Andamios 3D macroporosos interconectados de varillas de microgel

Summary

Las varillas de microgel con grupos reactivos complementarios se producen a través de microfluídica con la capacidad de interconectarse en solución acuosa. Los microgeles anisómetros se atascan y se entrelazan en construcciones estables con poros más grandes en comparación con los sistemas de base esférica. Los microgeles modificados con GRGDS-PC forman construcciones 3D macroporosas que se pueden utilizar para el cultivo celular.

Abstract

Un sistema de dos componentes de microgeles funcionalizados de microfluídica permite una rápida interconexión en construcciones macroporosas 3D en soluciones acuosas sin aditivos adicionales. La gelificación continua fotoiniciada en chip permite la variación de la relación de aspecto del microgel, que determina las propiedades del bloque de construcción para las construcciones obtenidas. Los monómeros de metacrilato de glicidil (GMA) o metacrilato de 2-aminoetilo (AMA) se copolimerizan en la red de microgel basada en polímeros estrella de polietilenglicol (PEG) para lograr la funcionalidad epoxi o amina. Se introduce un flujo de aceite de enfoque en la estructura de salida microfluídica para garantizar la recolección continua de las varillas de microgel funcionalizadas. Según una publicación reciente, las construcciones basadas en varillas de microgel dan como resultado poros más grandes de varios cientos de micrómetros y, al mismo tiempo, conducen a una mayor estabilidad general del andamio en comparación con un modelo de base esférica. De esta manera, es posible producir construcciones de mayor volumen con más volumen libre al tiempo que se reduce la cantidad de material requerido. Los andamios macroporosos interconectados se pueden recoger y transportar sin daños ni desintegración. Los grupos amina y epoxi que no participan en la interconexión permanecen activos y pueden usarse de forma independiente para la modificación posterior. Este protocolo describe un método optimizado para la fabricación de varillas de microgel para formar andamios macroporosos interconectados que se pueden utilizar para experimentos celulares posteriores.

Introduction

Para estudiar el comportamiento celular cooperativo complejo en construcciones 3D, las plataformas de andamios deben mostrar un rendimiento consistente en reproducibilidad, tener una geometría adecuada para la migración celular y, al mismo tiempo, permitir cierta flexibilidad en términos de alteración de parámetros para investigar su influencia en el tejido vivo¹. En los últimos años, el concepto de partículas recocidas macroporosas (MAP), descrito por primera vez por Segura et al., se convirtió en una plataforma eficiente y versátil para la producción de andamios 3D². La composición personalizada de los microgeles, que son los bloques de construcción del andamio 3D final, predefine propiedades como la rigidez de la construcción, la reactividad química selectiva de la red de gel y el tamaño de poro final del andamio 2,3,4,5,6. Los péptidos adhesivos celulares como señales para las interacciones andamio-célula se incorporan a la red polimérica de los microgeles para permitir la unión celular y se pueden variar para investigar sus efectos específicos en las células en cultivo. Los andamios 3D se estabilizan mediante la interconexión de los microgeles inyectables recocidos debido a enlaces covalentes o supramoleculares, lo que resulta en construcciones robustas y definidas para el cultivo celular 2,3,5,7,8.

La microfluídica se ha establecido como uno de los métodos más precisos y adaptables para la preparación de hidrogeles granulares definidos⁹. La posibilidad de producir mayores cantidades de los bloques de construcción requeridos en un proceso continuo mientras se mantiene su monodispersidad química, mecánica y física contribuye sustancialmente a la idoneidad de este proceso. Además, el tamaño y la forma de los microgeles producidos pueden manipularse mediante diversos métodos, como emulsiones discontinuas, microfluídica, litografía, pulverización electrodinámica o fragmentación mecánica, que determinan la geometría de los bloques de construcción y, por lo tanto, la estructura 3D del andamio final ^1,10.

Recientemente, el concepto de andamios 3D macroporosos compuestos por varillas de microgel funcionalizadas que se entrelazan rápidamente en soluciones acuosas sin aditivos adicionales ha sido reportado¹¹. La anisotropía de las varillas de microgel resultó en mayores porosidades y distribuciones de poros con mayores tamaños de poro en comparación con el empleo de microgeles esféricos en este estudio¹¹. De esta manera, menos material crea poros más grandes con una variedad de geometrías de poros diferentes, manteniendo la estabilidad del andamio 3D. El sistema consiste en dos tipos de barras de microgel con grupos funcionales complementarios de amina primaria y epoxi que se consumen dentro de la reacción de interconexión cuando entran en contacto entre sí. Los grupos funcionales que no participan en el proceso de interconexión permanecen activos y pueden utilizarse para la post-modificación selectiva con péptidos adhesivos celulares u otros factores bioactivos. Las células de fibroblastos se adhieren, se propagan y proliferan cuando se cultivan dentro de los andamios 3D, creciendo primero en la superficie del microgel y llenando la mayoría de los macroporos después de 5 días. Un estudio preliminar de cocultivo de fibroblastos humanos y células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVECs) mostró resultados prometedores para la formación de estructuras similares a vasos dentro de los andamios 3D interconectados¹¹.

Protocol

1. Material y preparaciones necesarias para microfluídica

1. Para el procedimiento microfluídico descrito, use jeringas de vidrio y bombas de jeringa de 1 ml y 5 ml. La formación de gotitas en chip se observa a través de un microscopio invertido equipado con una cámara de alta velocidad.
2. Cree el diseño del chip microfluídico (Figura 1B) utilizando un software de diseño asistido por computadora y produzca una plantilla maestra como ya se informó¹².
3. Logre una irradiación UV controlada utilizando un LED UV autoconstruido (λ = 365 nm, diámetro de punto ~ 4.7 mm) que proporciona irradiancia a 957 mW / cm² a través de un vidrio de cubierta de 0.13 mm de espesor.
   NOTA: Tenga en cuenta la posible generación de calor local por el UV-LED durante la irradiación. Si este es el caso, asegúrese de una refrigeración suficiente por flujo de aire externo.

2. Producción de dispositivos microfluídicos

NOTA: La producción de dispositivos microfluídicos se basa en una publicación anterior¹³.

1. Prepare 20 g de una mezcla 10:1 (en masa) de polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado. Mezclar vigorosamente durante 3 min.
2. Mezclar 60 mg de Oil Red O en 2,0 g de tolueno. Añadir 50 μL de aceite rojo O en solución de tolueno a la mezcla de PDMS. Mezcle hasta que haya una distribución de color homogénea para disminuir la dispersión de luz no deseada y mantener el tamaño del punto enfocado durante la gelificación en chip.
3. Retire las burbujas colocando la mezcla en un desecador equipado con una bomba de vacío.
4. Coloque la mezcla PDMS en la plantilla maestra a una altura de 5-5,5 mm y desgasifique de nuevo.
5. Deje que el PDMS se cure durante 18 h a temperatura ambiente para evitar la degradación del colorante diazo.
6. Corte la estructura PDMS y perfore los orificios de entrada y salida en la estructura utilizando una herramienta de muestreo de núcleo de línea (0,77 mm de diámetro interior, 1,07 mm de diámetro exterior).
7. Lave el PDMS y cubra el vidrio con isopropanol y agua desionizada repetidamente 5 veces y, posteriormente, retire el líquido a través del flujo de aire o nitrógeno a presión después de cada paso de lavado.
8. Tratar el vidrio seco y el PDMS juntos en un horno de plasma a 0,2 mbar, con un flujo de oxígeno de 20 ml / min durante 60 s a 100 W, y conectar directamente para unir el vidrio y PDMS para formar el dispositivo microfluídico.
   NOTA: Evite doblar la estructura PDMS durante el proceso de unión para minimizar la deformación de la estructura del canal.
9. Para hacer que los canales del chip microfluídico sean hidrófobos, coloque el dispositivo junto con 50 μL de tricloro-(1 H,1 H,2 H,2 H-perfluoroctil)-silano en un desecador al vacío durante la noche (cierre la conexión a la bomba después de disminuir la presión de vapor). Enjuague el exterior del dispositivo con hidrofluoroéter.
   PRECAUCIÓN: Realice estos pasos en una campana extractora y evite cualquier contacto con el perfluorosilano. Use un desecador al vacío de vidrio sellado con grasa. Limpie bien el desecador antes de usarlo para otros fines.

3. Preparación de la solución para microfluídica

1. Para la fase continua de aceite, mezclar aceite de parafina y hexadecano (1:1 v/v) y añadir 8% (p/p) de un tensioactivo no iónico. Llene una jeringa de vidrio de 1 ml (primer aceite, figura 1) y una jeringa de vidrio de 5 ml (segundo aceite, figura 1).
2. Preparar las soluciones de prepolímero para la fase dispersa en viales de vidrio marrón para evitar la descomposición del fotoiniciador y la gelificación involuntaria.
   1. Solución de prepolímero de componentes de amina que contiene GRGDS-PC
      1. Para una solución de 300 μL, pesar 33,3 mg de estrella-polietilenglicol-acrilato (sPEG-AC) y 3,03 mg de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilofinato de litio (LAP).
      2. Disuelva 18,74 mg de clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo (AMA) en 1,5 ml de agua desionizada y pase la solución a través de un filtro de jeringa (tamaño de poro de 0,20 μm).
         NOTA: AMA es higroscópico y debe desecharse tan pronto como el sólido forme grumos en el recipiente de almacenamiento.
      3. Preparar alícuotas estériles de 36 mM GRGDS-PC en agua y conservar a -20 °C hasta su uso.
      4. Use 291.7 μL de la solución AMA para disolver sPEG-AC y LAP, y agregue 8.3 μL de la solución GRGDS-PC. Tome la solución con una jeringa de vidrio de 1 ml y protéjala de la luz con papel de aluminio.
   2. Solución de prepolímero de componentes epoxi
      1. Para una solución de 300 μL, pesar 33,3 mg de estrella-polietilenglicol-acrilato (sPEG-AC), 3,03 mg de LAP y disolver en 300 μL de agua desionizada. Añadir 2,4 mg de metacrilato de glicidil (GMA).
         NOTA: La agitación vigorosa acelera la disolución de GMA. Tome la solución con una jeringa de vidrio de 1 ml y protéjala de la luz con papel de aluminio.

4. Producción y purificación de varillas de microgel funcionalizadas con amina y epoxi

Figura 1: Disposición del conjunto de gelificación microfluídica en chip . (A) Vista frontal y vista en ángulo de la disposición de los componentes durante la microfluídica. (B) Diseño de chip microfluídico utilizado para la gelificación en chip de varillas de microgel. (1) Tubo de PE a la primera entrada de aceite. (2) Tubo de PE protegido contra la luz a la entrada de fase dispersa. (3) Tubo de PE a la segunda entrada de aceite. (4) Tubo de PE desde la salida hasta el contenedor de recogida del producto. (5) Lámpara UV y ubicación de irradiación en el canal recto de 80 μm cerca de la salida. (6) Objetivo/posición de observación del microscopio. (7) Componente PDMS coloreado del dispositivo microfluídico. (8) Cubrir el vidrio unido al PDMS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Inserte las agujas en los tubos de PE y retire el gas de la jeringa y del tubo.
2. Inserte un tubo de PE en la salida para la recogida del producto.
3. Coloque todas las jeringas de vidrio en las bombas de jeringa e inserte cada extremo del tubo en la entrada correspondiente (Figura 1).
   NOTA: Proteja el tubo de prepolímero de la luz a través de papel de aluminio o un tubo negro para evitar la gelificación involuntaria.
4. Enfoque el microscopio en la sección transversal aceite-agua.
5. Encienda la primera bomba de jeringa de aceite (caudal = 100-200 μL/h) para llenar primero el canal con aceite para evitar la humectación del canal por la fase dispersa.
6. Disminuir el primer caudal de aceite a 30 μL/h y poner en marcha la bomba de jeringa de prepolímero (caudal = 100-200 μL/h) hasta que se pueda observar la fase acuosa dispersa en la sección transversal.
7. Ajuste el caudal del prepolímero a 30 μL/h y enfoque el microscopio en la salida.
8. Arranque la segunda bomba de jeringa de aceite (caudal de 300 μL/h) y espere hasta que el régimen de flujo sea estable.
9. Coloque el tubo de salida en un recipiente de recolección.
   NOTA: Coloque el extremo del tubo en la parte superior del recipiente para evitar un aumento de presión debido a la acumulación del producto con el paso del tiempo.
10. Ajuste el sistema de irradiación UV de tal manera que la irradiancia esté en el rango de 900-1000 mW / cm 2 (irradiancia utilizada = 957 mW / cm²) y el punto de irradiación esté en la parte del canal recto antes de la salida (Figura 1B).
    NOTA: Asegúrese de no irradiar cerca de la sección transversal aceite-agua para evitar obstruir el canal. Para mayor protección, cubra las estructuras del canal antes del punto de irradiación en la parte superior de la unidad.
11. Antes de la irradiación UV, ajuste los caudales del prepolímero y del primer aceite para lograr la relación de aspecto deseada en el rango de 3.0 a 4.5, y establezca el tiempo de irradiación de la fase dispersa en ~ 2.3 s, dependiendo del tamaño del punto de irradiación.
12. Inicie la irradiación UV y, si es necesario, vuelva a ajustar los caudales de acuerdo con la subsección anterior.
    NOTA: Observe la producción al principio y supervise el comportamiento estable del flujo en la salida y la uniformidad de las varillas de microgel. El segundo flujo de aceite se puede ajustar para optimizar el transporte del producto dentro de la salida.
13. Cambie el contenedor de recolección y anote la hora de inicio de la recolección del producto y las tasas de flujo.
    NOTA: Proteja el producto del polvo. Deje de recolectar antes de que cualquier jeringa se quede sin solución.
14. Para finalizar la recolección, retire el contenedor de recolección y anote la hora. Detenga la irradiación y todas las bombas de jeringa.
15. Lave el producto posteriormente 5 veces cada una con n-hexano, isopropanol y agua desionizada. Retire el sobrenadante después de la sedimentación de la varilla.
    NOTA: Después de cada adición de solución, dispersar el producto cuidadosamente y esperar 10 minutos antes de reemplazar el solvente, considerando la difusión molecular. Reemplace el isopropanol gradualmente con agua para evitar que las varillas floten hacia la superficie del líquido. Múltiples pasos de lavado adicionales con agua disminuyen las trazas restantes de isopropanol.

5. Formación de andamios macroporosos

1. Determinar el número de varillas de microgel por volumen de dispersión para las muestras funcionalizadas con epoxi y amina.
2. Ajustar el número de muestras funcionalizadas con epoxi y amina por dilución o concentración a un valor similar entre 1.000-5.000 varillas/100 μL.
   NOTA: Utilice una centrífuga a ~2.000 x g durante 5-10 s para acelerar la sedimentación de las barras de microgel. Si el número de varillas por volumen de dispersión es bajo, la interconexión de varillas puede dar lugar a grupos de varillas más pequeños en lugar de una construcción estable. Si el número de varillas por volumen de dispersión es alto, la calidad de mezcla de los dos componentes se verá comprometida.
3. Transfiera la dispersión del primer componente (~1,200 varillas) a un vial transparente cónico de 1.5 ml o 2 ml.
4. Añadir el segundo componente de forma controlada en un funcionamiento continuo (pipeta de 100 μL). Después de la adición, mezclar el contenido directamente con la pipeta para tomar líquido y añadirlo de nuevo. La estructura interconectada se forma en cuestión de segundos durante la mezcla.
   NOTA: Si se forman varios grupos en lugar de una estructura coherente, vuelva a comprobar el número de varillas de microgel por volumen o proporcione una mezcla más controlada de los dos componentes.

6. Adhesivo celular post-modificación

1. Calcule el número teórico de grupos epoxi en la estructura interconectada en función del caudal de la fase de polímero disperso, el número de microgeles recogidos durante un tiempo específico y el factor de dilución de la dispersión de microgel utilizada para la formación de andamios.
   NOTA: Aproxime el número teórico de grupos epoxi por andamio mediante la siguiente ecuación.
   
   
   _nth: Cantidad teórica de sustancia
   c GMA: concentración de_GMA en solución de prepolímero
   P: Caudal de la solución de prepolímero
2. Agregue la solución GRGDS-PC a la estructura interconectada para modificar todos los grupos epoxi restantes con el péptido adhesivo celular que lleva una amina y tiol libres (n [grupos epoxi teóricos] / n [GRGDS-PC] = 1). Dejar a temperatura ambiente durante la noche.
3. Eliminar las moléculas no reaccionadas lavando con agua desionizada y eliminando el sobrenadante.

7. Esterilización y transferencia a medios de cultivo celular

1. Reduzca el nivel del agua para sumergir el andamio interconectado.
2. Abra el vial e irradie con luz UV de λ = 250-300 nm. Cierre el vial y transfiera el vial a un banco limpio. Lavar 1x con agua estéril.
3. Reemplace el agua del vial con medios de cultivo celular y permita el equilibrio durante 5 minutos. Repita esto con medios de cultivo celular frescos 2x.
4. Transfiera el andamio macroporoso a una placa de pozo de cultivo celular para el experimento vertiendo o usando una espátula.

  

Results

Figura 2: Estructura del andamio reticulado macroporoso. (A) Proyección 3D de una pila Z de microscopía confocal de 500 μm del andamio macroporoso interconectado. La barra de escala representa 500 μm. (B) Andamio interconectado compuesto por ~10,000 varillas de microgel en un vidrio de cubierta tomado directamente d...

Discussion

Uno de los pasos críticos en este protocolo es la calidad del metacrilato de 2-aminoetilo (AMA) utilizado como comonómero para la funcionalización de aminas primarias. El AMA debe ser un polvo de grano fino y preferiblemente incoloro entregado en un recipiente de vidrio marrón hermético al gas. Se debe evitar el uso de material verdoso y grumoso, ya que perjudica significativamente la reacción de gelificación y afecta negativamente la reproducibilidad de los resultados. En caso de mala gelificación y varillas de microgel...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABIL EM 90	Evonik	144243-53-8	tensioactivo no iónico
Clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo	TCI Chemicals	A3413	>98.0%(T)(HPLC)
8-Brazo PEG-acrilato 20 kDa	Biochempeg Scientific Inc.	A88009-20K	≥ 95 %
AutoCAD 2019	Autodesk		software de diseño asistido por ordenador (CAD); modelado de diseños microfluídicos
CHROMAFIL MV A-20/25 filtro de jeringa	CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG	XH49.1	tamaño de poro 0,20 y micro; m; Celulosa Ésteres mixtos (MV)
Cubreobjetos	Marienfeld-Superior		tipo n.º 1
EMS Herramienta de muestreo de núcleos de línea suiza 0,75 mm	Ciencias de		0,77 mm de diámetro interior, 1,07 mm de diámetro exterior
Etanol absoluto	VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M Cámara de alta velocidad de la serie 150 FPS	FLIR
Isómero de fluoresceinamina I	Sigma-Aldrich	201626
Isotiocianato de fluoresceína	Thermo Fisher Scientific	46424
25G x 5/8' ’ Agujas de 0,50 x 16 mm	BD Microlance 3
Metacrilato de glicidil	Sigma-Aldrich	779342	≥ 97.0% (GC)
GRGDS-PC	CPC Scientific	FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Jeringas herméticas al gas	Thermo Fisher Scientific	10772361/10500052	PFTE Luer-Lock
Hexano	Sigma-Aldrich	1,04,367
Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio	Sigma-Aldrich	900889	≥ 95 %
Microscopio trinocular Motic AE2000	Ted Pella, Inc.	22443-12
Novec 7100	Sigma-Aldrich	SHH0002
Aceite Rojo O	Sigma-Aldrich	O9755
Parafina	VWR Productos químicos	24679320
Plataforma Pavone Nanoindentador	Optics11Life
Solución salina tamponada con fosfato	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Polietileno Tubería 0.38 veces; 1,09 mm de grado médico	dropletex		ID 0,38 mm OD 1,09 mm
2-Propanol	Sigma-Aldrich		190764 reactivo ACS, ≥ 99.5%
Protein LoBind Tubos	Eppendorf	30108132
Bomba 11 Pico Plus Elite Bomba de jeringa programable	Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium	Gibco	11530586
SYLGARD 184 kit de elastómero de silicona	Dow SYLGARD	634165S
Tricloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctilo)-silano	Sigma-Aldrich	448931
Caja de esterilización LED UVC	UVLED Optical Technology Co., Ltd.	9S SZH8-S2