Ethanol 200 Proof, Grado de Biología Molecular	Fisher BP28184
Microamp Endura Optical Placa de reacción clara rápida de 96 pocillos con tecnologías de vida útil de códigos de barras		4483485
Microamp Fast Optical Placa de 96 pocillos	Fisher	4346906
Mini Microcentrífuga	Corning Medical	6770
Tapas ópticas para tubos de tira	Technologies	AB-1820
Película óptica	Thermo Fisher
Película de sellado de placa PCR No óptica	Fisher	AB-0558
Placa de PCR con semifaldón	Sistema
QuantStudio 3, 96 pocillos, 0,1 ml	Thermo Fisher	A28136
Confirmación del kit viral de ARN rápido	Zymo	R1035
, 100 ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Bolsas Pequeñas de Riesgo Biológico	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19 kit	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrífuga	Thermo Fisher	75009525
Transfer Fisher	Fisher	22170404
Viral 96	Kit Zymo	R1041
Mezclador de vórtice	Fisher	2215414

AC125472500 Life 4311971 de PCR en tiempo real Fisher 14230244 Depósito de reactivos

References

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WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , Available from: https://covid19.who.int/ (2022).
John Hopkins Center for Health Security. Center for Health Security. Comparison of National RT-PCR primers, probes, and protocols for SARS-CoV-2 diagnostics. John Hopkins Center for Health Security. , Centerforhealthsecurity.Org 5(2020).
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